DMBA-TPA-MNNG诱发小鼠皮肤肿瘤中p53基因突变
作者：张世羽 郭栩 Andres Klein-Szanto
单位：
关键词：皮肤肿瘤；小鼠基因；p53；突变
New Page 1 【摘要】 目的 探讨p53基因与化学致癌剂诱发小鼠皮肤肿瘤的关系。方法 运用PCR-SSCP和直接DNA测序法，检测37例DMBA-TPA-MNNG诱发的小鼠皮肤肿瘤[包括6例乳头状瘤，15例高分化鳞状细胞癌(SCCI)和16例中分化鳞状细胞癌(SCCⅡ)]中，p53基因第5～8外显子的序列改变。结果 乳头状瘤均未见p53基因突变，而25.8%(8/31例)SCC测得突变，其中SCCⅠ和SCCⅡ突变率分别为26.6%(4/15例)和25%(4/16例)。在这8例肿瘤中共有9个突变，其中7个位于第8外显子，有7个为G→A转换。结论 p53基因突变发生于该三步化学致癌法诱发的小鼠皮肤乳头状瘤向SCC恶性转化过程中。
, 百拇医药
p53 gene mutations in mouse skin tumors induced by DMBA-TPA-MNNG Zhang Shiyu*, Guo xu, Andres Klein-Szanto. * Department of Pathology, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between p53 gene mutations and mouse skin tumors induced by three-step carcinogenesis.Methods The exons 5-8 of p53 gene were examined in 37 DMBA-TPA-MNNG induced mouse skin tumors [including 6 mice with papillomas, 15 mice having well differentiated squamous cell carcinomas (SCCI) and 16 mice with intermediately differentiated squamous cell carcinomas (SCCⅡ)]. Results No p53 gene mutation was detected in the papilloma group, whereas 25.8%(8/31) of the SCC group had p53 gene mutations (4/15 of the SCCⅠ mice and 4/16 of the SCCⅡ mice). A total of 9 mutations were found in 8 mice with SCC, of which 7 were located in exon 8 and 7 were G→A transitions.Conclusion The p53 gene mutations occurred during the process of malignant transformation from papilloma to SCC induced by three step carcinogenesis.
, 百拇医药
【Key words】 Skin neoplasms Mice Genes, p53 Mutation
肿瘤抑制基因p53对细胞周期、受损DNA的修复以及某些基因的转录等具有调控作用。p53基因异常可使细胞的增生和分化失调导致肿瘤发生，p53基因突变是迄今发现的在肿瘤中最常见的基因异常[1～3]。化学致癌剂诱发小鼠皮肤肿瘤模型，对于研究肿瘤发生发展中基因的变化及其作用具有重要价值。我们运用PCR-SSCP和直接DNA测序，检测37例由该三步化学致癌法诱发的小鼠皮肤肿瘤中p53基因突变的频率和类型，以了解p53基因在该类型肿瘤发生中的变化和作用。
材料和方法
1.诱发小鼠皮肤肿瘤：将20 nmol/L 7，12二甲基苯并蒽(DMBA)涂于近交系Sencar小鼠背部皮肤一次，然后每周用2 μg 12-0-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(TPA)涂两次连续10周，再用120 μg N-甲基N′-硝基N-亚硝基胍(MNNG)每周一次涂于小鼠同一部位持续40周。本研究共用37例小鼠皮肤肿瘤，每例肿瘤部分用于常规组织切片，进行组织学分型[4]：其中乳头状瘤6例，高分化鳞状细胞癌(SCCⅠ)15例，中分化鳞状细胞癌(SCCⅡ)16例；其余部分用于提取DNA。
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2.聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析：采用蛋白酶K消化，酚-氯仿抽提法提取高分子量DNA。PCR-SSCP检测p53基因第5～8外显子，所用引物序列及具体步骤详见文献[5]。
3.直接DNA序列分析：凡经两次PCR-SSCP证实有异常电泳带的标本，再用PCR扩增，进行直接DNA序列测定，所用引物序列及具体步骤详见文献[5]。
结果
我们运用PCR-SSCP检测了37例DMBA-TPA-MNNG诱发的小鼠皮肤肿瘤中p53基因第5～8外显子。有8例肿瘤出现9个异常电泳带(例31有2个异常带)，并且全部由直接DNA测序证实含有p53基因突变(图1，2)。突变均发生于SSC，6例乳头状瘤中没有1例发生突变。突变占SCC 25.8%(8/31例)，其中发生于SCCⅠ和SCCⅡ者分别为26.6%(4/15例)和25.0%(4/16例)，两者间差异无显著性(卡方检验P>0.05)。
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A：显示第5外显子，肿瘤例22电泳异常，B：显示第8外显子，肿瘤例12电泳异常，N：正常DNA对照
图1 小鼠皮肤肿瘤p53基因PCR-SSCP分析.
