横纹肌肉瘤p16基因及其蛋白表达的研究
作者：高志安 张世羽 杨光华
单位：
关键词：横纹肌肉瘤；基因；抑制；肿瘤
New Page 1 【摘要】 目的 探讨p16基因及其蛋白表达与横纹肌肉瘤发生发展的关系。方法 应用PCR-SSCP分析及免疫组化方法检测了44例人横纹肌肉瘤(RMS)中p16基因状态和47例RMS中p16蛋白表达情况。结果 2例有p16基因纯合性缺失,6例突变。p16基因异常的8例RMS中6例伴广泛浸润、复发或转移。p16蛋白表达阴性率为38.3%(18/47例)。p16基因异常的8例中有7例p16蛋白阴性,1例为阳性。另有11例p16蛋白阴性而未查见基因异常。在腺泡状横纹肌肉瘤中，p16基因异常发生率及p16蛋白表达缺失率均高于胚胎性横纹肌肉瘤。p16蛋白阴性的RMS更易伴发广泛浸润、复发或转移。结论 p16基因异常及p16蛋白表达缺失可能与部分横纹肌肉瘤的发生发展有关。
, http://www.100md.com
A study of p16 gene and its protein expression in rhabdomyosarcoma Gao Zhian, Zhang Shiyu, Yang Guanghua. Department of Pathology, First Medical School, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041
【Abstract】 Objective To evaluate the relationship between alteration of p16 gene, its protein expression and the pathogenesis and development of rhabdomyosarcoma (RMS).Methods 44 cases of RMS were examined for alteration of p16 gene with PCR-SSCP and 47 cases of RMS were examined for p16 protein expression with immunohistochemical method. Results The homozygous deletion of p16 gene was observed in 2 cases and mutations in 6 cases.Of these 8 cases with altered p16 gene, 6 had extensive invasion, recurrence or metastasis. The total negative rate of p16 protein expression in RMS was 38.3% (18/47 cases). Of these 8 cases with alterations of p16 gene, negative expression for p16 protein was observed in 7 cases and positive in only 1 cases. In contrast, no structural abnormalities of the p16 gene were detected in another 11 cases with negative expression of p16 protein. Higher rates of p16 gene abnormality and loss of p16 protein were observed in ARMS than in ERMS. Higher rate of extensive invasion, recurrence or metastasis was also found in the group negative for p16 protein. Conclusion The abnormalities of p16 gene and loss of p16 protein expression may be related to the pathogenesis and development of some RMS.
, 百拇医药
【Key words】 Rhabdomyosarcoma Genes, Suppressor, tumor
横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RMS)是恶性程度甚高的常见软组织肉瘤，好发于儿童及青少年。有关RMS的分子遗传学异常如染色体异位、N-myc原癌基因扩增及p53基因突变等已有报道[1，2]。p16基因是新近鉴定的肿瘤抑制基因，在许多类型肿瘤细胞株及肿瘤中发生缺失或突变[3]。我们应用PCR-SSCP方法观察RMS中p16基因的状态，并应用免疫组化方法观察p16蛋白的表达，旨在探索p16基因及其蛋白表达异常在RMS发生发展中的作用及其临床意义。
