去纤酶对防止家兔实验性动脉粥样硬化斑块形成的作用
作者：唐亚辉 刘萃 李次芬 李维华
单位：100037 北京，海军总医院肿瘤血液研究室(唐亚辉)；解放军总医院西院B超室(刘萃)，血液科(李次芬)，病理科(李维华)
关键词：蛇毒；动脉粥样硬化；综合预防
New Page 1 【摘要】 目的 研究去纤酶是否具有防止家兔实验性动脉粥样硬化斑块形成的作用。方法 对给药组及对照组模型动物血清总胆固醇含量、主动脉病变面积及胆固醇含量、心壁冠状动脉分支狭窄程度进行定性或定量分析。结果 去纤酶能降低血清及动脉壁的胆固醇含量(P<0.01)，斑块面积明显小于模型对照组(P<0.01)。在胸腹主动脉区各动脉分支开口斑块形成计数中，给药组明显少于对照组。心脏上1/3处横切片显示心壁内冠状动脉大、中分支的狭窄程度，去纤酶组轻于对照组(P<0.01)。结论 去纤酶能有效地抑制动脉粥样硬化斑块的形成和发展。
, 百拇医药
The effect of defibrase in prevention of experimental atherosclerosis in rabbits TANG Yahui*, LIU Cui, LI Cifen,LI Weihua. * Laboratory of Oncology and Hematology, Navy General Hospital, Beijing 100037
【Abstract】 Objective To study the anti-atherosclerosis effect of difibrase in rabbits. Methods Use of computor, light microscope, electron microscope, biochemistry and histochemical methods to identify the total cholesterol (TC) content, mean plaque area in aorta and its cholesterol content, degree of stenosis of coronary arteries of the experimental animals and control animals. Results Defibrase could decrease the mean plaque area of aorta and the TC content in the experimental animal group was less than that in the contorl group (P<0.01). The findings in aortic arches and thoracic aorta were similar to those in the aorta (P<0.05, P<0.01).The number of plaques at the small artery openings in the thoracic aorta and abdominal aorta of the experimental group were less than that of the control group (P<0.01). The cross sections made at the upper third of all hearts showed that the degree of stenosis of coronary artery branches in the heart wall of the experimental group was much less than that of the control group. Conclusion Defibrase can significantly inhibit atherosclerosis.
, 百拇医药
【Key words】 Snake venoms Atherosclerosis Universal precautions
去纤酶是从尖吻蝮蛇毒中分离纯化的类凝血酶，被临床用于抗凝及溶栓治疗，为进一步从整体水平探索去纤酶的治疗作用，我们对去纤酶防治动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)进行了系列研究，本研究旨在观察去纤酶在防治AS中的病理形态学上的变化。
