结直肠癌、结直肠腺瘤微卫星不稳定性检测及其临床意义
作者：阎晓初 陈意生 柳凤轩 罗元辉 贺光友 鲁荣 房殿春
单位：400038 重庆，第三军医大学附属西南医院病理科(阎晓初、柳凤轩、贺光友)，基础部病理学教研室(陈意生)，消化内科(罗元辉、鲁荣、房殿春)
关键词：结肠直肠肿瘤；基因缺失；增殖细胞核抗原；预后
中华病理学杂志/990204 【摘要】 目的 探讨微卫星不稳定性(MSI)在结直肠癌发生中的意义及其与结直肠癌细胞增殖活性和预后的关系。方法 采用聚合酶链反应-简单序列长度多态性(PCR-SSLP)及免疫组化SP方法，对56例结直肠癌、9例腺瘤及6例腺瘤癌变的MSI和增殖细胞核抗原(PCNA)表达进行了检测。结果 显示结直肠癌MSI总阳性率44.64%(25/56例),其中, 遗传性非息肉病性结直肠癌3/4例阳性，散发性结直肠癌22/52例阳性，结直肠腺瘤2/9例阳性，腺瘤癌变2/6例阳性。MSI阳性结直肠癌的PCNA标记指数显著低于MSI阴性者(P<0.01)，MSI阳性结直肠癌患者3、5年生存率高于MSI阴性患者。结论 MSI可能是结直肠癌发生的早期分子改变和又一种分子机制, MSI阳性结直肠癌细胞增殖活性较低,预后较好,MSI检测可能有助于结直肠癌预后的判断。
, http://www.100md.com
The detection of microsatellite instability in carcinoma and adenoma of large bowel and its significance YAN Xiaochu*, CHEN Yisheng, LIU Fengxuan, LUO Yuanhui, HE Guangyou, LU Rong, FANG Dianchun. * Department of Pathology, Southwest Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400038
【Abstract】 Objective To explore the role of microsatellite instability (MSI) in colorectal carcinogenesis and the relationship between MSI, proliferation activity and prognosis. Methods PCR-SSLP and immunohistochemistry methods were used to detect MSI and the expression of PCNA in 56 cases of carcinomas, 9 cases of adenomas and 6 cases of adenomas with malignant changes. Results The total positive rate of MSI were 25/56 cases in colorectal carcinomas. The MSI positive cases were 3/4 in HNPCCs, 22/52 in sporadic colorectal carcinomas, 2/9 in adenomas and 2/6 in adenoma with malignant changes respectively. The PCNA labelling index of MSI positive tumors were significantly lower than that of MSI negative tumors (P<0.01). The 3 and 5 year survival rates in patients with MSI positive colorectal carcinomas were higher than those of MSI negative tumors. Conclusion MSI may be an early molecular alteration and another molecular mechanism in colorectal carcinogenesis. The MSI positive tumors have low proliferating activity and a better clinical outcome. The detection of MSI might be useful in predicting prognosis of colorectal carcinomas.
