分子生物学技术及其在核医学上的应用
作者：田靫 潘德思
单位：北京,中国医学科学院、中国协和医科大学阜外心血管病医院生化研究室 100037
关键词：
中华核医学杂志000420 近20年来,以DNA重组技术的发展和应用为标志,分子生物学在理论和应用上都取得了重要进展,并逐步扩展到生命科学研究的一切领域,包括与人类生存质量直接相关的医学领域。目前核医学发展的一个重要领域就是分子核医学。本文简要介绍一些分子生物学的基本理论和方法及其在分子核医学中的应用。
一、分子生物学技术
1. 重组DNA和扩增技术。重组DNA技术是分子生物学的基础,它是将外源DNA(单个基因,DNA片段或染色体片段)通过连接反应插入某种载体(质粒、噬菌体、粘粒或人工染色体等),并转化相应的宿主细胞(细菌、噬菌体或真核细胞等),使外源DNA得以在体外长期保存和随时进行操作[1]。将目标基因与适当的载体连接构建为重组载体即基因克隆,在此基础上进行后续的研究。在研究中往往需要大量的目标DNA,应运而生了DNA扩增技术。常用的DNA扩增技术是通过重组质粒的大量复制而得到大量插入DNA片段;另外常用的方法是PCR扩增即多聚酶链式反应,它是利用1对与目标DNA双链5′端序列相同的寡核苷酸片段作为引物,通过DNA聚合酶进行延伸反应,从而得到1段与目标DNA在两引物间序列相同的复制品。1个常规的PCR循环包括3个步骤,即变性、退火或复性、延伸反应。1次PCR反应往往采用30个循环,每一循环的产物可作为下一步循环的模板,目标DNA片段即得到大量复制,数量可达2×(106～107)拷贝。DNA重组技术和PCR扩增技术使得分子生物学技术被广泛应用。
, 百拇医药
2. 分离目标基因。在重组DNA和PCR扩增技术基础上,可进行多项研究,例如疾病相关基因的分离[2]。在生物体内,基因首先转录为mRNA,然后翻译成蛋白质从而行使其特定功能。因此,要分离得到疾病的相关基因,需要建立相应的基因(cDNA)文库,即从相应组织或细胞中提取mRNA,并将其反转录为双链cDNA。将所有的cDNA片段利用重组技术克隆到适当的载体上,然后以重组子转化宿主菌,这样就可建立1个cDNA文库,其中含有所用组织和细胞中的所有表达序列,包括要分离的目标基因。从cDNA文库中分离目标基因可以采用许多方法,例如用包含该基因序列的基因组DNA或以同源基因的cDNA片段作为探针,通过杂交从文库中钓取相应的cDNA;利用基因表达产物的抗体通过免疫印迹获得相应的cDNA克隆;利用基因的表达变化通过差减杂交或差异显示PCR(DD-PCR)的方法分离目的基因。另外还可用mRNA分子为材料直接分离基因,如根据已知的序列或同源的基因序列,采用反转录PCR的方法获得目的基因。分离目标基因是整个研究的关键步骤,采用何种方法取决于基因本身和已有的实验条件。
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3. 基因序列测定。得到疾病相关基因后的第一步工作就是序列测定[1]。测序的方法有化学断裂法和双脱氧核苷终止法,后者最为常用。其基本原理是在DNA聚合反应的链延伸过程中引入双脱氧核苷酸底物,这种底物在脱氧核糖的3′羟基位点脱氧化,不能参与随后的延伸反应,从而终止链的延伸。这样加入不同的双脱氧底物,使合成的DNA链在不同位点终止,不同长度的DNA链通过变性胶电泳分离并按顺序进行排列,即得出所测样品的核苷酸序列。序列测定可在实验室进行手工测序,也可通过自动测序仪进行。有了相关基因的序列资料就可以进行各种分析,包括同源性比较和基因结构、功能预测。
4. 基因的表达分析。细胞内的基因表达分析是将重组的表达载体转染培养细胞,并在其中表达目的基因,通过观察细胞表型或功能变化来推测该基因可能具有的功能。但在细胞模型中的结果还需要在体内作进一步鉴定,常用的是转基因动物模型[3]。转基因技术可分为在动物体内转入目的基因和失活体内原有基因2种方法。在人类疾病相关基因的研究中所使用的转基因动物模型较多。转基因动物是指以实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代。可建立不同的转基因动物模型如小鼠、大鼠直到大动物,以研究外源基因在整体动物中的表达调控规律。建立转基因动物的方法主要有显微注射法、反转录病毒感染法与胚胎干细胞法,较为常用和成熟的方法是显微注射法。其一般程序是首先构建表达载体,并从载体上卸下目的基因DNA片段,纯化、定量后留待显微注射用。在显微注射仪下将目的DNA片段注射入2个极核期的受精卵中,培养后移入假孕母鼠的输卵管或子宫内,成活后鉴定其是否为转基因动物。存活的转基因动物可将遗传信息遗传给后代。失活体内原有基因的方法即基因敲除(knock-out)方法,是近年来发展起来的新技术,是通过导入基因使目的基因失活。正是通过引入目的基因和失活目的基因,使转基因后动物生理或病理状况发生改变,从而确认该基因在动物体内的功能。但由于动物与人类的种属差异,一些在动物体内得到的结论不能完全照搬到人身上,分析这类实验结果时必须慎重。