A：肿瘤例22在第143密码子发生突变(TGG→TGA)，B：肿瘤例12在第276密码子发生突变(GGG→GAG)
图2 小鼠皮肤肿瘤p53基因直接DNA序列分析
从这9个突变发生的部位来看，7个在第8外显子，1个在第5外显子，1个在第7内含子第一碱基，即剪接点。从突变发生的性质来看，有8个发生于碱基G，其中7个由G→A转换，1个由G→T颠换，另一突变发生于碱基C，由C→T转换。突变发生于外显子者都使密码子发生改变即误议突变，使编码氨基酸发生改变(附表)，其中1例突变成为终止密码子，使转录提前终止。发生于内含子剪接点者可导致RNA加工修饰异常。
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附表 DMBA-TPA-MNNG诱发小鼠皮肤肿瘤中
p53基因突变的情况
编号
级别
外显子
密码子
核苷酸改变
氨基酸改变
8
SCCⅡ
8
263
GGA→AGA
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Gly→Arg
12
SCCⅠ
8
276
GGG→GAG
Gly→Glu
16
SCCⅠ
8
283
GAA→AAA
Glu→Phe
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17
SCCⅠ
8
276
GGG→GAG
Gly→Glu
22
SCCⅡ
5
143
TGG→TGA
Try→Stop
28
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SCCⅡ
8
293
TGC→TTC
Cys→Phe
31
SCCⅠ
8
275
CCT→TCT
Pro→Ser
第7内含子
GTA→ATA
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第1碱基
36
SCCⅡ
3
269
GTT→ATT
Val→Ile
注：SCCⅠ：高分化鳞状细胞癌 SCCⅡ：中分化鳞状细胞癌
讨论
因为p53基因第5～8外显子是其高度保守区，并且绝大多数人类和动物肿瘤的p53基因突变发生于该区，所以我们采用PCR-SSCP和直接DNA测序法对DMBA-TPA-MNNG诱发的37例小鼠皮肤肿瘤中p53基因第5～8外显子进行了检测。
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有实验表明由DMBA或DMBA-TPA诱发的小鼠皮肤肿瘤中，p53基因异常主要发生于分化程度低的SCC，而在乳头状瘤和分化好的早期SCC则无或偶有发生，因而认为p53异常在该系统肿瘤的发生发展过程中是晚发事件[6]。本实验中，6例乳头状瘤无1例发现有p53基因突变，而SCC有25.8%(8/31例)发生突变，并且在SCCⅠ和SCCⅡ中的突变率差异无显著性，提示在由DMBA-TPA-MNNG诱发的小鼠皮肤肿瘤中，p53基因突变发生于乳头状瘤向SCC的恶性转化过程中。
在本组有p53基因突变的8例SCC中，7例发生于第8外显子，仅1例在第5外显子。我们曾对DMBA和苯并芘诱发的小鼠皮肤原发癌和转移癌配对分析其p53基因状态，发现原发癌突变在第8外显子者，易于发生局部淋巴结转移，并在转移癌中保持同一突变；而突变发生于其他外显子者则无这一趋势，提示不同类型p53基因突变可使肿瘤细胞具有不同的转移潜能和不同的器官亲和性[5]。
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分子流行病学证据表明对癌基因或肿瘤抑制基因突变性质分析，有助于阐明或提示致癌物的作用及作用机制。例如在人肺癌中RAS和p53基因发生的突变大多为G→T颠换，一般认为与吸烟及大气污染有关。我们曾对由烟草及烟雾中重要的致癌物质苯并芘诱发的小鼠皮肤癌中p53基因进行检测，发现其突变主要是G→T颠换，而由DMBA或DMBA-TPA诱发的小鼠皮肤癌则很少有这种突变。因而提示人类肺癌与苯并芘作用于p53基因密切相关[7]。本研究的9个突变中，有7个是由G→A转换。有资料显示亚硝基化合物包括MNNG引起的突变主要是G→A转换，这是因他们能引起鸟嘌呤O6-甲基化而导致碱基错配所至[8]。亚硝基化合物诱发的小鼠皮肤肿瘤中RAS基因突变以及大鼠肾和食道肿瘤中p53基因突变主要是G→A转移[3，9]，而DMBA或DMBA-TPA诱发的小鼠皮肤，肺和乳腺肿瘤中的RAS基因突变主要是T→A颠换，但p53基因并无某一类型的碱基突变优势[3，7]。因此，本实验结果提示由DMBA-TPA-MNNG诱发的小鼠皮肤肿瘤中，p53基因突变主要是由MNNG造成的。
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综上所述，DMBA-TPA-MNNG诱发的小鼠皮肤肿瘤中，p53基因突变发生于乳头状瘤向SCC的恶性转化过程中，即在形成SCC过程中发挥重要作用，并且这些突变主要由MNNG造成，主要位于p53基因第8外显子，其类型主要是G→A转换。
参考文献
1Barrett JC，Anderson M. Molecular mechainsms of carcinogenesis in human and rodents. Mol Carcinog, 1993,7：1-13.
