高血压、糖尿病大鼠的一氧化氮、内皮素变化与心肌病变的关系
作者：郑旭 张晶 罗杰 李光伟 陈任明 王瑶 杨文英 王泰龄
单位：100029 北京，中日友好医院内分泌科(郑旭、李光伟、陈任明、王瑶、杨文英)，病理科(张晶、罗杰、王泰龄)
关键词：
糖尿病和高血压时均有血管内皮功能障碍 糖尿病和高血压时均有血管内皮功能障碍，一氧化氮(NO)与内皮素(ET)失调[1，2]。NO是重要的血管扩张因子，由NO合酶(NOS)催化L-精氨酸生成。我们研究目的在于建立SHR-糖尿病模型，观察高血压合并糖尿病时心肌内NO、ET系统的变化与心肌病变间的关系。
一、材料与方法
1.实验动物：WKY和SHR大鼠 (4～6周龄)42只由中国医学科学院阜外医院提供。SHR大鼠随机分成SHR组和SHR-糖尿病组。后者以链脲佐菌素75 mg/kg溶于0.1 mol/L枸橼酸缓冲液(pH 4.3)中给予SHR大鼠腹腔内一次性注射。于第10周及20周分别取心血作生化检测，并分别取左心室肌置液氮内，用作NO及NOS活性测定；4%甲醛固定，石蜡包埋用作光镜检查及原位杂交；2.5%戊二醛固定做电镜检查。
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2.检测方法：血压测定用RBP-1大鼠尾血压测量仪(我院临床医学研究所生理室研制)。血糖检测用葡萄糖氧化酶法。血浆ET测定采用解放军总医院东亚免疫技术研究所提供的ET放免测定试剂盒。(1)NO测定：将心肌组织块称重、剪碎，按50 mg组织加入含1%牛血清白蛋白的Kreb液，37℃恒温振荡水浴(95%O2-5%CO2)持续平衡孵育90分钟，取孵育液0.1 ml，按Greiss法测终末产物NO2含量，换算为心肌组织释放的NO含量(nmol/g组织)。(2)NOS活性：按文献[3]方法分别测定内皮型NOS(eNOS)和诱导型NOS(iNOS)活性，以每分钟pmol/mg.pr表示。(3)蛋白定量用考马斯亮蓝比色法。(4)原位杂交：石蜡切片厚3 μm，脱蜡后，0.3% H2O2封闭，100 μg/ml蛋白酶K消化，4%多聚甲醛后固定，乙醇脱水，风干。将加热(80℃，5 分钟)后的杂交液(含生物素标记的NOS-cRNA探针，北京医科大学病理系合成)加于玻片上(40 ng/片)杂交。42℃孵育16～20小时。用2×SSC甲酰胺溶液及2×SSC溶液(42℃)洗涤各20 分钟。1%马血清封闭，滴加1∶100ABC液，室温孵育1小时，DAB显色，苏木素复染。去离子甲酰胺、鲑精DNA、二巯基糖醇(DTT)及50%硫酸右旋苷购自美国公司。细胞胞质内棕色颗粒为杂交阳性，依杂交信号强弱分为0～Ⅲ级。(5)光镜检查：切片3 μm厚，做HE及Masson三重染色。(6)超微结构观察：组织块经Epon 812包埋，醋酸铀及枸橼酸铅染色，日本电子1200透射电镜观察。
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3.统计学处理：实验结果以
±s表示，多组资料用SYSTAT统计软件做方差分析。
二、结果
SHR组及SHR-糖尿病组血压显著高于WKY组，分别为(209.2±24.8)、(162.0±18.6)及(102.5±9.4) mm Hg。SHR-糖尿病组血糖明显高于WKY组及SHR组，10周时分别为(20.8±2.5)、(7.4±1.2)及(9.7±2.1) mmol/L；20周时分别为(30.5±3.6)、(8.9±1.8)及(10.2±3.3) mmol/L (P<0.001)。血浆ET水平SHR组20周时高于其它两组(P<0.01)，分别为(147.0±33.0)、(95.0±17.0)、(88.0±17.0) pg/ml。
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光镜观察，SHR-糖尿病组有明显的心肌间质纤维化，胶原纤维呈网状分隔心肌细胞(图1)，心内膜下纤维组织增多，此外SHR-糖尿病及SHR组均可见冠脉周围纤维化，间质细胞增多。电镜下观察，SHR-糖尿病组心肌细胞内线粒体增多、肿胀、嵴减少且排列紊乱及空泡形成，心肌细胞水肿，肌纤维断裂，间质胶原纤维增多等。这些改变SHR-糖尿病组明显重于SHR组。
图1 SHR+糖尿病组20周，心肌间质胶原纤维增多 Masson染色×100
心肌NO含量、NOS活性的变化：SHR-糖尿病组NO含量明显降低(P<0.05)，cNOS活性下降(P<0.01)，iNOS活性及i/c比值升高(P<0.01)。SHR组cNOS活性降低程度不及SHR-糖尿病组(P<0.01，表1)。NOS mRNA检测：SHR-糖尿病组冠脉内皮、平滑肌细胞及阻力血管内皮细胞NOSmRNA水平低于WKY组(P<0.05，图2，3)。SHR组，阻力血管平滑肌NOS基因表达低于另2组(P<0.01，图4，5)。ETmRNA检测：10周时SHR组冠脉内皮及平滑肌ET mRNA水平高于WKY组，分别为3.5±0.6和2.2±0.4(P<0.05)。心肌阻力血管内皮及平滑肌ET基因表达，SHR组和SHR-糖尿病组10周时均高于WKY组，分别为2.8±0.5，2.0±0.8和0.8±0.4；20周时分别为3.0±1.4，3.4±0.9和1.7±0.5(P均<0.05，图6，7)。