材料与方法
1.分组和给药：雄性新西兰兔30只，体重2.4～2.6 kg。随机分为3组，每组10只，单笼饲养。每天进食总量相等(约100 g)，自由饮水。(1)正常对照组：喂普通颗粒饲料3个月后处死。(2)AS模型对照组：喂胆固醇与普通饲料混合制成的1.5%胆固醇饲料，3个月后处死。(3)预防组：喂法同AS模型对照组，同时1次/5天于兔耳缘静脉缓慢推注1 U/kg去纤酶，注射前用7 ml注射用水溶解去纤酶(去纤酶由云南昆明动物研究所提供，批号：910405)，3个月后处死。
, 百拇医药
2.病理形态观察：解剖处死后的动物，从主动脉起始部到髂总动脉分叉处止，取出整条动脉纵行剖开，置于甲醛溶液中固定，用油红O染色，在计算机图像分析系统(TABS 2000 OPT ON)上计算出斑块面积。另外，计算胸腹主动脉区各动脉分支开口斑块的形成数。在心脏横切面上1/3处取材，石蜡切片、HE染色，光镜电镜观察心壁内冠状动脉大、中分支的狭窄级别和心肌、心内膜的变化。
3.动脉壁胆固醇含量检测：将主动脉壁内、中膜分离，将组织烤干称重、研磨，2∶1甲醇-氯仿液浸泡抽取，利用浸泡液测定主动脉壁胆固醇含量，结果以每克干组织含胆固醇毫克数表示。
4.统计学处理：主动脉、主动脉弓、胸腹主动脉病变面积的百分比及动脉壁胆固醇含量的比较，采用两个样本均数比较的t检验。胸腹主动脉区各动脉分支开口斑块形成率的比较，采用χ2检验。冠状动脉大中分支狭窄级别之比较按等级资料的两样本的秩和检验。
, 百拇医药 结果
1.体重及血清总胆固醇(total serum cholesterol, TC)含量：从实验开始至3个月后，正常对照、AS模型对照组体重及TC均明显升高，其中体重分别增加(0.22±0.04) kg、(0.30±0.03) kg，P值皆小于0.05，然而预防组体重及TC含量升至第2个月时则开始下降，其中体重至3个月后较实验前减少(0.15±0.06) kg (P<0.05)，见表1。
表1 实验前后各组动物体重及TC含量变化(x±s)
组别
只
体重(kg)
TC(mmol/L)
0月
, 百拇医药
3个月
0月
3个月
正常对照
8
3.00±0.04
3.22±0.03
1.30±0.15
2.33±0.25
AS模型
对照
7
3.20±0.05
, 百拇医药
3.50±0.03
1.36±0.14
31.00±2.61*
预防
10
3.04±0.05
2.89±0.06
1.34±0.08
18.40±1.50*△
* 与正常对照组比较P<0.01，△ 与AS模型对照组比较P<0.01
, 百拇医药
2.主动脉病变及主动脉壁胆固醇含量：大体观察，正常对照组内膜光滑，其它两组主动脉内膜可见不同程度的灰白色斑块，呈点、斑条状隆起，表面无明显破溃，病变以主动脉弓最严重，融合成片，另外胸、腹主动脉各动脉分支开口处也较严重，如图1-3所示。
图1 正常对照组：主动脉表面光滑，无任何斑块形成
, 百拇医药
图2 AS模型对照组：主动脉表面可见融合成片的粥样斑块(红色)，主动脉弓及各动脉开口处最明显
图3 预防组：主动脉粥样斑块较轻
主动脉病变面积的百分数预防组小于AS模型对照组(P<0.01)，斑块面积减少56.2%。在主动脉弓区和胸、腹主动脉区，预防组斑块面积也分别减少41.7%、55.9%和71.2%。预防组的主动脉壁胆固醇的含量比AS模型对照组平均减少了51.4%，见表2。
表2 各组动物主动脉病变面积比率及其胆固醇含量比较
组别
动物数
(只)
百分比(%)
, 百拇医药
主动脉
TC含量
(mg/g干重)
主
动脉
主动
脉弓
胸主
动脉
腹主动
脉
正常对照
8
, http://www.100md.com 0
0
0
0
4.3
±0.3
AS模型
对照
7
53.6
±5.8
92.7
±7.5
50.0
, 百拇医药
±6.4
47.0
±8.2
16.8
±1.2*
预防
10
23.5
±4.4△
54.1
±6.3△
22.1
, http://www.100md.com
±6.8△
13.5
±7.4△
8.2
±1.2△*
* 与正常对照组比较P<0.01；△ 与AS模型对照组比较P<0.01