, 百拇医药
【Key words】 Colorectal neoplasms Gene deletion Proliferating cell nuclear antigen Prognosis
结直肠癌系消化道常见的恶性肿瘤之一,其发生机制颇为复杂,研究表明结直肠癌的发生与癌基因激活和抑癌基因失活有关[1]。但最近发现遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC)和部分散发性结直肠癌的发生与上述基因关系不大，而是由于错配修复基因突变引起微卫星不稳定性(microsatellite instability, MSI)所致[2，3]。为此，我们采用聚合酶链反应-简单序列长度多态性(PCR-SSLP)和免疫组化SP方法对结直肠癌、结直肠腺瘤及其癌变的MSI和增殖细胞核抗原(PCNA)进行检测,探讨MSI在结直肠癌发生中的意义及其与结直肠癌细胞增殖活性和预后的关系。
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材料与方法
1.标本：收集我院1987～1996年间手术切除的结直肠癌56例，结直肠腺瘤9例(不典型增生Ⅰ级3例,Ⅱ级4例,Ⅲ级2例)，腺瘤癌变6例，每例同时取残端正常粘膜组织。所有结直肠癌病例均获得随访结果，随访时间20～87个月，平均45.6个月，经家族史调查确诊为HNPCC 4例，散发性结直肠癌52例。
2.MSI检测方法:(1)DNA提取：新鲜、石蜡组织连续切片10～15张，厚度5 μm，参照文献报道的微切割技术[4],采集结直肠癌、腺瘤、腺瘤癌变及正常结直肠粘膜组织。采用蛋白酶K消化、苯酚-氯仿抽提法提取基因组DNA。(2)微卫星 DNA引物：由中科院上海细胞所合成。碱基序列为：D18S34(5′-CAG AAA ATT CTC CTG GCT A-3′, 5′-CTC ATG TTC CTG GCA AGA AT-3′); D17S799(5′-ATT GCC AGC CGT CAG TT-3′,5′GAC CAG CAT ATC ATT ATA GAC AA-3′); D5S409 (5′-GAA GGG ATG AAG TGT GGA TT-3′,5′-TCA AGG ACT GTA GGA TGG CA-3′); TCF-2(5′-GAC CCC ACA GCC TAT TCA GA-3′,5′-TTG ACT GCT GAA CGG CTG CA-3′); p53(5′-AGG GAT ACT ATT CAG CCC GAG GTG-3′,5′-ACT GCC ACT CCT TGC CCC ATT C-3′); Rb(5′-CCT ATC TCC GGC TAA ATA C-3′,5′-AAT TAA CAA GGT GTG GTG G-3′)。(3)PCR扩增与分析：采用美国2400型PCR仪扩增，反应总体积为20 μl，视引物不同设定循环参数，分别为94℃，40秒～1分钟；52℃～56℃，40秒～1分钟；72℃，1～2分钟,共35～40次循环。取PCR扩增产物10 μl,加入到10%变性聚丙烯酰胺凝胶孔中，4℃下100～250 V，电泳5 小时。取下凝胶银染显色。结果判定：每例标本中，肿瘤组织与其相对应的正常组织相比，出现额外的DNA等位片段或等位片段出现缺失即为MSI阳性。
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3.免疫组化染色：采用SP法进行抗PCNA(PC10)单克隆抗体染色，DAB显色。结果分析采用计数PCNA标记指数(labeling index, LI)方法，即平均每100个细胞中PCNA阳性细胞数。
4.统计学处理：采用χ2, t检验和Kaplan-Meier生存率曲线分析和log rank检验。
结果
一、结直肠肿瘤组织MSI检出率
56例结直肠癌中各微卫星位点MSI检出率(图1～4)分别为D18S34 25.00%(14/56例), D17S799 21.43%(12/56例), D5S409 16.07%(9/56例), TCF-2 21.43%(12/56例), p53 23.21%(13/56例)及Rb 17.86%(10/56例)。分析6个位点共检出MSI 25例，总阳性率为44.64%，其中1个位点MSI阳性7例，2个及以上位点MSI阳性18例。HNPCC中，MSI阳性3/4例，均为2个及以上位点阳性；散发性结直肠癌中,1个位点阳性7/52例,2个及以上位点阳性15/52例，占28.85%。9例结直肠腺瘤中，检出1个位点MSI阳性2例，分别为Ⅰ、Ⅱ级不典型增生；6例腺瘤癌变检出MSI阳性2例，分别为1个和2个位点阳性。
, 百拇医药
M：标准DNA，N：正常组织，T：癌组织
图1 结直肠癌D18S34位点微卫星不稳定性
M：标准DNA，N：正常组织，T：癌组织
图2 结直肠癌D5S409微卫星DNA不稳定性
M：标准DNA，N：正常组织，T：癌组织