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表1 心肌NO及NOS活性测定(±s)
组别
NO
(mmol/g)
eNOS
iNOS
(每分钟
pmol/mg.pr)
i/c比值
10周WKY
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450.5
±162.6
8.3
±1.1
4.9
±1.2
0.6
±0.1
SHR
205.7
± 75.7△
4.7
±1.9△△
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9.0
±1.3△△
3.2
±1.1
SHR-
糖尿病
205.0
± 85.6△
0.8
±0.8△△**
10.2
± 0.6△△
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12.8
± 1.3△△**
20周WKY
497.7
± 70.3
8.2
±1.7
4.0
±0.8
0.5
±0.1
SHR
329.6
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±100.5△△
4.4
±1.9△△
9.4
±1.4△△
2.3
±0.8
SHR-
糖尿病
247.5
± 85.0△△
1.0
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±0.4△△**
10.0
± 0.6△△
10.0
± 1.5△△**
注：与WKY比△P<0.05，△△P<0.01；与SHR相比*P<0.05，**P<0.01
图2 WKY组20周，正常心肌内冠脉NOS mRNA表达 原位杂交×50
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图3 SHR+糖尿病组20周，心肌内冠脉NOS mRNA表达
图4 WDY组20周，正常心肌阻力血管NOS基因表达
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图5 SHR+糖尿病组20周，心肌阻力血管NOS基因表达
图6 WKY组20周，正常心肌阻力血管ET mRNA表达
图7 SHR+糖尿病组20周，心肌阻力血管ET mRNA表达(图3～7均为原位杂交×100)
三、讨论
本研究成功地复制了链脲佐菌素-SHR-糖尿病模型，20周时心肌间质纤维形成网络状分隔心肌细胞，其心肌细胞及线粒体的变化均提示心肌能量代谢明显障碍[4]，是糖尿病心肌病的病理基础。SHR组及SHR-糖尿病组心肌NO含量及eNOS活性减低，说明2组均有心肌血管内皮受损及功能障碍；高血压及糖尿病同时存在时内皮损害加剧。2组的iNOS活性均明显增高，SHR-糖尿病组心肌i/c比值明显高于SHR组，与其心肌病变程度相平行。由此看出，i/c比值较iNOS活性更能反映心肌病变程度，对评价心肌病变可能会更全面准确。SHR-糖尿病组在冠脉的内皮及平滑肌细胞NOS mRNA表达均下降，在阻力血管内皮NOS mRNA水平降低，而平滑肌细胞内表达无明显变化，说明心肌阻力血管内皮损伤后平滑肌产生的NO对血管扩张起重要作用。两病变组心肌小血管ET mRNA表达增强，SHR组20周时血浆ET水平高于其它2组，说明ET水平增高与高血压直接相关。
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本课题为国家教育部资助项目[编号 教外司留(1996)644]
参考文献
1 Rosen P, Ballhausen T, Stockklauser K. Impairment of endothelium dependent relaxation in the diabetic rat heart: mechanisms and implications. Diabetes Res Clin Pract, 1996, 31(Suppl):S143-S155.
2 Levin ER. Endothelins as cardiovascular peptides. Am J Nephrol, 1996, 16:246-251.
3 张新波，黄海鹭，张灵芝，等. 一氧化氮合成酶(NOS)活性的测定及其应用.北京医科大学学报,1994,26(增刊):173-176.
4 Tomita M, Mukae S, Geshi E, et al. Mitochondrial respiratory impairment in streptozotocin-induced diabetic rat heart. Jpn Circ J，1996，60:673-682.