胸主动脉区各动脉分支开口处病变程度预防组明显轻于AS模型对照组，但斑块形成率两组间没有显著差异；腹主动脉区各动脉分支开口斑块形成率预防组明显少于AS模型对照组(χ2检验，P<0.01)，分别为31.50%和78.42%。
3.冠状动脉和心脏病变：冠状动脉肉眼和镜下病变都较轻微，多数冠状动脉分支未见明显的病理变化。预防、AS模型对照组中仅有少数冠状动脉分支可见散在的线状脂质浸润斑，内膜水肿增厚及少量的泡沫细胞形成。AS模型对照组中有个别分支可见大块脂质浸润斑向管腔凸出，严重阻塞冠状动脉，内膜严重水肿和大量泡沫细胞形成。冠状动脉发生严重病变的心肌还可见到缺血性表现，心内膜下心肌纤维化，局灶性巨噬细胞增生及慢性炎性细胞浸润，但未见局部心肌坏死表现。
, 百拇医药
心壁内冠状动脉大、中分支狭窄级别的比较[1]，预防组轻于AS模型对照组，详见表3。在预防组中，狭窄程度少于50%的占91.5%，而AS模型对照组占79.6%；狭窄程度超过75%的AS模型对照组中有18.0%，而预防组中未见有这样的病变。
表3 各组动物心壁冠状动脉分支狭窄程度的比较*
组别
动物数
(只)
动脉分
支数(条)
百分比(%)
无狭窄
, 百拇医药
<25
25～50
51～75
>75
AS模型
对照
7
39
46.1
14.3
19.2
2.4
18.0
, http://www.100md.com
预防
10
45
56.5
24.2
10.8
8.5
0.0
* P<0.01
主动脉病变和冠状动脉狭窄程度是相一致的，从病理结果看，狭窄程度>75%的都发生在主动脉病变较严重的实验动物上。
讨论
本实验结果显示，AS模型对照、预防组动物均有程度不同的粥样斑块病变形成，说明高胆固醇血症是AS发生、发展的始动因素。然而接受去纤酶治疗的动物，虽然不能阻止高胆固醇血症的发生，但其主动脉病变面积减少达56.2%，动脉壁胆固醇含量也平均减少51.4%；在AS好发区主动脉弓和胸腹主动脉区，以及其动脉各分支开口的斑块病变程度及形成率，心壁内冠状动脉大、中分支狭窄程度，预防组都明显地低于AS模型对照组，表明去纤酶具有抗AS的作用。AS的形成和发展是多种因素相互影响的多环节连贯的发展过程，其中脂质和血栓形成[2]起着很重要的作用。先前的研究已证实[3，4]，去纤酶有加强自由基清除剂的作用，减少脂质代谢产物丙二醛的含量，并能抑制TXB2生成，降低血小板粘附，防止血小板活化；同时去纤酶还能大量降解纤维蛋白原，降低血液粘稠度，加强纤溶，从而防止和减缓了AS的发生、发展过程。孙黎光等[5]在研究喂高脂饮食的日本鹌鹑上注射浙江蝮蛇蛇毒(抗栓酶)，发现血清TC，肝脂肪化明显降低。郭淑英等[6]对100例糖尿病合并高血脂症患者，应用抗栓酶治疗后，TC、甘油三酯和β-脂蛋白水平均有下降。去纤酶、抗栓酶都具有类凝血酶样的作用，临床用于溶栓治疗，但为什么引起血脂降低还不清楚，是否与其干扰小肠对TC的吸收或通过对肾上腺素、生长激素、前列腺素等神经体液调节的作用来影响脂类代谢，尚待进一步证明，我们发现的去纤酶组兔的体重降低可能与TC的下降有关。本实验结果为去纤酶预防AS病变的发生、发展提供了一定的实验依据。
, 百拇医药
参考文献
1 陈国伟，主编.现代心脏内科学.长沙：湖南科学技术出版社，1994.374-375.
2 Schwartz CJ. Pathophysiology of the atherogenic process. Am J Cardial, 1989, 64:23G-30G.
3 唐亚辉，李次芬.去纤酶对食饵性高血脂兔脂质过氧化及前列腺素代谢的影响.中草药杂志，1998，29(增刊)：103-105.
4 唐亚辉，李次芬.去纤酶对高血脂兔血小板功能，纤溶系统，血液流变学的影响.中国病理生理杂志，1997，13：137-140.
5 Sun LG, Hao WX, Shih JCH, et al. Effect of snake venom of Agkistrodon halys on AS and blood characteristics in Japanese quail. Atherosclerosis, 1990, 84:129-134.
6 郭淑英.抗栓酶-3号治疗糖尿病并发症及其对血浆6-keto-PGF1, TXB2, FN和血脂的影响.中国医科大学学报，1991，20：68-70.