图3 结直肠癌p53微卫星DNA不稳定性
M：标准DNA，N：正常组织，T：癌组织
, 百拇医药
图4 结直肠癌Rb微卫星DNA不稳定性
二、MSI与结直肠癌临床病理参数和PCNA 表达的关系(表1)表1 结直肠癌临床病理参数与MSI的关系 临床病理指标
总例数
MSI
阴性
阳性
(1个位点)
阳性
(≥2个位点)
性别
男
, 百拇医药 29
19
3
7
女
27
12
4
11
年龄(岁，
±s)
52.4±14.0
51.3±16.1
, 百拇医药
52.6±10.6
部位
左半结肠
30
23
4
3
右半结肠
26
8
3
15
大小(cm)
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≤5.0
29
16
3
10
>5.0
27
15
4
8
组织学类型
高分化腺癌
13
, http://www.100md.com 11
0
2
中分化腺癌
22
14
2
6
低分化腺癌
15
3
4
8
粘液腺癌
, 百拇医药
6
3
1
2
Dukes分期
A期
9
8
0
1
B期
22
8
3
, 百拇医药
11
C期
19
10
4
5
D期
6
5
0
1
PCNA LI(±s)
, 百拇医药
58.5±14.3
45.9±17.0
46.1±12.2
在不同性别、年龄结直肠癌患者间MSI的发生率无显著性差异，MSI的发生与肿瘤大小无关，而与肿瘤发生部位显著相关，其中右半结肠癌MSI阳性18/26例，占69.23%，左半结肠癌MSI阳性7/30例，占23.33%，经χ2检验两者间相差非常显著(P<0.01)。低分化腺癌和粘液腺癌MSI阳性率71.42%(15/21例)显著高于高、中分化腺癌阳性率28.57% (10/35例，P<0.01)。MSI阳性结直肠癌主要为Dukes B、C期。
本组结直肠癌PCNA呈不同程度的表达(图5)，25例MSI阳性结直肠癌中，无论1个位点或2个及以上位点MSI阳性者,其PCNA LI均较MSI阴性结直肠癌低(表1)，经统计学处理MSI阴性组PCNA LI均值显著高于MSI阳性组(P<0.01)。
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图5 腺瘤癌变，PCNA显示细胞核弥漫性阳性表达 SP法×200
三、MSI与结直肠癌预后的关系
56例结直肠癌经随访死亡15例，其中MSI阴性结直肠癌死亡11/31例，占35.48%；MSI阳性者死亡4/25例，占16.00%，经统计学处理两者间差异无显著性(P>0.05)。计算1个位点MSI阳性结直肠癌患者术后3、5年生存率分别为83.71%和63.43%；2个及以上位点MSI阳性患者3、5年生存率分别为93.44%、83.89%；而MSI阴性者3年生存率为71.19%，5年生存率为58.51%。其中2个及以上位点MSI阳性结直肠癌患者5年生存率较MSI阴性者显著增高(P<0.05)。Kaplan-Meier生存率曲线分析，也显示MSI阳性结直肠癌患者的预后较MSI阴性患者佳。
讨论
MSI是由于复制差错引起的DNA简单重复序列的扩增或丢失，表现为肿瘤组织与其相对应的非肿瘤组织DNA结构性等位基因的大小发生改变。最近国外研究发现MSI与HNPCC发生密切相关[2，3]。HNPCC约占结直肠癌病例的5%～15%，其MSI发生率相当高，约为70.00%～90.00%[5]，而散发性结直肠癌MSI发生率相对较低，约10.00%～15.00%[3]，我们的研究检测56例结直肠癌，MSI总发生率为44.64%,其中HNPCC发生率为3/4例，与文献报道相吻合；散发性结直肠癌2个或2个以上位点MSI发生率为28.85%,略高于文献报道频率。其原因可能与受检者种族、地理环境或检测位点的不同有关。MSI作为HNPCC和部分散发性结直肠癌特有的改变，提示其为结直肠癌发生又一种新的分子机制，同时MSI检测也可能成为结直肠癌普查和高危人群筛选的一种新手段。
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有关结直肠腺瘤MSI的研究，国外报道相对较少,其发生频率也不一致，约为0%～10%，个别报道在HNPCC家族中腺瘤MSI发生率可高达57%，对于腺瘤中出现MSI的意义，目前仍有争议[5，6]。我们检测9例腺瘤和6例腺瘤癌变的MSI，显示其阳性分别为2/9例和2/6例。并在腺瘤不典型增生中检测出MSI，提示MSI可能参与了结直肠癌的早期形成，为结直肠癌发生的早期事件。
Aaltonen等[5]报道HNPCC MSI发生主要位于近端结肠。Kim等[7]对散发性结直肠癌MSI检测显示，MSI阳性肿瘤中近端结肠癌占94%，且MSI阳性患者年龄较阴性者年轻。本研究结果显示,右半结肠癌MSI阳性率为69.23%，显著高于左半结肠癌(23.33%)。提示MSI与右半结肠癌的发生有关。同时也观察到低分化腺癌和粘液腺癌MSI阳性率显著高于高、中分化腺癌(P<0.01)，与文献报道吻合[7]。
