迎接新世纪，提高分子病理学研究水平
作者：郑杰 陈杰
单位：郑杰(北京医科大学病理系 100083)；陈杰(北京协和医院病理科)
关键词：
中华病理学杂志000103 在进入一个新千年之际，回眸20世纪病理学的发展，不难看出20世纪前半段是细胞病理学充实和发展阶段，20世纪中叶由于电子显微镜的问世超微病理学得到了迅猛发展，最令人兴奋不已的是近30年随着细胞生物学、免疫学、遗传学和分子生物学的进步，推动了分子病理学的形成和不断充实。分子病理学的出现使人们得以在蛋白质和核酸等分子水平上研究疾病的病因、发病机制及其发生和发展规律，并逐渐应用到疾病的诊断、治疗方案的制定和疾病的预后判断等许多领域。
但是分子病理学还处在新生期，还很不完善。这是由于人们对构成人类基因组的14～15万个基因的绝大多数尚未破译[1]。功能基因组计划将大大推动对基因功能的研究。目前国际上提出的cDNA和基因表达片段(EST)序列资源共享动议必然会加快功能基因组计划的进程。对疾病的认识完成从表型向基因型的过渡，病理学工作者责无旁贷，这也是病理学发展的极好契机。中华病理学杂志在去年召开的围绕p53、端粒酶和细胞凋亡的专题研讨会就是为了推动分子病理学的发展，促进基础理论和临床应用研究的进步。
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20年来国际范围内p53 基因的研究已取得了很多进展，但进程并没有结束。近来在4个方面的研究中不断深入：(1) p53 基因特定突变的功能意义：对p53 基因175密码子的各种突变均进行了深入的研究，例如由精氨酸到酪氨酸的突变使p53 基因的细胞周期阻滞和促进细胞凋亡的功能均丧失；由精氨酸到赖氨酸的突变使p53 基因保留细胞周期阻滞功能，却使其促进细胞凋亡的功能丧失；而由精氨酸到半胱氨酸的突变使p53 基因的细胞周期阻滞和促进细胞凋亡的功能不仅均保留，而且由于蛋白产物的半衰期延长，而使其野生型功能得以加强[2]。最后一种突变也可称为假突变，以这种假突变型p53 基因转染肿瘤细胞有着极强的肿瘤抑制作用[3]。这种假突变型p53 基因可调控表达载体的构建，会在肿瘤基因治疗中发挥更大的作用。(2) p53 基因与p33基因的协同作用：p33基因与p53 基因有着相似的功能， p53与p33蛋白在功能上具有相互依存的关系，即这一对伴侣在发挥肿瘤抑制作用方面是缺一不可的。在另一部分肿瘤中 p53 基因的肿瘤抑制作用依赖于WT1。因此推测 p53 蛋白必须与p33或WT1蛋白形成复合体才能发挥作用[4]。 (3) p53 基因与mdm2的关系：mdm2在正常细胞核内阻断p53基因的转录激活作用，并携带p53 蛋白至细胞质，通过蛋白酶体而被降解。阻断mdm2携带的p53 蛋白向细胞质内转运必将导致p53 蛋白功能的增强[5，6]。(4) p53 蛋白的激活：p53 蛋白在产生时是以无活性的形式存在的，当需要其发挥生长阻滞和调节凋亡时，可通过共价或非共价修饰而使p53 蛋白激活，其中丝氨酸残基磷酸化是重要的一环[6]。上述进展大多偏于理论研究，可能在目前阶段国内多数单位还较难开展，但是国内病例多是其优势，目前已有些蛋白表达水平乃至基因转染方面的研究，若能组织多单位合作，将免疫组化检测蛋白表达水平与基因突变检测(如单链构象多态性、变性剂梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳和序列分析)相结合，并取得随访资料，对探求 p53 基因和基因产物在病理诊断和预后判断方面的应用价值，仍具有十分重要的意义。
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细胞凋亡与细胞增殖是维持机体稳态的两个重要方面。细胞凋亡不仅存在于生理情况下，而且广泛存在于病理情况下。就肿瘤而言，既存在着细胞的过度增殖，也存在着细胞凋亡的阻抑。近来人们除了注意到凋亡的特异性的形态学改变外，还广泛地研究了细胞凋亡的生物化学改变。caspases是一组钙离子依赖性、具有门冬氨酸特异性细胞质内蛋白酶，至少有10种参与细胞凋亡的级联反应。其中caspase 3 (CPP32)为某些因子(如肿瘤坏死因子和Fas)诱导细胞凋亡所必需的。