(收稿：1998-05-10 修回：1998-12-16), http://www.100md.com
单位：100037 北京，海军总医院肿瘤血液研究室(唐亚辉)；解放军总医院西院B超室(刘萃)，血液科(李次芬)，病理科(李维华)
关键词：蛇毒；动脉粥样硬化；综合预防
New Page 1 【摘要】 目的 研究去纤酶是否具有防止家兔实验性动脉粥样硬化斑块形成的作用。方法 对给药组及对照组模型动物血清总胆固醇含量、主动脉病变面积及胆固醇含量、心壁冠状动脉分支狭窄程度进行定性或定量分析。结果 去纤酶能降低血清及动脉壁的胆固醇含量(P<0.01)，斑块面积明显小于模型对照组(P<0.01)。在胸腹主动脉区各动脉分支开口斑块形成计数中，给药组明显少于对照组。心脏上1/3处横切片显示心壁内冠状动脉大、中分支的狭窄程度，去纤酶组轻于对照组(P<0.01)。结论 去纤酶能有效地抑制动脉粥样硬化斑块的形成和发展。
, 百拇医药
The effect of defibrase in prevention of experimental atherosclerosis in rabbits TANG Yahui*, LIU Cui, LI Cifen,LI Weihua. * Laboratory of Oncology and Hematology, Navy General Hospital, Beijing 100037
【Abstract】 Objective To study the anti-atherosclerosis effect of difibrase in rabbits. Methods Use of computor, light microscope, electron microscope, biochemistry and histochemical methods to identify the total cholesterol (TC) content, mean plaque area in aorta and its cholesterol content, degree of stenosis of coronary arteries of the experimental animals and control animals. Results Defibrase could decrease the mean plaque area of aorta and the TC content in the experimental animal group was less than that in the contorl group (P<0.01). The findings in aortic arches and thoracic aorta were similar to those in the aorta (P<0.05, P<0.01).The number of plaques at the small artery openings in the thoracic aorta and abdominal aorta of the experimental group were less than that of the control group (P<0.01). The cross sections made at the upper third of all hearts showed that the degree of stenosis of coronary artery branches in the heart wall of the experimental group was much less than that of the control group. Conclusion Defibrase can significantly inhibit atherosclerosis.
, 百拇医药
【Key words】 Snake venoms Atherosclerosis Universal precautions
去纤酶是从尖吻蝮蛇毒中分离纯化的类凝血酶，被临床用于抗凝及溶栓治疗，为进一步从整体水平探索去纤酶的治疗作用，我们对去纤酶防治动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)进行了系列研究，本研究旨在观察去纤酶在防治AS中的病理形态学上的变化。