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有关MSI与细胞增殖活性的关系，Bocker等[8]采用流式细胞计DNA倍体测定与结直肠癌MSI比较研究，显示MSI阳性结直肠癌主要为二倍体，而阴性者常呈异倍体。Meltzer等[9]对食管癌研究也发现在多数二倍体肿瘤中常伴有MSI存在，提出MSI是异倍体肿瘤发生前存在于二倍体肿瘤细胞中的早期分子标记。在本实验中采用PCNA LI与MSI对比分析，显示MSI阴性结直肠癌PCNA LI显著高于MSI阳性结直肠癌，提示MSI阳性结直肠癌的细胞增殖活性较低，其生物学行为较好。此外，对检测MSI的56例结直肠癌随访观察显示，MSI阳性肿瘤3、5年生存率均高于MSI阴性肿瘤，提示MSI与结直肠癌的预后有关，通过对其检测可能有助于结直肠癌预后判断。
我们研究显示MSI阳性结直肠癌多为低分化腺癌和粘液腺癌，且增殖活性较低，预后相对较佳，与国外文献报道一致[10]，其原因仍不清楚。最近有些研究发现MSI阳性的低分化腺癌，具有间质血管明显减少，常伴有Crohn病样淋巴细胞浸润，使宿主对癌细胞免疫反应增强；DNA多为二倍体以及很少发生p53基因突变等特点[7，10]。这些改变可能对降低癌增殖活性和改善癌预后具有作用。
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参考文献
1 Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell, 1990,61:759-767.
2 Aaltonen LA, Peltomaki P, Leach FS, et al. Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer. Science, 1993, 260:812-816.
3 Kullmann F, Bocker T, Scholmerich J, et al. Microsatellite instability-a new aspects in genetics and molecular biology of hereditary nonpolyposis and sporadic colorectal tumors. Z Gastroenterol, 1996, 34: 813-822.
, 百拇医药
4 Zhuang Z, Bertheau P, Emmert-Buck MR, et al. A microdissection technique for archival DNA analysis of specific cell polulations in lesions <1 mm in size. Am J Pathol, 1995,146:620-625.
5 Aaltonen LA, Peltomaki P, Mecklin JP,et al. Replication errors in benign and malignant tumors from hereditary nonpolyposis colorectal cancer patients. Cancer Res, 1994, 54:1645-1648.
6 Samowitz WS, Slattery ML. Microsatellite instability in colorectal adenomas. Gastroenterology, 1997,112:1515-1519.
, 百拇医药
7 Kim H, Jen J, Vogelstein B, et al. Clinical and pathological characteristics of sporadic colorectal carcinomas with DNA replication errors in microsatellite sequences. Am J Pathol, 1994, 145:148-156.
8 Bocker T, Schlegel J, Kullmann F, et al. Genomic instability in colorectal carcinomas: comparison of different evaluation methods and their biological significance. J Pathol,1996, 179: 15-19.
9 Meltzer SJ, Yin J, Manin B, et al. Microsatellite instability occurs frequently and in both diploid and aneuploid cell populations of Barrett's-associated esophageal adenocarcinomas.Cancer Res, 1994 , 54: 3379-3382.
