p53基因及蛋白在毛细胞星形细胞瘤中的观察
作者：丁敏 张尚福 姜晓峰
单位：230001 安徽省立医院病理科(丁敏)，神经外科(姜晓峰)；华西医科大学附属第一医院病理科(张尚福)
关键词：
中华病理学杂志/990215 p53基因在成人纤维型星形细胞瘤发生和发展过程中的重要作用已成共识，但对儿童毛细胞星形细胞瘤中的分子生物学研究则甚少。本实验目的在于检测p53基因突变及蛋白的过表达在毛细胞星形细胞瘤中的发生率，以探讨分子生物学研究在低级星形细胞瘤中的诊断及分级意义。
一、材料和方法
1.选择1995～1997年安徽省立医院和华西医科大学第一附属医院病理档案中年龄在7个月～16岁的儿童、青少年毛细胞星形细胞瘤27例，所有标本均经4%甲醛固定，石蜡包埋。
, 百拇医药
2.p53基因突变的检测：肿瘤细胞的DNA由常规石蜡包埋组织中提取(QIAamp Tissue Kit，德国QIAGEN公司产品)。p53突变的检测采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)，结合直接测序的方法，在突变热点区外显子5-8中寻找DNA序列的变化。PCR试剂为美国Perkin Elmer公司产品。常规三步PCR反应，40个循环。8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后对SSCP胶上异常移行条带进行PCR再扩增和DNA纯化。纯化后的DNA直接用于测序，试剂盒为英国Amersham公司产品。
3.p53蛋白免疫组化：p53单克隆抗体(DO7)为丹麦DAKO公司产品，抗体稀释度为1∶100，ABC试剂盒为美国Vector公司产品。标记前用pH 6.0 10 μmol/L枸橼酸钠缓冲液微波加热处理。阳性结果为瘤细胞核显示棕黄色颗粒。任选20个高倍视野计算阳性细胞占总数的百分比，并将结果分为3个等级：-：<5%，+：5%～10%，++：11%～50%，+++：>50%。
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二、结果
1.27例毛细胞星形细胞瘤中仅1例发现有p53基因突变，其错义突变位于外显子8，密码子273。碱基序列由CGT→TGT，其相应单个氨基酸残基由半胱氨酸取代精氨酸。
2.27例毛细胞星形细胞瘤中有2例(7.4%)p53蛋白表达阳性(图1)，阳性强度：+和++，唯一1例含p53基因错义突变的肿瘤却无p53蛋白的核内异常积聚。
图1 p53蛋白在毛细胞星形细胞瘤染色阳性(++)，胞核显棕黄色颗粒 ABC法×200
三、讨论
近10年来分子生物学研究在病理诊断中的辅助作用受到广泛的关注，尤其是对p53的抑癌作用及失活后与肿瘤发生之间的相互关系的研究，更加深了病理学者对疾病发生、发展的理解。其中p53基因与弥漫型星形细胞肿瘤(diffuse astrocytomas)之间关系的研究，已取得显著的成果。人们发现，约有70%的纤维型星形细胞瘤术后数年复发，并发生恶性转化，且p53基因突变和蛋白异常表达率高达60%～78%[1，2]。我们在研究27例儿童毛细胞星形细胞瘤中发现的1例错义突变位于外显子8，密码子273。密码子273是p53突变热点之一。由于缺乏病人正常组织的DNA作为研究对照，因此不能肯定此突变是否为肿瘤体突变，遗憾的是Willert和Lang所报道的二例p53错义突变也未能说明是否为肿瘤特异的体突变。至于p53蛋白在毛细胞星形细胞瘤的表达，Lang发现57%(4/7例)，其中1例尚伴有p53基因错义突变[2]。而我们在27例中仅2例有p53蛋白阳性表达，阳性率7.4%。迄今为止，鉴别毛细胞星形细胞瘤和纤维型星形细胞瘤仍然主要靠组织学检查。毛细胞星形细胞瘤的组织学表现非常多样化，瘤细胞通常排列较疏松，含囊性变及粘液样基质(图2)，也可有致密排列及小叶状排列，甚至可见显著血管增生及不典型细胞，与纤维型星形细胞瘤相类似。虽然Rosenthal纤维和透明小体的存在有助于毛细胞星形细胞瘤的诊断，但这些结构并非毛细胞星形细胞瘤所特有。因此不可否认单一组织学检查有一定的局限性。本实验结果p53基因突变及p53蛋白过表达在毛细胞星形细胞瘤中发生率甚低，与毛细胞星形细胞瘤的病理发生并无直接关系，提示应用分子生物学检测不仅对肿瘤特性有所认识，且可作为肿瘤分级与评估预后的参考指标。
, http://www.100md.com
图2 瘤细胞形态呈细纤维状和星网状，排列较疏松，常含
微囊及粘液样基质 HE×200
参考文献
1 Watanabe K, Sato K, Biernat W, et al. incidence and timing of p53 mutations during astrocytoma progression in patients with multiple biopsies. Clin Cancer Res, 1997,3：523-530.
2 Lang FF, Miller DC, Pisharody S, et al. High frequency of p53 protein accumulation without p53 gene mutation in human juvenile pilocytic, low grade and anaplastic astrocytomas. Oncogene, 1994,9：949-954.