材料与方法
1.分组和给药：雄性新西兰兔30只，体重2.4～2.6 kg。随机分为3组，每组10只，单笼饲养。每天进食总量相等(约100 g)，自由饮水。(1)正常对照组：喂普通颗粒饲料3个月后处死。(2)AS模型对照组：喂胆固醇与普通饲料混合制成的1.5%胆固醇饲料，3个月后处死。(3)预防组：喂法同AS模型对照组，同时1次/5天于兔耳缘静脉缓慢推注1 U/kg去纤酶，注射前用7 ml注射用水溶解去纤酶(去纤酶由云南昆明动物研究所提供，批号：910405)，3个月后处死。
, 百拇医药
2.病理形态观察：解剖处死后的动物，从主动脉起始部到髂总动脉分叉处止，取出整条动脉纵行剖开，置于甲醛溶液中固定，用油红O染色，在计算机图像分析系统(TABS 2000 OPT ON)上计算出斑块面积。另外，计算胸腹主动脉区各动脉分支开口斑块的形成数。在心脏横切面上1/3处取材，石蜡切片、HE染色，光镜电镜观察心壁内冠状动脉大、中分支的狭窄级别和心肌、心内膜的变化。
3.动脉壁胆固醇含量检测：将主动脉壁内、中膜分离，将组织烤干称重、研磨，2∶1甲醇-氯仿液浸泡抽取，利用浸泡液测定主动脉壁胆固醇含量，结果以每克干组织含胆固醇毫克数表示。
4.统计学处理：主动脉、主动脉弓、胸腹主动脉病变面积的百分比及动脉壁胆固醇含量的比较，采用两个样本均数比较的t检验。胸腹主动脉区各动脉分支开口斑块形成率的比较，采用χ2检验。冠状动脉大中分支狭窄级别之比较按等级资料的两样本的秩和检验。
, 百拇医药 结果
1.体重及血清总胆固醇(total serum cholesterol, TC)含量：从实验开始至3个月后，正常对照、AS模型对照组体重及TC均明显升高，其中体重分别增加(0.22±0.04) kg、(0.30±0.03) kg，P值皆小于0.05，然而预防组体重及TC含量升至第2个月时则开始下降，其中体重至3个月后较实验前减少(0.15±0.06) kg (P<0.05)，见表1。
表1 实验前后各组动物体重及TC含量变化(x±s)
组别
只
体重(kg)
TC(mmol/L)
0月
, 百拇医药
3个月
0月
3个月
正常对照
8
3.00±0.04
3.22±0.03
1.30±0.15
2.33±0.25
AS模型
对照
7
3.20±0.05
, 百拇医药
3.50±0.03
1.36±0.14
31.00±2.61*
预防
10
3.04±0.05
2.89±0.06
1.34±0.08
18.40±1.50*△
* 与正常对照组比较P<0.01，△ 与AS模型对照组比较P<0.01
, 百拇医药
2.主动脉病变及主动脉壁胆固醇含量：大体观察，正常对照组内膜光滑，其它两组主动脉内膜可见不同程度的灰白色斑块，呈点、斑条状隆起，表面无明显破溃，病变以主动脉弓最严重，融合成片，另外胸、腹主动脉各动脉分支开口处也较严重，如图1-3所示。
图1 正常对照组：主动脉表面光滑，无任何斑块形成
, 百拇医药
图2 AS模型对照组：主动脉表面可见融合成片的粥样斑块(红色)，主动脉弓及各动脉开口处最明显
图3 预防组：主动脉粥样斑块较轻
主动脉病变面积的百分数预防组小于AS模型对照组(P<0.01)，斑块面积减少56.2%。在主动脉弓区和胸、腹主动脉区，预防组斑块面积也分别减少41.7%、55.9%和71.2%。预防组的主动脉壁胆固醇的含量比AS模型对照组平均减少了51.4%，见表2。
表2 各组动物主动脉病变面积比率及其胆固醇含量比较
组别
动物数
(只)
百分比(%)
, 百拇医药
主动脉
TC含量
(mg/g干重)
主
动脉
主动
脉弓
胸主
动脉
腹主动
脉
正常对照
8
, http://www.100md.com 0
0
0
0
4.3
±0.3
AS模型
对照
7
53.6
±5.8
92.7
±7.5
50.0
, 百拇医药
±6.4
47.0
±8.2
16.8
±1.2*
预防
10
23.5
±4.4△
54.1
±6.3△
22.1
, http://www.100md.com
±6.8△
13.5
±7.4△
8.2
±1.2△*
* 与正常对照组比较P<0.01；△ 与AS模型对照组比较P<0.01
胸主动脉区各动脉分支开口处病变程度预防组明显轻于AS模型对照组，但斑块形成率两组间没有显著差异；腹主动脉区各动脉分支开口斑块形成率预防组明显少于AS模型对照组(χ2检验，P<0.01)，分别为31.50%和78.42%。