2Straus BS. The origin of point mutations in human cells. Cancer Res, 1992,52：249-253.
3Harris CC. Chemical and physical carcinogenesis: advances and perspectives for the 1990s. Cancer Res, 1991,51：5023s-5044s.
, 百拇医药
4Conti CJ, Slaga TG, Klein-Szanto AJP，eds. Carcinogenesis——A Comprehensive Survey, Vol. 11. Skin Tumors: Experimental and Clinical Aspects. New York: Reven, 1989.1-53.
5Zhang SY, Bauer B, Mitsunaga SI, et al. Lack of concordant p53 mutations in paired primary and metastatic mouse squamous cell carcinomas induced by chemical carcinogenesis. Mol Carcinog, 1995,12：77-81.
6Ruggeri B, Caamano J, Goodrow T, et al. Alterations of p53 tumor suppressor gene during mouse skin tumor progression. Cancer Res, 1991,51：6615-6621.
, http://www.100md.com
7Ruggeri B, Dirado M, Zhang SY, et al. Benzo(a)pyrene-induced murine skin tumors exhibit frequent and characteristic G to T mutations in the p53 gene. Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90：1013-1017.
8Yang JL, Hsieh FP, Lee PC, et al. Strand and sequence-specific attenuation of N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine-induced G:C to A:T transitions in by expression of human 6-methyguanine-DNA methyltransferase in chinese hamster ovary cells. Cancer Res, 1994,54：3857-3863.
9Ohgaki H, Hard GC, Hirota N, et al. Selective mutation of codons 204 and 213 of the p53 gene in rat tumors induced by alkylating N-nitroso compounds. Cancer Res, 1992：2995-2998.
(收稿：1997-06-09 修回：1998-03-25), 百拇医药
单位：
关键词：皮肤肿瘤；小鼠基因；p53；突变
New Page 1 【摘要】 目的 探讨p53基因与化学致癌剂诱发小鼠皮肤肿瘤的关系。方法 运用PCR-SSCP和直接DNA测序法，检测37例DMBA-TPA-MNNG诱发的小鼠皮肤肿瘤[包括6例乳头状瘤，15例高分化鳞状细胞癌(SCCI)和16例中分化鳞状细胞癌(SCCⅡ)]中，p53基因第5～8外显子的序列改变。结果 乳头状瘤均未见p53基因突变，而25.8%(8/31例)SCC测得突变，其中SCCⅠ和SCCⅡ突变率分别为26.6%(4/15例)和25%(4/16例)。在这8例肿瘤中共有9个突变，其中7个位于第8外显子，有7个为G→A转换。结论 p53基因突变发生于该三步化学致癌法诱发的小鼠皮肤乳头状瘤向SCC恶性转化过程中。
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p53 gene mutations in mouse skin tumors induced by DMBA-TPA-MNNG Zhang Shiyu*, Guo xu, Andres Klein-Szanto. * Department of Pathology, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between p53 gene mutations and mouse skin tumors induced by three-step carcinogenesis.Methods The exons 5-8 of p53 gene were examined in 37 DMBA-TPA-MNNG induced mouse skin tumors [including 6 mice with papillomas, 15 mice having well differentiated squamous cell carcinomas (SCCI) and 16 mice with intermediately differentiated squamous cell carcinomas (SCCⅡ)]. Results No p53 gene mutation was detected in the papilloma group, whereas 25.8%(8/31) of the SCC group had p53 gene mutations (4/15 of the SCCⅠ mice and 4/16 of the SCCⅡ mice). A total of 9 mutations were found in 8 mice with SCC, of which 7 were located in exon 8 and 7 were G→A transitions.Conclusion The p53 gene mutations occurred during the process of malignant transformation from papilloma to SCC induced by three step carcinogenesis.