材料与方法
1.标本：47例RMS&127;标本取自华西医科大学附属第一临床医院病理科及眼科1972～1996年存档蜡块。全部病例经复查并经免疫组化证实为诊断确切的RMS，其中胚胎性(ERMS)28例，腺泡状(ARMS)16例，多形性(PRMS)3例。14例伴局部广泛浸润、复发或转移。
, 百拇医药
2.免疫组化染色：采用SP免疫组化法。兔抗人p16蛋白(SC-468)多克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品，工作浓度为1∶100。对照：以皮内痣组织为阳性对照，以PBS代替第一抗体为阴性对照。
结果判定：以细胞核出现棕黄色颗粒定为阳性。结果分别记录为：(-)：无明显阳性细胞；(+)：阳性细胞<40%；(++)：阳性细胞>40%。
3.PCR-SSCP分析：应用PCR方法扩增p16基因第1、2外显子，GAPDH基因片段引物作为PCR对照，引物序列见文献[4]。PCR反应在PE 480 DNA热循环仪上进行。反应总体积为20 μ1，扩增产物行6%非变性聚丙烯酰胺凝胶(含10%甘油)电泳，凝胶用硝酸银或EB染色后，观察结果。
4.统计学分析：采用卡方检验。
结果
, 百拇医药
1.免疫组化结果：47例RMS中，p16蛋白阳性29例(61.7%)，阴性18例(38.3%)，见图1～3。p16蛋白阳性率在28例ERMS中为75.0%，而在16例ARMS中为43.8%，经统计学处理，P<0.05差异有显著性。在p16蛋白阳性组，肿瘤广泛浸润、复发或转移的发生率为17.2%(5/29例)。而在p16蛋白阴性组则为50.0%(9/18例)，经统计学处理，P<0.05，差异有显著性。p16蛋白阳性29例中，ERMS 21例，ARMS 7例，PRMS 1例，广泛浸润，复发和转移5例。p16蛋白阴性18例中，ERMS 7例，ARMS 9例，PRMS 2例，广泛浸润、复发和转移9例。
2.PCR-SSCP分析结果：47例RMS中，有3例p16基因第1、2外显子和GAPDH扩增产物均缺如，故认为是因标本DNA破坏致不能扩增。其余44例中2例(4.5%)有p16基因缺失，均为ARMS。SSCP分析结果显示6例基因突变，均发生于第2外显子，其中ERMS和ARMS各3例(图4，5)。在突变的1例转移和1例复发的肿瘤中，对原发灶和转移灶，复发前后病灶分别进行SSCP分析，结果原发灶和转移灶，复发前后病灶基因改变相同。在p16基因异常的8例中。有6例发生广泛浸润、复发或转移，而p16基因无异常的36例中为8例(22.2%)。p16基因异常与RMS亚型及广泛浸润、复发或转移的关系见附表。
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M：Marker pBR322/HaeⅢ DNA标准，1：正常对照，2，3，5，6：ERMS，8：ARMS，9：PRMS，均显示242 bp和450bp两条产物带，4，7：ARMS，242 bp p16基因产物缺如，而450 bpGAPDH产物存在
图4 p16基因外显子2a产物电泳结果(银染)
M：Marker pBR322/Hae Ⅲ DNA标准，1：正常对照，2：ERMS，SSCP阳性，3：ARMS，SSCP阳性(原发灶)，4：ARMS，5：ERMS，SSCP阳性(p16蛋白阳性)，6：与3为同一病例，转移灶SSCP阳性，7：ARMS
图5 p16基因外显子2b SSCP电泳结果(EB染色)
, 百拇医药
图1 ERMS，示小圆形和星形原始间叶样肿瘤细胞，间质粘液变 HE×200 图2 ERMS，Myoglobin染色，示胞浆阳性 SP法×200 图3 ERMS，p16蛋白染色，胞核呈阳性 SP法×300附表 p16基因异常与RMS亚型及广泛
浸润、复发和转移的关系(例数)
p16基因
ERMS
ARMS
PRMS
广泛浸润
复发、转移
(-)
(+)
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无异常
23
11
2
28
8
缺失
0
2
0
0
2
突变
3
, 百拇医药
3
0
2
4
在p16基因异常的8例RMS中，7例p16蛋白表达阴性；1例基因突变，但p16蛋白阳性，另有11例p16蛋白阴性，但未查见基因异常。p16基因异常与p16蛋白表达的关系：p16蛋白(-)中：p16基因无改变11例，缺失2例，突变5例。p16蛋白(+)中P16基因无改变25例，缺失无，突变1例。
讨论