3.冠状动脉和心脏病变：冠状动脉肉眼和镜下病变都较轻微，多数冠状动脉分支未见明显的病理变化。预防、AS模型对照组中仅有少数冠状动脉分支可见散在的线状脂质浸润斑，内膜水肿增厚及少量的泡沫细胞形成。AS模型对照组中有个别分支可见大块脂质浸润斑向管腔凸出，严重阻塞冠状动脉，内膜严重水肿和大量泡沫细胞形成。冠状动脉发生严重病变的心肌还可见到缺血性表现，心内膜下心肌纤维化，局灶性巨噬细胞增生及慢性炎性细胞浸润，但未见局部心肌坏死表现。
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心壁内冠状动脉大、中分支狭窄级别的比较[1]，预防组轻于AS模型对照组，详见表3。在预防组中，狭窄程度少于50%的占91.5%，而AS模型对照组占79.6%；狭窄程度超过75%的AS模型对照组中有18.0%，而预防组中未见有这样的病变。
表3 各组动物心壁冠状动脉分支狭窄程度的比较*
组别
动物数
(只)
动脉分
支数(条)
百分比(%)
无狭窄
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<25
25～50
51～75
>75
AS模型
对照
7
39
46.1
14.3
19.2
2.4
18.0
, http://www.100md.com
预防
10
45
56.5
24.2
10.8
8.5
0.0
* P<0.01
主动脉病变和冠状动脉狭窄程度是相一致的，从病理结果看，狭窄程度>75%的都发生在主动脉病变较严重的实验动物上。
讨论
本实验结果显示，AS模型对照、预防组动物均有程度不同的粥样斑块病变形成，说明高胆固醇血症是AS发生、发展的始动因素。然而接受去纤酶治疗的动物，虽然不能阻止高胆固醇血症的发生，但其主动脉病变面积减少达56.2%，动脉壁胆固醇含量也平均减少51.4%；在AS好发区主动脉弓和胸腹主动脉区，以及其动脉各分支开口的斑块病变程度及形成率，心壁内冠状动脉大、中分支狭窄程度，预防组都明显地低于AS模型对照组，表明去纤酶具有抗AS的作用。AS的形成和发展是多种因素相互影响的多环节连贯的发展过程，其中脂质和血栓形成[2]起着很重要的作用。先前的研究已证实[3，4]，去纤酶有加强自由基清除剂的作用，减少脂质代谢产物丙二醛的含量，并能抑制TXB2生成，降低血小板粘附，防止血小板活化；同时去纤酶还能大量降解纤维蛋白原，降低血液粘稠度，加强纤溶，从而防止和减缓了AS的发生、发展过程。孙黎光等[5]在研究喂高脂饮食的日本鹌鹑上注射浙江蝮蛇蛇毒(抗栓酶)，发现血清TC，肝脂肪化明显降低。郭淑英等[6]对100例糖尿病合并高血脂症患者，应用抗栓酶治疗后，TC、甘油三酯和β-脂蛋白水平均有下降。去纤酶、抗栓酶都具有类凝血酶样的作用，临床用于溶栓治疗，但为什么引起血脂降低还不清楚，是否与其干扰小肠对TC的吸收或通过对肾上腺素、生长激素、前列腺素等神经体液调节的作用来影响脂类代谢，尚待进一步证明，我们发现的去纤酶组兔的体重降低可能与TC的下降有关。本实验结果为去纤酶预防AS病变的发生、发展提供了一定的实验依据。
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参考文献
1 陈国伟，主编.现代心脏内科学.长沙：湖南科学技术出版社，1994.374-375.
2 Schwartz CJ. Pathophysiology of the atherogenic process. Am J Cardial, 1989, 64:23G-30G.
3 唐亚辉，李次芬.去纤酶对食饵性高血脂兔脂质过氧化及前列腺素代谢的影响.中草药杂志，1998，29(增刊)：103-105.
4 唐亚辉，李次芬.去纤酶对高血脂兔血小板功能，纤溶系统，血液流变学的影响.中国病理生理杂志，1997，13：137-140.
5 Sun LG, Hao WX, Shih JCH, et al. Effect of snake venom of Agkistrodon halys on AS and blood characteristics in Japanese quail. Atherosclerosis, 1990, 84:129-134.
6 郭淑英.抗栓酶-3号治疗糖尿病并发症及其对血浆6-keto-PGF1, TXB2, FN和血脂的影响.中国医科大学学报，1991，20：68-70.
(收稿：1998-05-10 修回：1998-12-16), http://www.100md.com