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【Key words】 Skin neoplasms Mice Genes, p53 Mutation
肿瘤抑制基因p53对细胞周期、受损DNA的修复以及某些基因的转录等具有调控作用。p53基因异常可使细胞的增生和分化失调导致肿瘤发生，p53基因突变是迄今发现的在肿瘤中最常见的基因异常[1～3]。化学致癌剂诱发小鼠皮肤肿瘤模型，对于研究肿瘤发生发展中基因的变化及其作用具有重要价值。我们运用PCR-SSCP和直接DNA测序，检测37例由该三步化学致癌法诱发的小鼠皮肤肿瘤中p53基因突变的频率和类型，以了解p53基因在该类型肿瘤发生中的变化和作用。
材料和方法
1.诱发小鼠皮肤肿瘤：将20 nmol/L 7，12二甲基苯并蒽(DMBA)涂于近交系Sencar小鼠背部皮肤一次，然后每周用2 μg 12-0-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(TPA)涂两次连续10周，再用120 μg N-甲基N′-硝基N-亚硝基胍(MNNG)每周一次涂于小鼠同一部位持续40周。本研究共用37例小鼠皮肤肿瘤，每例肿瘤部分用于常规组织切片，进行组织学分型[4]：其中乳头状瘤6例，高分化鳞状细胞癌(SCCⅠ)15例，中分化鳞状细胞癌(SCCⅡ)16例；其余部分用于提取DNA。
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2.聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析：采用蛋白酶K消化，酚-氯仿抽提法提取高分子量DNA。PCR-SSCP检测p53基因第5～8外显子，所用引物序列及具体步骤详见文献[5]。
3.直接DNA序列分析：凡经两次PCR-SSCP证实有异常电泳带的标本，再用PCR扩增，进行直接DNA序列测定，所用引物序列及具体步骤详见文献[5]。
结果
我们运用PCR-SSCP检测了37例DMBA-TPA-MNNG诱发的小鼠皮肤肿瘤中p53基因第5～8外显子。有8例肿瘤出现9个异常电泳带(例31有2个异常带)，并且全部由直接DNA测序证实含有p53基因突变(图1，2)。突变均发生于SSC，6例乳头状瘤中没有1例发生突变。突变占SCC 25.8%(8/31例)，其中发生于SCCⅠ和SCCⅡ者分别为26.6%(4/15例)和25.0%(4/16例)，两者间差异无显著性(卡方检验P>0.05)。
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A：显示第5外显子，肿瘤例22电泳异常，B：显示第8外显子，肿瘤例12电泳异常，N：正常DNA对照
图1 小鼠皮肤肿瘤p53基因PCR-SSCP分析.
A：肿瘤例22在第143密码子发生突变(TGG→TGA)，B：肿瘤例12在第276密码子发生突变(GGG→GAG)
图2 小鼠皮肤肿瘤p53基因直接DNA序列分析
从这9个突变发生的部位来看，7个在第8外显子，1个在第5外显子，1个在第7内含子第一碱基，即剪接点。从突变发生的性质来看，有8个发生于碱基G，其中7个由G→A转换，1个由G→T颠换，另一突变发生于碱基C，由C→T转换。突变发生于外显子者都使密码子发生改变即误议突变，使编码氨基酸发生改变(附表)，其中1例突变成为终止密码子，使转录提前终止。发生于内含子剪接点者可导致RNA加工修饰异常。
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附表 DMBA-TPA-MNNG诱发小鼠皮肤肿瘤中
p53基因突变的情况
编号
级别
外显子
密码子
核苷酸改变
氨基酸改变
8
SCCⅡ
8
263
GGA→AGA
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Gly→Arg
12
SCCⅠ
8
276
GGG→GAG
Gly→Glu
16
SCCⅠ
8
283
GAA→AAA
Glu→Phe
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17
SCCⅠ
8
276
GGG→GAG
Gly→Glu
22
SCCⅡ
5
143
TGG→TGA
Try→Stop
28
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SCCⅡ
8
293
TGC→TTC
Cys→Phe
31
SCCⅠ
8
275
CCT→TCT
Pro→Ser
第7内含子
GTA→ATA
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第1碱基
36
SCCⅡ
3
269
GTT→ATT
Val→Ile
注：SCCⅠ：高分化鳞状细胞癌 SCCⅡ：中分化鳞状细胞癌
讨论
因为p53基因第5～8外显子是其高度保守区，并且绝大多数人类和动物肿瘤的p53基因突变发生于该区，所以我们采用PCR-SSCP和直接DNA测序法对DMBA-TPA-MNNG诱发的37例小鼠皮肤肿瘤中p53基因第5～8外显子进行了检测。
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有实验表明由DMBA或DMBA-TPA诱发的小鼠皮肤肿瘤中，p53基因异常主要发生于分化程度低的SCC，而在乳头状瘤和分化好的早期SCC则无或偶有发生，因而认为p53异常在该系统肿瘤的发生发展过程中是晚发事件[6]。本实验中，6例乳头状瘤无1例发现有p53基因突变，而SCC有25.8%(8/31例)发生突变，并且在SCCⅠ和SCCⅡ中的突变率差异无显著性，提示在由DMBA-TPA-MNNG诱发的小鼠皮肤肿瘤中，p53基因突变发生于乳头状瘤向SCC的恶性转化过程中。