caspase 3的底物是与DNA修复有关PARP (poly-ADP-ribose polymerase)。Western印迹免疫细胞化学可定性检测caspase 3活性，因为caspase 3可将相对分子质量为113 000的PARP水解为相对分子质量为89 000和24 000的片段。但绝大多数底物并不是仅仅被单一“特异性”caspase所水解，只是主要被“特异性”caspase水解，其他caspases也能水解这些底物。最近提出的FIEA (fluorometric immunosorbent enzyme assay) 法可通过caspase 3特异性抗体将caspase 3结合于多孔板，然后结合于多孔板的caspase 3将底物Ac-DEVD-AFC水解，释放出游离荧光分子AFC，能定量检测caspase 3活性。凋亡细胞的另一种生物化学改变是细胞膜内层的磷脂酰丝氨酸外翻至细胞膜外，有利于巨噬细胞的识别和吞噬。膜联蛋白5 (annexin-5) 是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，具有与磷脂酰丝氨酸高亲和性结合的特性，通过绿色荧光分子FLUOS或红色荧光分子AlexaTM568可在原位或通过流式细胞术检测凋亡细胞。凋亡细胞内还表现为以核小体为单位切割染色体的核酸内切酶活化，以及与细胞质内蛋白质交联有关的转谷氨酰胺酶活性增加。这些生物化学改变不仅使我们深化了对细胞凋亡本质的认识，而且为细胞凋亡的检测提供了新的方法。现在我们可以应用形态和机能、定性和定量、原位和非原位等多种方法来检测细胞凋亡，使凋亡细胞的检测更具科学性，也可以避免单一细胞凋亡检测方法的局限性。这样才能去伪存真，得到符合科学的结论。对于病理学工作者来说，更应注意到细胞凋亡与细胞坏死的区别。在通过流式细胞术检测细胞凋亡峰时，由于坏死组织的细胞碎片会干扰凋亡细胞峰的检测，若同时用锥虫蓝(又称胎盘蓝)拒染试验的活细胞百分比加以校正，可使结果更加准确[7]。
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端粒酶在几乎所有类型的肿瘤均有不同程度的表达，是目前已知的最广谱的恶性肿瘤的标志。其特异性为91%，敏感性为85%，阳性预测值为91%，阴性预测值为81%。但是近来发现除了生殖细胞、淋巴细胞和某些干细胞有端粒酶的表达外，子宫内膜、子宫颈和皮肤上皮、增生的肝组织和支气管上皮等组织也有一定程度的表达，提示目前检测实体瘤端粒酶水平仅仅是肿瘤诊断的一种辅助手段。由于最近有实验证明端粒酶作为多种致细胞恶性转化因素之一，可使正常细胞完全转化，进一步引起人们的关注。通过阻断RNA模板来抑制端粒酶的活性，特别是应用肽核酸(PNA)可以比寡聚核苷酸更特异而有效地抑制端粒酶活性。抑制端粒酶活性的另一个靶点是端粒酶和DNA的结合位点。抑制端粒酶活性的第3个靶点是采用细胞分化诱导剂抑制端粒酶活性。由于PCR-TRAP方法检测端粒酶活性尚不能准确的定量，而且对待检标本的质量要求较高，目前研究所检测的样本数量也常常较少而缺乏前瞻性研究，使端粒酶与肿瘤预后关系的研究受到限制。若能建立较准确的端粒酶定量方法，端粒酶与肿瘤预后关系的研究将是大有可为的[8]。
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以上无论p53研究，还是凋亡抑或端粒酶的研究，国内都已有了很好的基础，从某一个层面看也有了较多的研究，但应注意研究的开拓性，尤其应注意研究材料的质量、研究方法的标准化。在研究技术路线上，应特别注意DNA、mRNA和蛋白质水平相结合；分子、细胞和整体水平相结合。在分析方法上应注意将检验项目放在复杂的多因素分析系统中检验。只要我们勤奋工作，实事求是，我们仍然可以大有作为。p53、端粒酶和细胞凋亡的研究仅仅代表着分子病理学研究的一个小小的侧面。让我们在这个知识爆炸的新世纪中，不断吸取生物医学的新进展，并发挥我们的优势，为分子病理学的发展作出应有的贡献。
参考文献：
[1]Dickson D. Gene estimate rises as US and UK discuss freedom of access. Nature, 1999, 401:311.