10 Forster S, Sattler HP, Hack M, et al. Microsatellite instability in sporadic carcinomas of the proximal colon: association with diploid DNA content, negative protein expression of p53, and distinct histomorphologic features. Surgery, 1998,123: 13-18.
(收稿：1998-07-30 修回：1998-12-21), 百拇医药
单位：400038 重庆，第三军医大学附属西南医院病理科(阎晓初、柳凤轩、贺光友)，基础部病理学教研室(陈意生)，消化内科(罗元辉、鲁荣、房殿春)
关键词：结肠直肠肿瘤；基因缺失；增殖细胞核抗原；预后
中华病理学杂志/990204 【摘要】 目的 探讨微卫星不稳定性(MSI)在结直肠癌发生中的意义及其与结直肠癌细胞增殖活性和预后的关系。方法 采用聚合酶链反应-简单序列长度多态性(PCR-SSLP)及免疫组化SP方法，对56例结直肠癌、9例腺瘤及6例腺瘤癌变的MSI和增殖细胞核抗原(PCNA)表达进行了检测。结果 显示结直肠癌MSI总阳性率44.64%(25/56例),其中, 遗传性非息肉病性结直肠癌3/4例阳性，散发性结直肠癌22/52例阳性，结直肠腺瘤2/9例阳性，腺瘤癌变2/6例阳性。MSI阳性结直肠癌的PCNA标记指数显著低于MSI阴性者(P<0.01)，MSI阳性结直肠癌患者3、5年生存率高于MSI阴性患者。结论 MSI可能是结直肠癌发生的早期分子改变和又一种分子机制, MSI阳性结直肠癌细胞增殖活性较低,预后较好,MSI检测可能有助于结直肠癌预后的判断。
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The detection of microsatellite instability in carcinoma and adenoma of large bowel and its significance YAN Xiaochu*, CHEN Yisheng, LIU Fengxuan, LUO Yuanhui, HE Guangyou, LU Rong, FANG Dianchun. * Department of Pathology, Southwest Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400038
【Abstract】 Objective To explore the role of microsatellite instability (MSI) in colorectal carcinogenesis and the relationship between MSI, proliferation activity and prognosis. Methods PCR-SSLP and immunohistochemistry methods were used to detect MSI and the expression of PCNA in 56 cases of carcinomas, 9 cases of adenomas and 6 cases of adenomas with malignant changes. Results The total positive rate of MSI were 25/56 cases in colorectal carcinomas. The MSI positive cases were 3/4 in HNPCCs, 22/52 in sporadic colorectal carcinomas, 2/9 in adenomas and 2/6 in adenoma with malignant changes respectively. The PCNA labelling index of MSI positive tumors were significantly lower than that of MSI negative tumors (P<0.01). The 3 and 5 year survival rates in patients with MSI positive colorectal carcinomas were higher than those of MSI negative tumors. Conclusion MSI may be an early molecular alteration and another molecular mechanism in colorectal carcinogenesis. The MSI positive tumors have low proliferating activity and a better clinical outcome. The detection of MSI might be useful in predicting prognosis of colorectal carcinomas.
