肝癌研究中当前关注的几个问题
作者：阮幼冰
单位：430030 武汉，同济医科大学超微病理研究室
关键词：
中华病理学杂志980201 百年来研究家们从不同角度，应用各种研究手段对原发性肝癌所进行的研究已取得可喜的成绩。然而迄今为止原发性肝癌、主要是肝细胞癌(HCC)，仍然是在世界范围内，特别是亚非地区威胁人类健康的大敌之一，而且其发病率在我国及全球范围内仍呈上升趋势，不容忽视。故当前早期发现、早期诊断和早期治疗依旧是肝癌的防治关键。
一、寻找肝细胞癌的最早可测的生物学标志
依据细胞学标准，在肝的癌变中发现亮细胞、嗜酸性细胞、中间细胞、嗜碱性细胞及混合细胞灶，这些细胞群虽具有明显的形态学标志，但并不是显示肿瘤性生长的特征。因此，从组织学水平可将其视为表型上有改变而尚不具备肿瘤特征的细胞群。然而这种细胞群较之周围肝实质细胞却具有更高的，发展为良性或恶性肝肿瘤的危险性。对这些肝细胞群的酶细胞化学研究证明：肝腺瘤主要由亮细胞或混合细胞组成。这类细胞胞浆内有大量糖原储存，细胞葡萄糖-6-磷酸酶和糖原磷酸化酶活性均降低，而葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性却明显增高。此类细胞进一步发展为嗜碱性细胞，胞浆内糖原消失。这些观察提示，糖原储存于肝细胞具有高的癌变倾向。
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实验研究结果与人类HCC的发生过程在许多方面是一致的。并特别注意到糖原在肝细胞中的堆积与HCC发生的关系。在许多肝细胞腺瘤、结节性肝细胞增生灶及肝细胞腺样增生灶内的肝细胞，均主要为富于糖原的亮细胞和毛玻璃样细胞。特别有意义的是，先天性肝糖原(主要为Ⅰ型糖原)储存性疾病患者，如能存活至青春期后，则通过CT、活组织检查及尸检多可发现肝肿瘤(腺瘤或癌)，从而表明先天性糖原代谢异常具有特别高的肝肿瘤发病的危险性，这在实验性或人体肝癌的研究中仍具有普遍性和重要意义。
二、肝癌发生中“反祖”现象的启示
任何细胞癌变的早期都会出现细胞分化能力的丧失，细胞形态及功能停留在幼稚细胞阶段，对人体及实验动物HCC细胞DNA含量倍体水平的分析也证实了这一点。正常大鼠肝脏4倍体(4C)肝细胞群体占69.6%，2C肝细胞群体为23.5%，这与人体肝细胞DNA倍体是一致的。但新生大鼠肝脏几乎全为2C肝细胞群。随鼠龄增长和肝脏发育，以4C为主的多倍体肝细胞迅速增多，并最后取代2C肝细胞群而形成成年大鼠肝脏的主要细胞群体。在诱癌过程中，无论致癌剂的种类或诱癌方式有何不同，均遵循如下规律：早期出现并呈持续性2C肝细胞群体的“反祖”性增生，随病变发展，2C肝细胞群体增生加重，并最终取代4C肝细胞群，而成优势群体。肝癌形成后癌细胞则以非整倍体细胞群占主导地位。实验研究的结果与人体肝癌发展十分近似。对人体肝癌DNA含量的研究表明，当肿瘤直径<3cm时，细胞主要为二倍体，当其直径>3cm时，DNA含量则以异倍体为主。因此认为，这段时间可能是肝细胞生物学特性发生明显改变的重要时期。人和动物实验也证实，肝细胞DNA含量2C增殖是肝癌前病变的一个重要生物学标志。但动物肝内2C的增殖出现于诱癌早期阶段，比人体所测2C细胞的出现为早，这可能是由于对人体肝癌变早期难以进行DNA普查的缘故。。
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肝癌患者血清中多有甲胎蛋白(AFP)的异常出现，这一“反祖”现象被用作检测肝癌的指标之一。
三、癌基因表达与肝癌发生
随着科学技术的发展，肝癌的研究已由组织、细胞水平发展到分子水平，由细胞病理学进入分子病理学领域。大量研究表明，HCC发生过程中，有多种癌基因的异常表达，并可能涉及肝细胞中多达10余种DNA序列的分子或基因改变。深入了解HCC发生过程中各种癌基因改变状况和出现规律及其相互联系，对阐明HCC发生机制是十分必要的。
研究表明，c-myc、N-ras、H-ras等癌基因在HCC发生的早期阶段已有异常表达，其协同作用是HCC启动的重要分子事件，其中H-ras的异常表现出现较晚，而在肝癌形成的促进阶段起重要作用。肝癌病变进一步发展，N-ras表达转阴，此时细胞形态已具恶性转化特征，因此认为，N-ras表达消退的现象，可视为判断细胞恶性转化或癌前病变的指标[1]。