[2]Ryan KM , Vousden KH. Characterization of structural p53 mutants which show selective defects in apoptosis but not cell cycle arrest. Mol Cell Biol, 1998, 18:3692-2698.
, 百拇医药
[3]谢建武，方伟岗，惠培，等. 特异点突变型p53 minigene 对人肺癌PG细胞的转染效应. 中华医学杂志，1999，79:57-60.
[4]Garkavtsev I, Grigorian IA, Ossovskaya VS, et al. The candidate tumor suppressor p33ing1 cooperates with p53 in cell growth control. Nature, 1998, 391:295-298.
[5]Prives C. Signaling to p53: breaking the MDM2-p53 circuit. Cell, 1998, 95:5-8.
[6]Freedman DA, Levine AJ. Regulation of the p53 protein by the MDM2 oncoprotein-thirty-eighth G.H.A. Clowes Memorial Award Lecture. Cancer Res, 1999, 59:1-7.
[7]王申五，武莎莎. 凋亡与肿瘤. 中华肿瘤杂志，1999, 21:308-309.
[8]周春晓，陆士新，孙建衡. 端粒酶在肿瘤研究中的意义. 中华肿瘤杂志，1999, 21:235-237.
收稿日期：1999-12-03, http://www.100md.com
单位：郑杰(北京医科大学病理系 100083)；陈杰(北京协和医院病理科)
关键词：
中华病理学杂志000103 在进入一个新千年之际，回眸20世纪病理学的发展，不难看出20世纪前半段是细胞病理学充实和发展阶段，20世纪中叶由于电子显微镜的问世超微病理学得到了迅猛发展，最令人兴奋不已的是近30年随着细胞生物学、免疫学、遗传学和分子生物学的进步，推动了分子病理学的形成和不断充实。分子病理学的出现使人们得以在蛋白质和核酸等分子水平上研究疾病的病因、发病机制及其发生和发展规律，并逐渐应用到疾病的诊断、治疗方案的制定和疾病的预后判断等许多领域。
但是分子病理学还处在新生期，还很不完善。这是由于人们对构成人类基因组的14～15万个基因的绝大多数尚未破译[1]。功能基因组计划将大大推动对基因功能的研究。目前国际上提出的cDNA和基因表达片段(EST)序列资源共享动议必然会加快功能基因组计划的进程。对疾病的认识完成从表型向基因型的过渡，病理学工作者责无旁贷，这也是病理学发展的极好契机。中华病理学杂志在去年召开的围绕p53、端粒酶和细胞凋亡的专题研讨会就是为了推动分子病理学的发展，促进基础理论和临床应用研究的进步。
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20年来国际范围内p53 基因的研究已取得了很多进展，但进程并没有结束。近来在4个方面的研究中不断深入：(1) p53 基因特定突变的功能意义：对p53 基因175密码子的各种突变均进行了深入的研究，例如由精氨酸到酪氨酸的突变使p53 基因的细胞周期阻滞和促进细胞凋亡的功能均丧失；由精氨酸到赖氨酸的突变使p53 基因保留细胞周期阻滞功能，却使其促进细胞凋亡的功能丧失；而由精氨酸到半胱氨酸的突变使p53 基因的细胞周期阻滞和促进细胞凋亡的功能不仅均保留，而且由于蛋白产物的半衰期延长，而使其野生型功能得以加强[2]。最后一种突变也可称为假突变，以这种假突变型p53 基因转染肿瘤细胞有着极强的肿瘤抑制作用[3]。这种假突变型p53 基因可调控表达载体的构建，会在肿瘤基因治疗中发挥更大的作用。