(收稿：1998-03-30 修回：1999-01-26), 百拇医药
单位：100029 北京，中日友好医院内分泌科(郑旭、李光伟、陈任明、王瑶、杨文英)，病理科(张晶、罗杰、王泰龄)
关键词：
糖尿病和高血压时均有血管内皮功能障碍 糖尿病和高血压时均有血管内皮功能障碍，一氧化氮(NO)与内皮素(ET)失调[1，2]。NO是重要的血管扩张因子，由NO合酶(NOS)催化L-精氨酸生成。我们研究目的在于建立SHR-糖尿病模型，观察高血压合并糖尿病时心肌内NO、ET系统的变化与心肌病变间的关系。
一、材料与方法
1.实验动物：WKY和SHR大鼠 (4～6周龄)42只由中国医学科学院阜外医院提供。SHR大鼠随机分成SHR组和SHR-糖尿病组。后者以链脲佐菌素75 mg/kg溶于0.1 mol/L枸橼酸缓冲液(pH 4.3)中给予SHR大鼠腹腔内一次性注射。于第10周及20周分别取心血作生化检测，并分别取左心室肌置液氮内，用作NO及NOS活性测定；4%甲醛固定，石蜡包埋用作光镜检查及原位杂交；2.5%戊二醛固定做电镜检查。
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2.检测方法：血压测定用RBP-1大鼠尾血压测量仪(我院临床医学研究所生理室研制)。血糖检测用葡萄糖氧化酶法。血浆ET测定采用解放军总医院东亚免疫技术研究所提供的ET放免测定试剂盒。(1)NO测定：将心肌组织块称重、剪碎，按50 mg组织加入含1%牛血清白蛋白的Kreb液，37℃恒温振荡水浴(95%O2-5%CO2)持续平衡孵育90分钟，取孵育液0.1 ml，按Greiss法测终末产物NO2含量，换算为心肌组织释放的NO含量(nmol/g组织)。(2)NOS活性：按文献[3]方法分别测定内皮型NOS(eNOS)和诱导型NOS(iNOS)活性，以每分钟pmol/mg.pr表示。(3)蛋白定量用考马斯亮蓝比色法。(4)原位杂交：石蜡切片厚3 μm，脱蜡后，0.3% H2O2封闭，100 μg/ml蛋白酶K消化，4%多聚甲醛后固定，乙醇脱水，风干。将加热(80℃，5 分钟)后的杂交液(含生物素标记的NOS-cRNA探针，北京医科大学病理系合成)加于玻片上(40 ng/片)杂交。42℃孵育16～20小时。用2×SSC甲酰胺溶液及2×SSC溶液(42℃)洗涤各20 分钟。1%马血清封闭，滴加1∶100ABC液，室温孵育1小时，DAB显色，苏木素复染。去离子甲酰胺、鲑精DNA、二巯基糖醇(DTT)及50%硫酸右旋苷购自美国公司。细胞胞质内棕色颗粒为杂交阳性，依杂交信号强弱分为0～Ⅲ级。(5)光镜检查：切片3 μm厚，做HE及Masson三重染色。(6)超微结构观察：组织块经Epon 812包埋，醋酸铀及枸橼酸铅染色，日本电子1200透射电镜观察。
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3.统计学处理：实验结果以
±s表示，多组资料用SYSTAT统计软件做方差分析。二、结果
SHR组及SHR-糖尿病组血压显著高于WKY组，分别为(209.2±24.8)、(162.0±18.6)及(102.5±9.4) mm Hg。SHR-糖尿病组血糖明显高于WKY组及SHR组，10周时分别为(20.8±2.5)、(7.4±1.2)及(9.7±2.1) mmol/L；20周时分别为(30.5±3.6)、(8.9±1.8)及(10.2±3.3) mmol/L (P<0.001)。血浆ET水平SHR组20周时高于其它两组(P<0.01)，分别为(147.0±33.0)、(95.0±17.0)、(88.0±17.0) pg/ml。
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光镜观察，SHR-糖尿病组有明显的心肌间质纤维化，胶原纤维呈网状分隔心肌细胞(图1)，心内膜下纤维组织增多，此外SHR-糖尿病及SHR组均可见冠脉周围纤维化，间质细胞增多。电镜下观察，SHR-糖尿病组心肌细胞内线粒体增多、肿胀、嵴减少且排列紊乱及空泡形成，心肌细胞水肿，肌纤维断裂，间质胶原纤维增多等。这些改变SHR-糖尿病组明显重于SHR组。
图1 SHR+糖尿病组20周，心肌间质胶原纤维增多 Masson染色×100
心肌NO含量、NOS活性的变化：SHR-糖尿病组NO含量明显降低(P<0.05)，cNOS活性下降(P<0.01)，iNOS活性及i/c比值升高(P<0.01)。SHR组cNOS活性降低程度不及SHR-糖尿病组(P<0.01，表1)。NOS mRNA检测：SHR-糖尿病组冠脉内皮、平滑肌细胞及阻力血管内皮细胞NOSmRNA水平低于WKY组(P<0.05，图2，3)。SHR组，阻力血管平滑肌NOS基因表达低于另2组(P<0.01，图4，5)。ETmRNA检测：10周时SHR组冠脉内皮及平滑肌ET mRNA水平高于WKY组，分别为3.5±0.6和2.2±0.4(P<0.05)。心肌阻力血管内皮及平滑肌ET基因表达，SHR组和SHR-糖尿病组10周时均高于WKY组，分别为2.8±0.5，2.0±0.8和0.8±0.4；20周时分别为3.0±1.4，3.4±0.9和1.7±0.5(P均<0.05，图6，7)。