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【Key words】 Colorectal neoplasms Gene deletion Proliferating cell nuclear antigen Prognosis
结直肠癌系消化道常见的恶性肿瘤之一,其发生机制颇为复杂,研究表明结直肠癌的发生与癌基因激活和抑癌基因失活有关[1]。但最近发现遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC)和部分散发性结直肠癌的发生与上述基因关系不大，而是由于错配修复基因突变引起微卫星不稳定性(microsatellite instability, MSI)所致[2，3]。为此，我们采用聚合酶链反应-简单序列长度多态性(PCR-SSLP)和免疫组化SP方法对结直肠癌、结直肠腺瘤及其癌变的MSI和增殖细胞核抗原(PCNA)进行检测,探讨MSI在结直肠癌发生中的意义及其与结直肠癌细胞增殖活性和预后的关系。
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材料与方法
1.标本：收集我院1987～1996年间手术切除的结直肠癌56例，结直肠腺瘤9例(不典型增生Ⅰ级3例,Ⅱ级4例,Ⅲ级2例)，腺瘤癌变6例，每例同时取残端正常粘膜组织。所有结直肠癌病例均获得随访结果，随访时间20～87个月，平均45.6个月，经家族史调查确诊为HNPCC 4例，散发性结直肠癌52例。
2.MSI检测方法:(1)DNA提取：新鲜、石蜡组织连续切片10～15张，厚度5 μm，参照文献报道的微切割技术[4],采集结直肠癌、腺瘤、腺瘤癌变及正常结直肠粘膜组织。采用蛋白酶K消化、苯酚-氯仿抽提法提取基因组DNA。(2)微卫星 DNA引物：由中科院上海细胞所合成。碱基序列为：D18S34(5′-CAG AAA ATT CTC CTG GCT A-3′, 5′-CTC ATG TTC CTG GCA AGA AT-3′); D17S799(5′-ATT GCC AGC CGT CAG TT-3′,5′GAC CAG CAT ATC ATT ATA GAC AA-3′); D5S409 (5′-GAA GGG ATG AAG TGT GGA TT-3′,5′-TCA AGG ACT GTA GGA TGG CA-3′); TCF-2(5′-GAC CCC ACA GCC TAT TCA GA-3′,5′-TTG ACT GCT GAA CGG CTG CA-3′); p53(5′-AGG GAT ACT ATT CAG CCC GAG GTG-3′,5′-ACT GCC ACT CCT TGC CCC ATT C-3′); Rb(5′-CCT ATC TCC GGC TAA ATA C-3′,5′-AAT TAA CAA GGT GTG GTG G-3′)。(3)PCR扩增与分析：采用美国2400型PCR仪扩增，反应总体积为20 μl，视引物不同设定循环参数，分别为94℃，40秒～1分钟；52℃～56℃，40秒～1分钟；72℃，1～2分钟,共35～40次循环。取PCR扩增产物10 μl,加入到10%变性聚丙烯酰胺凝胶孔中，4℃下100～250 V，电泳5 小时。取下凝胶银染显色。结果判定：每例标本中，肿瘤组织与其相对应的正常组织相比，出现额外的DNA等位片段或等位片段出现缺失即为MSI阳性。
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3.免疫组化染色：采用SP法进行抗PCNA(PC10)单克隆抗体染色，DAB显色。结果分析采用计数PCNA标记指数(labeling index, LI)方法，即平均每100个细胞中PCNA阳性细胞数。
4.统计学处理：采用χ2, t检验和Kaplan-Meier生存率曲线分析和log rank检验。
结果
一、结直肠肿瘤组织MSI检出率
56例结直肠癌中各微卫星位点MSI检出率(图1～4)分别为D18S34 25.00%(14/56例), D17S799 21.43%(12/56例), D5S409 16.07%(9/56例), TCF-2 21.43%(12/56例), p53 23.21%(13/56例)及Rb 17.86%(10/56例)。分析6个位点共检出MSI 25例，总阳性率为44.64%，其中1个位点MSI阳性7例，2个及以上位点MSI阳性18例。HNPCC中，MSI阳性3/4例，均为2个及以上位点阳性；散发性结直肠癌中,1个位点阳性7/52例,2个及以上位点阳性15/52例，占28.85%。9例结直肠腺瘤中，检出1个位点MSI阳性2例，分别为Ⅰ、Ⅱ级不典型增生；6例腺瘤癌变检出MSI阳性2例，分别为1个和2个位点阳性。
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M：标准DNA，N：正常组织，T：癌组织
图1 结直肠癌D18S34位点微卫星不稳定性
M：标准DNA，N：正常组织，T：癌组织
图2 结直肠癌D5S409微卫星DNA不稳定性
M：标准DNA，N：正常组织，T：癌组织
图3 结直肠癌p53微卫星DNA不稳定性
M：标准DNA，N：正常组织，T：癌组织
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图4 结直肠癌Rb微卫星DNA不稳定性
二、MSI与结直肠癌临床病理参数和PCNA 表达的关系(表1)表1 结直肠癌临床病理参数与MSI的关系 临床病理指标
总例数
MSI
阴性
阳性
(1个位点)
阳性
(≥2个位点)
性别
男
, 百拇医药 29
19
3
7
女
27
12
4
11
年龄(岁，