(2) p53 基因与p33基因的协同作用：p33基因与p53 基因有着相似的功能， p53与p33蛋白在功能上具有相互依存的关系，即这一对伴侣在发挥肿瘤抑制作用方面是缺一不可的。在另一部分肿瘤中 p53 基因的肿瘤抑制作用依赖于WT1。因此推测 p53 蛋白必须与p33或WT1蛋白形成复合体才能发挥作用[4]。 (3) p53 基因与mdm2的关系：mdm2在正常细胞核内阻断p53基因的转录激活作用，并携带p53 蛋白至细胞质，通过蛋白酶体而被降解。阻断mdm2携带的p53 蛋白向细胞质内转运必将导致p53 蛋白功能的增强[5，6]。(4) p53 蛋白的激活：p53 蛋白在产生时是以无活性的形式存在的，当需要其发挥生长阻滞和调节凋亡时，可通过共价或非共价修饰而使p53 蛋白激活，其中丝氨酸残基磷酸化是重要的一环[6]。上述进展大多偏于理论研究，可能在目前阶段国内多数单位还较难开展，但是国内病例多是其优势，目前已有些蛋白表达水平乃至基因转染方面的研究，若能组织多单位合作，将免疫组化检测蛋白表达水平与基因突变检测(如单链构象多态性、变性剂梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳和序列分析)相结合，并取得随访资料，对探求 p53 基因和基因产物在病理诊断和预后判断方面的应用价值，仍具有十分重要的意义。
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细胞凋亡与细胞增殖是维持机体稳态的两个重要方面。细胞凋亡不仅存在于生理情况下，而且广泛存在于病理情况下。就肿瘤而言，既存在着细胞的过度增殖，也存在着细胞凋亡的阻抑。近来人们除了注意到凋亡的特异性的形态学改变外，还广泛地研究了细胞凋亡的生物化学改变。caspases是一组钙离子依赖性、具有门冬氨酸特异性细胞质内蛋白酶，至少有10种参与细胞凋亡的级联反应。其中caspase 3 (CPP32)为某些因子(如肿瘤坏死因子和Fas)诱导细胞凋亡所必需的。caspase 3的底物是与DNA修复有关PARP (poly-ADP-ribose polymerase)。Western印迹免疫细胞化学可定性检测caspase 3活性，因为caspase 3可将相对分子质量为113 000的PARP水解为相对分子质量为89 000和24 000的片段。但绝大多数底物并不是仅仅被单一“特异性”caspase所水解，只是主要被“特异性”caspase水解，其他caspases也能水解这些底物。最近提出的FIEA (fluorometric immunosorbent enzyme assay) 法可通过caspase 3特异性抗体将caspase 3结合于多孔板，然后结合于多孔板的caspase 3将底物Ac-DEVD-AFC水解，释放出游离荧光分子AFC，能定量检测caspase 3活性。凋亡细胞的另一种生物化学改变是细胞膜内层的磷脂酰丝氨酸外翻至细胞膜外，有利于巨噬细胞的识别和吞噬。膜联蛋白5 (annexin-5) 是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，具有与磷脂酰丝氨酸高亲和性结合的特性，通过绿色荧光分子FLUOS或红色荧光分子AlexaTM568可在原位或通过流式细胞术检测凋亡细胞。凋亡细胞内还表现为以核小体为单位切割染色体的核酸内切酶活化，以及与细胞质内蛋白质交联有关的转谷氨酰胺酶活性增加。这些生物化学改变不仅使我们深化了对细胞凋亡本质的认识，而且为细胞凋亡的检测提供了新的方法。现在我们可以应用形态和机能、定性和定量、原位和非原位等多种方法来检测细胞凋亡，使凋亡细胞的检测更具科学性，也可以避免单一细胞凋亡检测方法的局限性。这样才能去伪存真，得到符合科学的结论。对于病理学工作者来说，更应注意到细胞凋亡与细胞坏死的区别。在通过流式细胞术检测细胞凋亡峰时，由于坏死组织的细胞碎片会干扰凋亡细胞峰的检测，若同时用锥虫蓝(又称胎盘蓝)拒染试验的活细胞百分比加以校正，可使结果更加准确[7]。