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野生型p53基因是一种隐性肿瘤抑制基因，它的失活是大多数人类肿瘤中最常见的遗传学改变。野生型p53缺失或突变可大大增强对肿瘤的易感性。原发性HCC细胞中p53基因突变已为多位学者的工作所证实[2]，但所报道的突变率从10%～60%不等，这可能与所用检测方法的敏感性不同有关。聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)法检测基因突变的灵敏度和准确性均较高，对基因突变的检出率可高达90%以上。
MDM2也被证实与人体HCC的发生有密切关系，是致瘤性很强的基因，其低水平的表达也表明细胞成瘤性增强。p53基因与MDM2间存在一定关系。p53基因的缺失或突变可引起p53蛋白功能丧失，也可通过与多种其他蛋白包括MDM2蛋白相结合而使其失去抑癌功能。MDM2过度表达还可使恶性肿瘤细胞逃脱p53对细胞生长的控制作用，此时即便无p53突变和功能丧失，也是如此[3]。
肝的癌变过程是多基因协同作用的结果，是各种癌基因乃至包括多种细胞因子在内的一种网络调节的复杂过程。深入掌握各基因在HCC发生中的确切作用，理顺复杂网络调节因子间的相互作用关系，抓准关键所在，对未来开展肝癌的基因治疗将会有重要意义。
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四、肝癌转移的分子学基础
转移是恶性肿瘤最重要的生物学行为。资料表明，80%以上恶性肿瘤患者的死因为肿瘤转移。
nm23是一种抑制肿瘤转移的基因，它的表达与肿瘤的转移潜能及预后有关。在未转移肝癌中，nm23阳性表达率明显高于已有转移者，提示nm23表达降低能促进肝癌细胞的转移[4]。
肝癌细胞的转移潜能还与钙离子依赖性粘附分子功能丧失有关。肝细胞粘附分子(L-CAM)介导的癌细胞间连接的减少，是肝癌细胞转移的前提。
细胞间粘附分子-1(ICAM-1)基因在人肝癌细胞中的过度表达是肝癌转移过程中的又一重要分子水平改变，ICAM-1作为宿主T淋巴细胞膜上的整合蛋白淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)的配体，参与白细胞粘附过程。肝癌细胞通过ICAM-1与淋巴细胞接触，不但可减少癌细胞间的同种粘附作用，还可增加肝癌细胞与肿瘤浸润淋巴细胞的粘附，使癌细胞得以由原发灶向远处扩散。
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肝癌转移涉及的范围较广，重要的是，如何力求将癌细胞阻遏在转移的萌发阶段。
五、展望
肿瘤研究的根本目的在于防治，其关键则在于阐明肝癌的发病机制，从而寻找和捕捉高度敏感的肝癌特异性标志物，建立最早而又可靠的诊断肝癌的方法。为早期治疗提供前提乃当务之急。
就研究途径而言，经典及现代形态学方法与分子水平的方法相结合，以及实验与临床相结合乃必由之路。目前可供参考的方法如应用逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)及Southern印迹法测定循环血中的肝细胞特异白蛋白及AFP mRNA PCR产物来判断循环血中有无HCC细胞存在，并预示是否已形成肝癌转移，不失为一个较好的方法[5]。
又如，基于恶性疾病相关性DNA结合蛋白2(MAD2)在HCC患者血浆中的平均浓度显著高于正常及慢性肝病患者，因而提示HCC患者血浆MAD2含量的检测对临床可能具一定意义[6]。
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此外，用新的凝集素亲和电泳及抗体亲和印迹法对HCC患者与良性肝病患者血中岩藻糖基化AFP作比较检测的结果发现，HCC患者AFP岩藻糖基化指数(lucosylation index)显著高于良性肝病患者(P<0.0001)，因而岩藻糖基化AFP的测定亦可用于两者的鉴别诊断及肝癌的早期诊断[7]等等。
总之，原发性肝癌的极早期发现和诊断，仍是当前和今后一段时间内困扰其防治的关键问题，人们期待着肝癌病理研究为解决这一问题作出贡献。
参考文献
1 郑杰，武忠弼，阮幼冰.二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌变过程中三种基因的原位表达.中华病理学杂志，1995，24：309-311.