±s)52.4±14.0
51.3±16.1
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52.6±10.6
部位
左半结肠
30
23
4
3
右半结肠
26
8
3
15
大小(cm)
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≤5.0
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3
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组织学类型
高分化腺癌
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0
2
中分化腺癌
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14
2
6
低分化腺癌
15
3
4
8
粘液腺癌
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6
3
1
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Dukes分期
A期
9
8
0
1
B期
22
8
3
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11
C期
19
10
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D期
6
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PCNA LI(
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58.5±14.3
45.9±17.0
46.1±12.2
在不同性别、年龄结直肠癌患者间MSI的发生率无显著性差异，MSI的发生与肿瘤大小无关，而与肿瘤发生部位显著相关，其中右半结肠癌MSI阳性18/26例，占69.23%，左半结肠癌MSI阳性7/30例，占23.33%，经χ2检验两者间相差非常显著(P<0.01)。低分化腺癌和粘液腺癌MSI阳性率71.42%(15/21例)显著高于高、中分化腺癌阳性率28.57% (10/35例，P<0.01)。MSI阳性结直肠癌主要为Dukes B、C期。
本组结直肠癌PCNA呈不同程度的表达(图5)，25例MSI阳性结直肠癌中，无论1个位点或2个及以上位点MSI阳性者,其PCNA LI均较MSI阴性结直肠癌低(表1)，经统计学处理MSI阴性组PCNA LI均值显著高于MSI阳性组(P<0.01)。
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图5 腺瘤癌变，PCNA显示细胞核弥漫性阳性表达 SP法×200
三、MSI与结直肠癌预后的关系
56例结直肠癌经随访死亡15例，其中MSI阴性结直肠癌死亡11/31例，占35.48%；MSI阳性者死亡4/25例，占16.00%，经统计学处理两者间差异无显著性(P>0.05)。计算1个位点MSI阳性结直肠癌患者术后3、5年生存率分别为83.71%和63.43%；2个及以上位点MSI阳性患者3、5年生存率分别为93.44%、83.89%；而MSI阴性者3年生存率为71.19%，5年生存率为58.51%。其中2个及以上位点MSI阳性结直肠癌患者5年生存率较MSI阴性者显著增高(P<0.05)。Kaplan-Meier生存率曲线分析，也显示MSI阳性结直肠癌患者的预后较MSI阴性患者佳。
讨论
MSI是由于复制差错引起的DNA简单重复序列的扩增或丢失，表现为肿瘤组织与其相对应的非肿瘤组织DNA结构性等位基因的大小发生改变。最近国外研究发现MSI与HNPCC发生密切相关[2，3]。HNPCC约占结直肠癌病例的5%～15%，其MSI发生率相当高，约为70.00%～90.00%[5]，而散发性结直肠癌MSI发生率相对较低，约10.00%～15.00%[3]，我们的研究检测56例结直肠癌，MSI总发生率为44.64%,其中HNPCC发生率为3/4例，与文献报道相吻合；散发性结直肠癌2个或2个以上位点MSI发生率为28.85%,略高于文献报道频率。其原因可能与受检者种族、地理环境或检测位点的不同有关。MSI作为HNPCC和部分散发性结直肠癌特有的改变，提示其为结直肠癌发生又一种新的分子机制，同时MSI检测也可能成为结直肠癌普查和高危人群筛选的一种新手段。
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有关结直肠腺瘤MSI的研究，国外报道相对较少,其发生频率也不一致，约为0%～10%，个别报道在HNPCC家族中腺瘤MSI发生率可高达57%，对于腺瘤中出现MSI的意义，目前仍有争议[5，6]。我们检测9例腺瘤和6例腺瘤癌变的MSI，显示其阳性分别为2/9例和2/6例。并在腺瘤不典型增生中检测出MSI，提示MSI可能参与了结直肠癌的早期形成，为结直肠癌发生的早期事件。
Aaltonen等[5]报道HNPCC MSI发生主要位于近端结肠。Kim等[7]对散发性结直肠癌MSI检测显示，MSI阳性肿瘤中近端结肠癌占94%，且MSI阳性患者年龄较阴性者年轻。本研究结果显示,右半结肠癌MSI阳性率为69.23%，显著高于左半结肠癌(23.33%)。提示MSI与右半结肠癌的发生有关。同时也观察到低分化腺癌和粘液腺癌MSI阳性率显著高于高、中分化腺癌(P<0.01)，与文献报道吻合[7]。