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端粒酶在几乎所有类型的肿瘤均有不同程度的表达，是目前已知的最广谱的恶性肿瘤的标志。其特异性为91%，敏感性为85%，阳性预测值为91%，阴性预测值为81%。但是近来发现除了生殖细胞、淋巴细胞和某些干细胞有端粒酶的表达外，子宫内膜、子宫颈和皮肤上皮、增生的肝组织和支气管上皮等组织也有一定程度的表达，提示目前检测实体瘤端粒酶水平仅仅是肿瘤诊断的一种辅助手段。由于最近有实验证明端粒酶作为多种致细胞恶性转化因素之一，可使正常细胞完全转化，进一步引起人们的关注。通过阻断RNA模板来抑制端粒酶的活性，特别是应用肽核酸(PNA)可以比寡聚核苷酸更特异而有效地抑制端粒酶活性。抑制端粒酶活性的另一个靶点是端粒酶和DNA的结合位点。抑制端粒酶活性的第3个靶点是采用细胞分化诱导剂抑制端粒酶活性。由于PCR-TRAP方法检测端粒酶活性尚不能准确的定量，而且对待检标本的质量要求较高，目前研究所检测的样本数量也常常较少而缺乏前瞻性研究，使端粒酶与肿瘤预后关系的研究受到限制。若能建立较准确的端粒酶定量方法，端粒酶与肿瘤预后关系的研究将是大有可为的[8]。
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以上无论p53研究，还是凋亡抑或端粒酶的研究，国内都已有了很好的基础，从某一个层面看也有了较多的研究，但应注意研究的开拓性，尤其应注意研究材料的质量、研究方法的标准化。在研究技术路线上，应特别注意DNA、mRNA和蛋白质水平相结合；分子、细胞和整体水平相结合。在分析方法上应注意将检验项目放在复杂的多因素分析系统中检验。只要我们勤奋工作，实事求是，我们仍然可以大有作为。p53、端粒酶和细胞凋亡的研究仅仅代表着分子病理学研究的一个小小的侧面。让我们在这个知识爆炸的新世纪中，不断吸取生物医学的新进展，并发挥我们的优势，为分子病理学的发展作出应有的贡献。
参考文献：
[1]Dickson D. Gene estimate rises as US and UK discuss freedom of access. Nature, 1999, 401:311.
[2]Ryan KM , Vousden KH. Characterization of structural p53 mutants which show selective defects in apoptosis but not cell cycle arrest. Mol Cell Biol, 1998, 18:3692-2698.
, 百拇医药
[3]谢建武，方伟岗，惠培，等. 特异点突变型p53 minigene 对人肺癌PG细胞的转染效应. 中华医学杂志，1999，79:57-60.
[4]Garkavtsev I, Grigorian IA, Ossovskaya VS, et al. The candidate tumor suppressor p33ing1 cooperates with p53 in cell growth control. Nature, 1998, 391:295-298.
[5]Prives C. Signaling to p53: breaking the MDM2-p53 circuit. Cell, 1998, 95:5-8.
[6]Freedman DA, Levine AJ. Regulation of the p53 protein by the MDM2 oncoprotein-thirty-eighth G.H.A. Clowes Memorial Award Lecture. Cancer Res, 1999, 59:1-7.
[7]王申五，武莎莎. 凋亡与肿瘤. 中华肿瘤杂志，1999, 21:308-309.
[8]周春晓，陆士新，孙建衡. 端粒酶在肿瘤研究中的意义. 中华肿瘤杂志，1999, 21:235-237.
收稿日期：1999-12-03, http://www.100md.com