(收稿：1998-04-30 修回：1998-12-28), 百拇医药
单位：230001 安徽省立医院病理科(丁敏)，神经外科(姜晓峰)；华西医科大学附属第一医院病理科(张尚福)
关键词：
中华病理学杂志/990215 p53基因在成人纤维型星形细胞瘤发生和发展过程中的重要作用已成共识，但对儿童毛细胞星形细胞瘤中的分子生物学研究则甚少。本实验目的在于检测p53基因突变及蛋白的过表达在毛细胞星形细胞瘤中的发生率，以探讨分子生物学研究在低级星形细胞瘤中的诊断及分级意义。
一、材料和方法
1.选择1995～1997年安徽省立医院和华西医科大学第一附属医院病理档案中年龄在7个月～16岁的儿童、青少年毛细胞星形细胞瘤27例，所有标本均经4%甲醛固定，石蜡包埋。
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2.p53基因突变的检测：肿瘤细胞的DNA由常规石蜡包埋组织中提取(QIAamp Tissue Kit，德国QIAGEN公司产品)。p53突变的检测采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)，结合直接测序的方法，在突变热点区外显子5-8中寻找DNA序列的变化。PCR试剂为美国Perkin Elmer公司产品。常规三步PCR反应，40个循环。8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后对SSCP胶上异常移行条带进行PCR再扩增和DNA纯化。纯化后的DNA直接用于测序，试剂盒为英国Amersham公司产品。
3.p53蛋白免疫组化：p53单克隆抗体(DO7)为丹麦DAKO公司产品，抗体稀释度为1∶100，ABC试剂盒为美国Vector公司产品。标记前用pH 6.0 10 μmol/L枸橼酸钠缓冲液微波加热处理。阳性结果为瘤细胞核显示棕黄色颗粒。任选20个高倍视野计算阳性细胞占总数的百分比，并将结果分为3个等级：-：<5%，+：5%～10%，++：11%～50%，+++：>50%。
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二、结果
1.27例毛细胞星形细胞瘤中仅1例发现有p53基因突变，其错义突变位于外显子8，密码子273。碱基序列由CGT→TGT，其相应单个氨基酸残基由半胱氨酸取代精氨酸。
2.27例毛细胞星形细胞瘤中有2例(7.4%)p53蛋白表达阳性(图1)，阳性强度：+和++，唯一1例含p53基因错义突变的肿瘤却无p53蛋白的核内异常积聚。
图1 p53蛋白在毛细胞星形细胞瘤染色阳性(++)，胞核显棕黄色颗粒 ABC法×200
三、讨论
近10年来分子生物学研究在病理诊断中的辅助作用受到广泛的关注，尤其是对p53的抑癌作用及失活后与肿瘤发生之间的相互关系的研究，更加深了病理学者对疾病发生、发展的理解。其中p53基因与弥漫型星形细胞肿瘤(diffuse astrocytomas)之间关系的研究，已取得显著的成果。人们发现，约有70%的纤维型星形细胞瘤术后数年复发，并发生恶性转化，且p53基因突变和蛋白异常表达率高达60%～78%[1，2]。我们在研究27例儿童毛细胞星形细胞瘤中发现的1例错义突变位于外显子8，密码子273。密码子273是p53突变热点之一。由于缺乏病人正常组织的DNA作为研究对照，因此不能肯定此突变是否为肿瘤体突变，遗憾的是Willert和Lang所报道的二例p53错义突变也未能说明是否为肿瘤特异的体突变。至于p53蛋白在毛细胞星形细胞瘤的表达，Lang发现57%(4/7例)，其中1例尚伴有p53基因错义突变[2]。而我们在27例中仅2例有p53蛋白阳性表达，阳性率7.4%。迄今为止，鉴别毛细胞星形细胞瘤和纤维型星形细胞瘤仍然主要靠组织学检查。毛细胞星形细胞瘤的组织学表现非常多样化，瘤细胞通常排列较疏松，含囊性变及粘液样基质(图2)，也可有致密排列及小叶状排列，甚至可见显著血管增生及不典型细胞，与纤维型星形细胞瘤相类似。虽然Rosenthal纤维和透明小体的存在有助于毛细胞星形细胞瘤的诊断，但这些结构并非毛细胞星形细胞瘤所特有。因此不可否认单一组织学检查有一定的局限性。本实验结果p53基因突变及p53蛋白过表达在毛细胞星形细胞瘤中发生率甚低，与毛细胞星形细胞瘤的病理发生并无直接关系，提示应用分子生物学检测不仅对肿瘤特性有所认识，且可作为肿瘤分级与评估预后的参考指标。
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图2 瘤细胞形态呈细纤维状和星网状，排列较疏松，常含
微囊及粘液样基质 HE×200
参考文献
1 Watanabe K, Sato K, Biernat W, et al. incidence and timing of p53 mutations during astrocytoma progression in patients with multiple biopsies. Clin Cancer Res, 1997,3：523-530.
2 Lang FF, Miller DC, Pisharody S, et al. High frequency of p53 protein accumulation without p53 gene mutation in human juvenile pilocytic, low grade and anaplastic astrocytomas. Oncogene, 1994,9：949-954.
(收稿：1998-04-30 修回：1998-12-28), 百拇医药