p16基因定位于9号染色体短臂21区(9P21)，整个基因由3个外显子和2个内含子构成，126 bp的外显子1和307bp的外显子2构成了该基因的97%编码区，其编码产物p16蛋白直接参与细胞周期调节，是细胞G1期重要的负调节蛋白[5]。我们应用PCR-SSCP及免疫组化方法分别检测了44例和47例RMS中p16基因状态及p16蛋白的表达。结果发现44例中2例有p16基因纯合性缺失，6例有基因突变；47例RMS中p16蛋白表达缺失率为38.3%(18/47例)。这些结果提示p16基因异常和p16蛋白表达缺失可能与部分RMS的发生有关。据文献报道[4，5]p16基因缺失在肿瘤细胞株发生率相当高，而在实体肿瘤相对低得多。对于这种差异有几种解释：一是认为基因缺失赋予细胞选择性生长优势，使其在培养基中容易存活，因而基因异常检出率高；另一种是在实体肿瘤中非肿瘤细胞存在是不可避免的，这些非肿瘤细胞DNA的污染可能造成实验结果的误差；然而另一因素也可能存在，即在体外培养条件下，细胞传代过程中会增加基因异常的机会。
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在p16基因异常的8例RMS中，7例p16蛋白表达阴性，说明基因异常导致蛋白表达缺失。而1例SSCP分析发现基因突变，但p16蛋白表达阳性，提示p16基因虽发生碱基改变，但未影响其编码蛋白质的功能，可能是一种基因多态性。在p16蛋白表达阴性的18例RMS中，有11例未查见p16基因异常。在这些病例中p16蛋白表达缺失也可能是由于p16基因失活所致，但其失活机制应用我们的检测方法尚不能发现。最近有报道指出，DNA异常甲基化可能与p16基因失活有关[6]。p16蛋白是周期素依赖激酶抑制因子(cyclin─dependent kinase inhibitors,CKI)家族的重要成员。在体内p16蛋白与cyclinD1蛋白竞争结合CDK4和CDK6，并抑制其催化Rb蛋白磷酸化的活性，进而阻止细胞周期进展。当p16蛋白因基因失活而表达缺失时，失去了对CDK4和CDK6的抑制作用，CDK4和CDK6与cyclinD1蛋白结合而活化，促使Rb蛋白磷酸化而失活，导致细胞失控性增殖而有利于肿瘤形成。
分析不同亚型RMS中p16基因异常和p16蛋白表达发现，在16例ARMS中有5例(31.3%)p16基因异常，而在26例ERMS中仅为3例(11.5%)。再者p16蛋白表达阳性率在ARMS也明显低于ERMS。这可能提示在ARMS中更容易发生p16基因及其蛋白表达异常，同时也可能反映出p16基因异常及p16蛋白表达缺失与ARMS的临床生物学行为恶性度较高有关，并可能为预示RMS患者预后提供帮助。
, 百拇医药
我们也分析了伴局部广泛浸润、复发或转移的RMS中p16基因及其蛋白表达的情况，发现p16基因异常的8例中有6例发生肿瘤广泛浸润、复发或转移，而在p16基因无异常的36例中仅8例(22.2%)。在p16蛋白阴性组，肿瘤广泛浸润、复发或转移的发生率明显高于p16蛋白阳性组。与文献报道一致[7，8]，提示p16基因异常及p16蛋白表达缺失与RMS恶性进展有关。在我们的研究中有绝大部分RMS未查见p16基因结构异常，也有半数以上的病例p16蛋白表达呈阳性，在这部分病例中有其它基因参与其发病的可能性是较大的。
参考文献
1Dias P,Kumar P,Marden HB,et al.N-myc gene is amplifed in alveolar rhabdomyosarcoma (RMS)but not in embryonal RMS.Int J Cancer，1990，45:593-596.
, http://www.100md.com
2Filix CA, Chavez Kappel C,Mitsudomi T, et al. Frequency and diversity of p53 mutations in childhood rhabdomyosarcoma.Cancer Res，1992，52:2243-2247.
3Nobori T,Miura K,WU DJ,et al. Deletion of the cyclin-dependent kinasey-4 inhibitor gene in multiple human cancers. Nature，1994，368:753-756.
4Zhang SY, Klein-Szant AJP, Sauter ER, et al. Higher frequency of alteration in the p16/CDKN2 gene in squamous cell carcinoma cell lines than in primary tumor of the head and neck.Cancer Res，1994，54:5050-5053.
, 百拇医药
5Kanmb A,Gruis NA,Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science， 1994，264:436-440.