2 Bardeesy N, Beckwith B, Pelletier J. Clonal expansion and attenuated apoptosis in wilms′ tumoers are associated with p53 gene mutations. Cancer Res, 1995, 55：215-219.
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3 Haines DS, Landers JE, Engle LT. Physical and functional interaction between wild-type p53 and mdm 2 proteins. Mol Cell Biol, 1994, 14：1171-1178.
4 黄蓓，武忠弼，阮幼冰.人肝癌nm23的表达及其与转移的关系.临床与实验病理学杂志，1997，13：25-26.
5 Wong IH-N, Leung T, Ho S, et al. Semiquantification of circulating hepatocellular carcinoma cells by reverse transcriptase polymerase chain reaction. Br J Cancer, 1997, 76：628-633.
6 赵景民，翟为溶，张月娥，等.肝细胞癌整合蛋白α5β1纤维连接蛋白及其降解片段的表达.中华病理学杂志，1997，26：65-69.
7 Zaninotto M, Ujka F, Lachin M, et al. Lectin-affinity electrophoresis for the detection of AFP microheterogeneities in patients with hepatocellular carcinoma. Anticancer Res, 1996, 16：305-30.
(收稿：1997-12-22), http://www.100md.com
单位：430030 武汉，同济医科大学超微病理研究室
关键词：
中华病理学杂志980201 百年来研究家们从不同角度，应用各种研究手段对原发性肝癌所进行的研究已取得可喜的成绩。然而迄今为止原发性肝癌、主要是肝细胞癌(HCC)，仍然是在世界范围内，特别是亚非地区威胁人类健康的大敌之一，而且其发病率在我国及全球范围内仍呈上升趋势，不容忽视。故当前早期发现、早期诊断和早期治疗依旧是肝癌的防治关键。
一、寻找肝细胞癌的最早可测的生物学标志
依据细胞学标准，在肝的癌变中发现亮细胞、嗜酸性细胞、中间细胞、嗜碱性细胞及混合细胞灶，这些细胞群虽具有明显的形态学标志，但并不是显示肿瘤性生长的特征。因此，从组织学水平可将其视为表型上有改变而尚不具备肿瘤特征的细胞群。然而这种细胞群较之周围肝实质细胞却具有更高的，发展为良性或恶性肝肿瘤的危险性。对这些肝细胞群的酶细胞化学研究证明：肝腺瘤主要由亮细胞或混合细胞组成。这类细胞胞浆内有大量糖原储存，细胞葡萄糖-6-磷酸酶和糖原磷酸化酶活性均降低，而葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性却明显增高。此类细胞进一步发展为嗜碱性细胞，胞浆内糖原消失。这些观察提示，糖原储存于肝细胞具有高的癌变倾向。
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实验研究结果与人类HCC的发生过程在许多方面是一致的。并特别注意到糖原在肝细胞中的堆积与HCC发生的关系。在许多肝细胞腺瘤、结节性肝细胞增生灶及肝细胞腺样增生灶内的肝细胞，均主要为富于糖原的亮细胞和毛玻璃样细胞。特别有意义的是，先天性肝糖原(主要为Ⅰ型糖原)储存性疾病患者，如能存活至青春期后，则通过CT、活组织检查及尸检多可发现肝肿瘤(腺瘤或癌)，从而表明先天性糖原代谢异常具有特别高的肝肿瘤发病的危险性，这在实验性或人体肝癌的研究中仍具有普遍性和重要意义。
二、肝癌发生中“反祖”现象的启示