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有关MSI与细胞增殖活性的关系，Bocker等[8]采用流式细胞计DNA倍体测定与结直肠癌MSI比较研究，显示MSI阳性结直肠癌主要为二倍体，而阴性者常呈异倍体。Meltzer等[9]对食管癌研究也发现在多数二倍体肿瘤中常伴有MSI存在，提出MSI是异倍体肿瘤发生前存在于二倍体肿瘤细胞中的早期分子标记。在本实验中采用PCNA LI与MSI对比分析，显示MSI阴性结直肠癌PCNA LI显著高于MSI阳性结直肠癌，提示MSI阳性结直肠癌的细胞增殖活性较低，其生物学行为较好。此外，对检测MSI的56例结直肠癌随访观察显示，MSI阳性肿瘤3、5年生存率均高于MSI阴性肿瘤，提示MSI与结直肠癌的预后有关，通过对其检测可能有助于结直肠癌预后判断。
我们研究显示MSI阳性结直肠癌多为低分化腺癌和粘液腺癌，且增殖活性较低，预后相对较佳，与国外文献报道一致[10]，其原因仍不清楚。最近有些研究发现MSI阳性的低分化腺癌，具有间质血管明显减少，常伴有Crohn病样淋巴细胞浸润，使宿主对癌细胞免疫反应增强；DNA多为二倍体以及很少发生p53基因突变等特点[7，10]。这些改变可能对降低癌增殖活性和改善癌预后具有作用。
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参考文献
1 Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell, 1990,61:759-767.
2 Aaltonen LA, Peltomaki P, Leach FS, et al. Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer. Science, 1993, 260:812-816.
3 Kullmann F, Bocker T, Scholmerich J, et al. Microsatellite instability-a new aspects in genetics and molecular biology of hereditary nonpolyposis and sporadic colorectal tumors. Z Gastroenterol, 1996, 34: 813-822.
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4 Zhuang Z, Bertheau P, Emmert-Buck MR, et al. A microdissection technique for archival DNA analysis of specific cell polulations in lesions <1 mm in size. Am J Pathol, 1995,146:620-625.
5 Aaltonen LA, Peltomaki P, Mecklin JP,et al. Replication errors in benign and malignant tumors from hereditary nonpolyposis colorectal cancer patients. Cancer Res, 1994, 54:1645-1648.
6 Samowitz WS, Slattery ML. Microsatellite instability in colorectal adenomas. Gastroenterology, 1997,112:1515-1519.
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7 Kim H, Jen J, Vogelstein B, et al. Clinical and pathological characteristics of sporadic colorectal carcinomas with DNA replication errors in microsatellite sequences. Am J Pathol, 1994, 145:148-156.
8 Bocker T, Schlegel J, Kullmann F, et al. Genomic instability in colorectal carcinomas: comparison of different evaluation methods and their biological significance. J Pathol,1996, 179: 15-19.
9 Meltzer SJ, Yin J, Manin B, et al. Microsatellite instability occurs frequently and in both diploid and aneuploid cell populations of Barrett's-associated esophageal adenocarcinomas.Cancer Res, 1994 , 54: 3379-3382.
10 Forster S, Sattler HP, Hack M, et al. Microsatellite instability in sporadic carcinomas of the proximal colon: association with diploid DNA content, negative protein expression of p53, and distinct histomorphologic features. Surgery, 1998,123: 13-18.
(收稿：1998-07-30 修回：1998-12-21), 百拇医药