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表1 心肌NO及NOS活性测定(
±s)组别
NO
(mmol/g)
eNOS
iNOS
(每分钟
pmol/mg.pr)
i/c比值
10周WKY
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450.5
±162.6
8.3
±1.1
4.9
±1.2
0.6
±0.1
SHR
205.7
± 75.7△
4.7
±1.9△△
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9.0
±1.3△△
3.2
±1.1
SHR-
糖尿病
205.0
± 85.6△
0.8
±0.8△△**
10.2
± 0.6△△
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12.8
± 1.3△△**
20周WKY
497.7
± 70.3
8.2
±1.7
4.0
±0.8
0.5
±0.1
SHR
329.6
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±100.5△△
4.4
±1.9△△
9.4
±1.4△△
2.3
±0.8
SHR-
糖尿病
247.5
± 85.0△△
1.0
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±0.4△△**
10.0
± 0.6△△
10.0
± 1.5△△**
注：与WKY比△P<0.05，△△P<0.01；与SHR相比*P<0.05，**P<0.01
图2 WKY组20周，正常心肌内冠脉NOS mRNA表达 原位杂交×50
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图3 SHR+糖尿病组20周，心肌内冠脉NOS mRNA表达
图4 WDY组20周，正常心肌阻力血管NOS基因表达
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图5 SHR+糖尿病组20周，心肌阻力血管NOS基因表达
图6 WKY组20周，正常心肌阻力血管ET mRNA表达
图7 SHR+糖尿病组20周，心肌阻力血管ET mRNA表达(图3～7均为原位杂交×100)
三、讨论
本研究成功地复制了链脲佐菌素-SHR-糖尿病模型，20周时心肌间质纤维形成网络状分隔心肌细胞，其心肌细胞及线粒体的变化均提示心肌能量代谢明显障碍[4]，是糖尿病心肌病的病理基础。SHR组及SHR-糖尿病组心肌NO含量及eNOS活性减低，说明2组均有心肌血管内皮受损及功能障碍；高血压及糖尿病同时存在时内皮损害加剧。2组的iNOS活性均明显增高，SHR-糖尿病组心肌i/c比值明显高于SHR组，与其心肌病变程度相平行。由此看出，i/c比值较iNOS活性更能反映心肌病变程度，对评价心肌病变可能会更全面准确。SHR-糖尿病组在冠脉的内皮及平滑肌细胞NOS mRNA表达均下降，在阻力血管内皮NOS mRNA水平降低，而平滑肌细胞内表达无明显变化，说明心肌阻力血管内皮损伤后平滑肌产生的NO对血管扩张起重要作用。两病变组心肌小血管ET mRNA表达增强，SHR组20周时血浆ET水平高于其它2组，说明ET水平增高与高血压直接相关。
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本课题为国家教育部资助项目[编号 教外司留(1996)644]
参考文献
1 Rosen P, Ballhausen T, Stockklauser K. Impairment of endothelium dependent relaxation in the diabetic rat heart: mechanisms and implications. Diabetes Res Clin Pract, 1996, 31(Suppl):S143-S155.
2 Levin ER. Endothelins as cardiovascular peptides. Am J Nephrol, 1996, 16:246-251.
3 张新波，黄海鹭，张灵芝，等. 一氧化氮合成酶(NOS)活性的测定及其应用.北京医科大学学报,1994,26(增刊):173-176.
4 Tomita M, Mukae S, Geshi E, et al. Mitochondrial respiratory impairment in streptozotocin-induced diabetic rat heart. Jpn Circ J，1996，60:673-682.
(收稿：1998-03-30 修回：1999-01-26), 百拇医药