任何细胞癌变的早期都会出现细胞分化能力的丧失，细胞形态及功能停留在幼稚细胞阶段，对人体及实验动物HCC细胞DNA含量倍体水平的分析也证实了这一点。正常大鼠肝脏4倍体(4C)肝细胞群体占69.6%，2C肝细胞群体为23.5%，这与人体肝细胞DNA倍体是一致的。但新生大鼠肝脏几乎全为2C肝细胞群。随鼠龄增长和肝脏发育，以4C为主的多倍体肝细胞迅速增多，并最后取代2C肝细胞群而形成成年大鼠肝脏的主要细胞群体。在诱癌过程中，无论致癌剂的种类或诱癌方式有何不同，均遵循如下规律：早期出现并呈持续性2C肝细胞群体的“反祖”性增生，随病变发展，2C肝细胞群体增生加重，并最终取代4C肝细胞群，而成优势群体。肝癌形成后癌细胞则以非整倍体细胞群占主导地位。实验研究的结果与人体肝癌发展十分近似。对人体肝癌DNA含量的研究表明，当肿瘤直径<3cm时，细胞主要为二倍体，当其直径>3cm时，DNA含量则以异倍体为主。因此认为，这段时间可能是肝细胞生物学特性发生明显改变的重要时期。人和动物实验也证实，肝细胞DNA含量2C增殖是肝癌前病变的一个重要生物学标志。但动物肝内2C的增殖出现于诱癌早期阶段，比人体所测2C细胞的出现为早，这可能是由于对人体肝癌变早期难以进行DNA普查的缘故。。
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肝癌患者血清中多有甲胎蛋白(AFP)的异常出现，这一“反祖”现象被用作检测肝癌的指标之一。
三、癌基因表达与肝癌发生
随着科学技术的发展，肝癌的研究已由组织、细胞水平发展到分子水平，由细胞病理学进入分子病理学领域。大量研究表明，HCC发生过程中，有多种癌基因的异常表达，并可能涉及肝细胞中多达10余种DNA序列的分子或基因改变。深入了解HCC发生过程中各种癌基因改变状况和出现规律及其相互联系，对阐明HCC发生机制是十分必要的。
研究表明，c-myc、N-ras、H-ras等癌基因在HCC发生的早期阶段已有异常表达，其协同作用是HCC启动的重要分子事件，其中H-ras的异常表现出现较晚，而在肝癌形成的促进阶段起重要作用。肝癌病变进一步发展，N-ras表达转阴，此时细胞形态已具恶性转化特征，因此认为，N-ras表达消退的现象，可视为判断细胞恶性转化或癌前病变的指标[1]。
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野生型p53基因是一种隐性肿瘤抑制基因，它的失活是大多数人类肿瘤中最常见的遗传学改变。野生型p53缺失或突变可大大增强对肿瘤的易感性。原发性HCC细胞中p53基因突变已为多位学者的工作所证实[2]，但所报道的突变率从10%～60%不等，这可能与所用检测方法的敏感性不同有关。聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)法检测基因突变的灵敏度和准确性均较高，对基因突变的检出率可高达90%以上。
MDM2也被证实与人体HCC的发生有密切关系，是致瘤性很强的基因，其低水平的表达也表明细胞成瘤性增强。p53基因与MDM2间存在一定关系。p53基因的缺失或突变可引起p53蛋白功能丧失，也可通过与多种其他蛋白包括MDM2蛋白相结合而使其失去抑癌功能。MDM2过度表达还可使恶性肿瘤细胞逃脱p53对细胞生长的控制作用，此时即便无p53突变和功能丧失，也是如此[3]。
肝的癌变过程是多基因协同作用的结果，是各种癌基因乃至包括多种细胞因子在内的一种网络调节的复杂过程。深入掌握各基因在HCC发生中的确切作用，理顺复杂网络调节因子间的相互作用关系，抓准关键所在，对未来开展肝癌的基因治疗将会有重要意义。
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四、肝癌转移的分子学基础
转移是恶性肿瘤最重要的生物学行为。资料表明，80%以上恶性肿瘤患者的死因为肿瘤转移。
nm23是一种抑制肿瘤转移的基因，它的表达与肿瘤的转移潜能及预后有关。在未转移肝癌中，nm23阳性表达率明显高于已有转移者，提示nm23表达降低能促进肝癌细胞的转移[4]。
肝癌细胞的转移潜能还与钙离子依赖性粘附分子功能丧失有关。肝细胞粘附分子(L-CAM)介导的癌细胞间连接的减少，是肝癌细胞转移的前提。