6James G, Adrian Merlo, Mao Li, et al. Inactivation of the CDKN2/p16/MTS1 gene is frequent associated with aberrant DNA methylation in all common human cancers.Cancer Res，1995，55:4525-4530.
7Okamoto A,Hussain P,Hagiwarz K, et al. Mutation in the p16INK4/MTS1/CDKN2,,p15/MTS2,and p18 gens in primary and metastatic lung cancer. Cancer Res, 1995, 55:1448-1452.
8郑杰,周传农,萧风，等.p16、Rb和细胞周期素D1蛋白在食管癌中的表达及意义.中华病理学杂志，1996，25:336-339.
(收稿：1997-10-13 修回：1998-04-09), 百拇医药
单位：
关键词：横纹肌肉瘤；基因；抑制；肿瘤
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A study of p16 gene and its protein expression in rhabdomyosarcoma Gao Zhian, Zhang Shiyu, Yang Guanghua. Department of Pathology, First Medical School, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041
【Abstract】 Objective To evaluate the relationship between alteration of p16 gene, its protein expression and the pathogenesis and development of rhabdomyosarcoma (RMS).Methods 44 cases of RMS were examined for alteration of p16 gene with PCR-SSCP and 47 cases of RMS were examined for p16 protein expression with immunohistochemical method. Results The homozygous deletion of p16 gene was observed in 2 cases and mutations in 6 cases.Of these 8 cases with altered p16 gene, 6 had extensive invasion, recurrence or metastasis. The total negative rate of p16 protein expression in RMS was 38.3% (18/47 cases). Of these 8 cases with alterations of p16 gene, negative expression for p16 protein was observed in 7 cases and positive in only 1 cases. In contrast, no structural abnormalities of the p16 gene were detected in another 11 cases with negative expression of p16 protein. Higher rates of p16 gene abnormality and loss of p16 protein were observed in ARMS than in ERMS. Higher rate of extensive invasion, recurrence or metastasis was also found in the group negative for p16 protein. Conclusion The abnormalities of p16 gene and loss of p16 protein expression may be related to the pathogenesis and development of some RMS.
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【Key words】 Rhabdomyosarcoma Genes, Suppressor, tumor
横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RMS)是恶性程度甚高的常见软组织肉瘤，好发于儿童及青少年。有关RMS的分子遗传学异常如染色体异位、N-myc原癌基因扩增及p53基因突变等已有报道[1，2]。p16基因是新近鉴定的肿瘤抑制基因，在许多类型肿瘤细胞株及肿瘤中发生缺失或突变[3]。我们应用PCR-SSCP方法观察RMS中p16基因的状态，并应用免疫组化方法观察p16蛋白的表达，旨在探索p16基因及其蛋白表达异常在RMS发生发展中的作用及其临床意义。
材料与方法
1.标本：47例RMS&127;标本取自华西医科大学附属第一临床医院病理科及眼科1972～1996年存档蜡块。全部病例经复查并经免疫组化证实为诊断确切的RMS，其中胚胎性(ERMS)28例，腺泡状(ARMS)16例，多形性(PRMS)3例。14例伴局部广泛浸润、复发或转移。