在本组有p53基因突变的8例SCC中，7例发生于第8外显子，仅1例在第5外显子。我们曾对DMBA和苯并芘诱发的小鼠皮肤原发癌和转移癌配对分析其p53基因状态，发现原发癌突变在第8外显子者，易于发生局部淋巴结转移，并在转移癌中保持同一突变；而突变发生于其他外显子者则无这一趋势，提示不同类型p53基因突变可使肿瘤细胞具有不同的转移潜能和不同的器官亲和性[5]。
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分子流行病学证据表明对癌基因或肿瘤抑制基因突变性质分析，有助于阐明或提示致癌物的作用及作用机制。例如在人肺癌中RAS和p53基因发生的突变大多为G→T颠换，一般认为与吸烟及大气污染有关。我们曾对由烟草及烟雾中重要的致癌物质苯并芘诱发的小鼠皮肤癌中p53基因进行检测，发现其突变主要是G→T颠换，而由DMBA或DMBA-TPA诱发的小鼠皮肤癌则很少有这种突变。因而提示人类肺癌与苯并芘作用于p53基因密切相关[7]。本研究的9个突变中，有7个是由G→A转换。有资料显示亚硝基化合物包括MNNG引起的突变主要是G→A转换，这是因他们能引起鸟嘌呤O6-甲基化而导致碱基错配所至[8]。亚硝基化合物诱发的小鼠皮肤肿瘤中RAS基因突变以及大鼠肾和食道肿瘤中p53基因突变主要是G→A转移[3，9]，而DMBA或DMBA-TPA诱发的小鼠皮肤，肺和乳腺肿瘤中的RAS基因突变主要是T→A颠换，但p53基因并无某一类型的碱基突变优势[3，7]。因此，本实验结果提示由DMBA-TPA-MNNG诱发的小鼠皮肤肿瘤中，p53基因突变主要是由MNNG造成的。
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综上所述，DMBA-TPA-MNNG诱发的小鼠皮肤肿瘤中，p53基因突变发生于乳头状瘤向SCC的恶性转化过程中，即在形成SCC过程中发挥重要作用，并且这些突变主要由MNNG造成，主要位于p53基因第8外显子，其类型主要是G→A转换。
参考文献
1Barrett JC，Anderson M. Molecular mechainsms of carcinogenesis in human and rodents. Mol Carcinog, 1993,7：1-13.
2Straus BS. The origin of point mutations in human cells. Cancer Res, 1992,52：249-253.
3Harris CC. Chemical and physical carcinogenesis: advances and perspectives for the 1990s. Cancer Res, 1991,51：5023s-5044s.
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4Conti CJ, Slaga TG, Klein-Szanto AJP，eds. Carcinogenesis——A Comprehensive Survey, Vol. 11. Skin Tumors: Experimental and Clinical Aspects. New York: Reven, 1989.1-53.
5Zhang SY, Bauer B, Mitsunaga SI, et al. Lack of concordant p53 mutations in paired primary and metastatic mouse squamous cell carcinomas induced by chemical carcinogenesis. Mol Carcinog, 1995,12：77-81.
6Ruggeri B, Caamano J, Goodrow T, et al. Alterations of p53 tumor suppressor gene during mouse skin tumor progression. Cancer Res, 1991,51：6615-6621.
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7Ruggeri B, Dirado M, Zhang SY, et al. Benzo(a)pyrene-induced murine skin tumors exhibit frequent and characteristic G to T mutations in the p53 gene. Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90：1013-1017.
8Yang JL, Hsieh FP, Lee PC, et al. Strand and sequence-specific attenuation of N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine-induced G:C to A:T transitions in by expression of human 6-methyguanine-DNA methyltransferase in chinese hamster ovary cells. Cancer Res, 1994,54：3857-3863.
9Ohgaki H, Hard GC, Hirota N, et al. Selective mutation of codons 204 and 213 of the p53 gene in rat tumors induced by alkylating N-nitroso compounds. Cancer Res, 1992：2995-2998.
(收稿：1997-06-09 修回：1998-03-25), 百拇医药