细胞间粘附分子-1(ICAM-1)基因在人肝癌细胞中的过度表达是肝癌转移过程中的又一重要分子水平改变，ICAM-1作为宿主T淋巴细胞膜上的整合蛋白淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)的配体，参与白细胞粘附过程。肝癌细胞通过ICAM-1与淋巴细胞接触，不但可减少癌细胞间的同种粘附作用，还可增加肝癌细胞与肿瘤浸润淋巴细胞的粘附，使癌细胞得以由原发灶向远处扩散。
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肝癌转移涉及的范围较广，重要的是，如何力求将癌细胞阻遏在转移的萌发阶段。
五、展望
肿瘤研究的根本目的在于防治，其关键则在于阐明肝癌的发病机制，从而寻找和捕捉高度敏感的肝癌特异性标志物，建立最早而又可靠的诊断肝癌的方法。为早期治疗提供前提乃当务之急。
就研究途径而言，经典及现代形态学方法与分子水平的方法相结合，以及实验与临床相结合乃必由之路。目前可供参考的方法如应用逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)及Southern印迹法测定循环血中的肝细胞特异白蛋白及AFP mRNA PCR产物来判断循环血中有无HCC细胞存在，并预示是否已形成肝癌转移，不失为一个较好的方法[5]。
又如，基于恶性疾病相关性DNA结合蛋白2(MAD2)在HCC患者血浆中的平均浓度显著高于正常及慢性肝病患者，因而提示HCC患者血浆MAD2含量的检测对临床可能具一定意义[6]。
, http://www.100md.com
此外，用新的凝集素亲和电泳及抗体亲和印迹法对HCC患者与良性肝病患者血中岩藻糖基化AFP作比较检测的结果发现，HCC患者AFP岩藻糖基化指数(lucosylation index)显著高于良性肝病患者(P<0.0001)，因而岩藻糖基化AFP的测定亦可用于两者的鉴别诊断及肝癌的早期诊断[7]等等。
总之，原发性肝癌的极早期发现和诊断，仍是当前和今后一段时间内困扰其防治的关键问题，人们期待着肝癌病理研究为解决这一问题作出贡献。
参考文献
1 郑杰，武忠弼，阮幼冰.二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌变过程中三种基因的原位表达.中华病理学杂志，1995，24：309-311.
2 Bardeesy N, Beckwith B, Pelletier J. Clonal expansion and attenuated apoptosis in wilms′ tumoers are associated with p53 gene mutations. Cancer Res, 1995, 55：215-219.
, http://www.100md.com
3 Haines DS, Landers JE, Engle LT. Physical and functional interaction between wild-type p53 and mdm 2 proteins. Mol Cell Biol, 1994, 14：1171-1178.
4 黄蓓，武忠弼，阮幼冰.人肝癌nm23的表达及其与转移的关系.临床与实验病理学杂志，1997，13：25-26.
5 Wong IH-N, Leung T, Ho S, et al. Semiquantification of circulating hepatocellular carcinoma cells by reverse transcriptase polymerase chain reaction. Br J Cancer, 1997, 76：628-633.
6 赵景民，翟为溶，张月娥，等.肝细胞癌整合蛋白α5β1纤维连接蛋白及其降解片段的表达.中华病理学杂志，1997，26：65-69.
7 Zaninotto M, Ujka F, Lachin M, et al. Lectin-affinity electrophoresis for the detection of AFP microheterogeneities in patients with hepatocellular carcinoma. Anticancer Res, 1996, 16：305-30.
(收稿：1997-12-22), http://www.100md.com