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2.免疫组化染色：采用SP免疫组化法。兔抗人p16蛋白(SC-468)多克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品，工作浓度为1∶100。对照：以皮内痣组织为阳性对照，以PBS代替第一抗体为阴性对照。
结果判定：以细胞核出现棕黄色颗粒定为阳性。结果分别记录为：(-)：无明显阳性细胞；(+)：阳性细胞<40%；(++)：阳性细胞>40%。
3.PCR-SSCP分析：应用PCR方法扩增p16基因第1、2外显子，GAPDH基因片段引物作为PCR对照，引物序列见文献[4]。PCR反应在PE 480 DNA热循环仪上进行。反应总体积为20 μ1，扩增产物行6%非变性聚丙烯酰胺凝胶(含10%甘油)电泳，凝胶用硝酸银或EB染色后，观察结果。
4.统计学分析：采用卡方检验。
结果
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1.免疫组化结果：47例RMS中，p16蛋白阳性29例(61.7%)，阴性18例(38.3%)，见图1～3。p16蛋白阳性率在28例ERMS中为75.0%，而在16例ARMS中为43.8%，经统计学处理，P<0.05差异有显著性。在p16蛋白阳性组，肿瘤广泛浸润、复发或转移的发生率为17.2%(5/29例)。而在p16蛋白阴性组则为50.0%(9/18例)，经统计学处理，P<0.05，差异有显著性。p16蛋白阳性29例中，ERMS 21例，ARMS 7例，PRMS 1例，广泛浸润，复发和转移5例。p16蛋白阴性18例中，ERMS 7例，ARMS 9例，PRMS 2例，广泛浸润、复发和转移9例。
2.PCR-SSCP分析结果：47例RMS中，有3例p16基因第1、2外显子和GAPDH扩增产物均缺如，故认为是因标本DNA破坏致不能扩增。其余44例中2例(4.5%)有p16基因缺失，均为ARMS。SSCP分析结果显示6例基因突变，均发生于第2外显子，其中ERMS和ARMS各3例(图4，5)。在突变的1例转移和1例复发的肿瘤中，对原发灶和转移灶，复发前后病灶分别进行SSCP分析，结果原发灶和转移灶，复发前后病灶基因改变相同。在p16基因异常的8例中。有6例发生广泛浸润、复发或转移，而p16基因无异常的36例中为8例(22.2%)。p16基因异常与RMS亚型及广泛浸润、复发或转移的关系见附表。
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M：Marker pBR322/HaeⅢ DNA标准，1：正常对照，2，3，5，6：ERMS，8：ARMS，9：PRMS，均显示242 bp和450bp两条产物带，4，7：ARMS，242 bp p16基因产物缺如，而450 bpGAPDH产物存在
图4 p16基因外显子2a产物电泳结果(银染)
M：Marker pBR322/Hae Ⅲ DNA标准，1：正常对照，2：ERMS，SSCP阳性，3：ARMS，SSCP阳性(原发灶)，4：ARMS，5：ERMS，SSCP阳性(p16蛋白阳性)，6：与3为同一病例，转移灶SSCP阳性，7：ARMS
图5 p16基因外显子2b SSCP电泳结果(EB染色)
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图1 ERMS，示小圆形和星形原始间叶样肿瘤细胞，间质粘液变 HE×200 图2 ERMS，Myoglobin染色，示胞浆阳性 SP法×200 图3 ERMS，p16蛋白染色，胞核呈阳性 SP法×300附表 p16基因异常与RMS亚型及广泛
浸润、复发和转移的关系(例数)
p16基因
ERMS
ARMS
PRMS
广泛浸润
复发、转移
(-)
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无异常
23
11
2
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缺失
0
2
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2
突变
3
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在p16基因异常的8例RMS中，7例p16蛋白表达阴性；1例基因突变，但p16蛋白阳性，另有11例p16蛋白阴性，但未查见基因异常。p16基因异常与p16蛋白表达的关系：p16蛋白(-)中：p16基因无改变11例，缺失2例，突变5例。p16蛋白(+)中P16基因无改变25例，缺失无，突变1例。
讨论
p16基因定位于9号染色体短臂21区(9P21)，整个基因由3个外显子和2个内含子构成，126 bp的外显子1和307bp的外显子2构成了该基因的97%编码区，其编码产物p16蛋白直接参与细胞周期调节，是细胞G1期重要的负调节蛋白[5]。我们应用PCR-SSCP及免疫组化方法分别检测了44例和47例RMS中p16基因状态及p16蛋白的表达。结果发现44例中2例有p16基因纯合性缺失，6例有基因突变；47例RMS中p16蛋白表达缺失率为38.3%(18/47例)。这些结果提示p16基因异常和p16蛋白表达缺失可能与部分RMS的发生有关。据文献报道[4，5]p16基因缺失在肿瘤细胞株发生率相当高，而在实体肿瘤相对低得多。对于这种差异有几种解释：一是认为基因缺失赋予细胞选择性生长优势，使其在培养基中容易存活，因而基因异常检出率高；另一种是在实体肿瘤中非肿瘤细胞存在是不可避免的，这些非肿瘤细胞DNA的污染可能造成实验结果的误差；然而另一因素也可能存在，即在体外培养条件下，细胞传代过程中会增加基因异常的机会。
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在p16基因异常的8例RMS中，7例p16蛋白表达阴性，说明基因异常导致蛋白表达缺失。而1例SSCP分析发现基因突变，但p16蛋白表达阳性，提示p16基因虽发生碱基改变，但未影响其编码蛋白质的功能，可能是一种基因多态性。在p16蛋白表达阴性的18例RMS中，有11例未查见p16基因异常。在这些病例中p16蛋白表达缺失也可能是由于p16基因失活所致，但其失活机制应用我们的检测方法尚不能发现。最近有报道指出，DNA异常甲基化可能与p16基因失活有关[6]。p16蛋白是周期素依赖激酶抑制因子(cyclin─dependent kinase inhibitors,CKI)家族的重要成员。在体内p16蛋白与cyclinD1蛋白竞争结合CDK4和CDK6，并抑制其催化Rb蛋白磷酸化的活性，进而阻止细胞周期进展。当p16蛋白因基因失活而表达缺失时，失去了对CDK4和CDK6的抑制作用，CDK4和CDK6与cyclinD1蛋白结合而活化，促使Rb蛋白磷酸化而失活，导致细胞失控性增殖而有利于肿瘤形成。
分析不同亚型RMS中p16基因异常和p16蛋白表达发现，在16例ARMS中有5例(31.3%)p16基因异常，而在26例ERMS中仅为3例(11.5%)。再者p16蛋白表达阳性率在ARMS也明显低于ERMS。这可能提示在ARMS中更容易发生p16基因及其蛋白表达异常，同时也可能反映出p16基因异常及p16蛋白表达缺失与ARMS的临床生物学行为恶性度较高有关，并可能为预示RMS患者预后提供帮助。
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我们也分析了伴局部广泛浸润、复发或转移的RMS中p16基因及其蛋白表达的情况，发现p16基因异常的8例中有6例发生肿瘤广泛浸润、复发或转移，而在p16基因无异常的36例中仅8例(22.2%)。在p16蛋白阴性组，肿瘤广泛浸润、复发或转移的发生率明显高于p16蛋白阳性组。与文献报道一致[7，8]，提示p16基因异常及p16蛋白表达缺失与RMS恶性进展有关。在我们的研究中有绝大部分RMS未查见p16基因结构异常，也有半数以上的病例p16蛋白表达呈阳性，在这部分病例中有其它基因参与其发病的可能性是较大的。
参考文献
1Dias P,Kumar P,Marden HB,et al.N-myc gene is amplifed in alveolar rhabdomyosarcoma (RMS)but not in embryonal RMS.Int J Cancer，1990，45:593-596.
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2Filix CA, Chavez Kappel C,Mitsudomi T, et al. Frequency and diversity of p53 mutations in childhood rhabdomyosarcoma.Cancer Res，1992，52:2243-2247.
3Nobori T,Miura K,WU DJ,et al. Deletion of the cyclin-dependent kinasey-4 inhibitor gene in multiple human cancers. Nature，1994，368:753-756.
4Zhang SY, Klein-Szant AJP, Sauter ER, et al. Higher frequency of alteration in the p16/CDKN2 gene in squamous cell carcinoma cell lines than in primary tumor of the head and neck.Cancer Res，1994，54:5050-5053.
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5Kanmb A,Gruis NA,Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science， 1994，264:436-440.
6James G, Adrian Merlo, Mao Li, et al. Inactivation of the CDKN2/p16/MTS1 gene is frequent associated with aberrant DNA methylation in all common human cancers.Cancer Res，1995，55:4525-4530.
7Okamoto A,Hussain P,Hagiwarz K, et al. Mutation in the p16INK4/MTS1/CDKN2,,p15/MTS2,and p18 gens in primary and metastatic lung cancer. Cancer Res, 1995, 55:1448-1452.
8郑杰,周传农,萧风，等.p16、Rb和细胞周期素D1蛋白在食管癌中的表达及意义.中华病理学杂志，1996，25:336-339.
(收稿：1997-10-13 修回：1998-04-09), 百拇医药