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5. 基因的表达调控。在确证基因功能的同时,对基因的表达调控的研究也很重要[4],特别是对于疾病相关基因的研究,往往能提供一些新的治疗方法的线索,如人为地改变基因的表达水平来达到治疗目的。研究基因的表达调控包括顺式调控元件(启动子、增强子等)和反式作用因子(各种DNA结合蛋白)的鉴定。前者可以通过构建含有报告基因并拼接有各种顺式调控元件的重组质粒转染细胞,从报告基因的表达变化来寻找其中的调控序列;或者根据已知的调控蛋白,采用DNasel足迹法确定相应的蛋白质结合区域。后者可利用其通过结合DNA来调节基因表达特点,采用酵母双杂交体系统分离。总之,一个基因从最初的分离到最后的功能鉴定和表达调控分析,需用多种分子生物学方法。
二、分子生物学在核医学的应用
核医学以其无创伤性,能反映脏器的功能和代谢情况,在临床医学及其基础研究中有着毋庸置疑的优势。而核医学中引入分子生物学方法已越来越普遍。从90年代始,核医学已跨入了分子核医学的时代,成为药物作用原理、细胞和基因水平调控、疾病发生的分子机制等研究的有效手段。分子核医学可从生理和生化的水平认识疾病,提供疾病变化的分子信息,以帮助诊断、治疗及对疗效作出正确评价。尤其在受体显像和受体介导的治疗技术、基因显像和相关的治疗技术、放射免疫显像和治疗及代谢显像等方面已有许多成功的临床应用。
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1. 受体显像。受体与配体的结合涉及细胞之间及细胞与其他分子间的识别,介导着信息跨膜转导和细胞的生理病理反应等生命基本现象。用放射性核素标记的配体在体内直接探测受体,这是分子核医学发展的新领域,实际上受体显像已在各种肿瘤和其他疾病的诊断以及基础医学研究等方面有许多成功的报道。如利用知母甙元可促进脑受体形成、提高脑受体密度、改善老年人脑功能障碍的机制就是由此发现的[6]。另外放射性药物的开发[5]也可以利用其能特异地与某种细胞受体结合,达到定点探测的目的,这在肿瘤诊断治疗上有重要的应用前景。
2. 放射免疫显像。放射免疫显像的原理与受体显像相似,只不过将受体和配体反应改为抗原抗体反应,利用放射性核素标记的识别特定抗原的抗体或其片段对相应的组织或细胞进行定位。与后者一样,放射免疫显像也可以利用肿瘤特异的抗原成分,通过抗体标记进行诊断和定位,且也可用于放射性治疗。
3. 基因显像。基因显像是反义技术和核医学结合的产物,它是利用标记的短链反义核苷酸与体内基因表达产物mRNA结合,从而将目标基因进行定位。如用111In[7]、99Tcm[8]标记反义寡核苷酸探针,通过体内分子杂交和体外显像,显示肿瘤发生时呈超表达状态的mRNA,达到早期诊断肿瘤的目的。另外,用发射α、β或俄歇电子的放射性核素进行标记,定向到达肿瘤组织,可抑制癌基因的过度表达,进而抑制癌细胞的增殖;又可利用放射性核素的电离辐射生物效应,破坏癌细胞,达到反义治疗和内照射治疗的双重目的。这方面的研究已在细胞水平、动物水平做了大量实验,在临床上也做了一些有益的尝试,可能会成为治疗肿瘤的理想方法。
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4. 代谢显像。代谢显像是利用病变或其他靶组织或细胞所特有的代谢特点,通过放射性核素标记的代谢前体对其进行定位。如肿瘤组织代谢活跃,体内注入18F-脱氧葡萄糖(FDG)后,在肿瘤部位聚集,从而将肿瘤与其他代谢正常区域区分开来,采用类似方法也可用于评价心肌组织的局部代谢情况如缺血或坏死。代谢显像对了解疾病或其他生理过程中的代谢变化有重要意义。
虽然作为诊断和治疗手段,上述技术还有许多需要改进的地方,有些还仅限于实验阶段,但是它们的最终应用将会使临床和基础医学产生新的飞跃。
志谢 丁金凤、刘秀杰教授对本文给予了指导
参 考 文 献
1，萨母布鲁克 J, 弗里奇 EF, 曼尼阿蒂斯 T, 等. 分子克隆实验指南. 北京: 科学出版社, 1992. 34-69.
, http://www.100md.com
2，徐洵, 刘震乾. DNA重组技术. 北京: 科学出版社, 1990. 107-164.
3，田小利, 陈兰英, 扈荣良, 主编. 转基因动物原理、技术与应用. 长春: 吉林科学技术出版社, 1994. 13-64.
4，Li YM, Zhao YQ. Practical protocols in molecular biology. 北京: Science Press, 1995. 175-230.
5，刘秀杰, 马寄晓, 主编. 临床心肺核医学. 北京: 北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社, 1993. 53-68.
6，周金黄, 王建华, 主编. 中药药理与临床研究进展(第4册). 北京: 军事医学科学出版社, 1996. 180-192.
, http://www.100md.com
7，Dewanjee MK, Ghafouripour AK, Kapadvanjwala M, et al. Noninvasive imaging of c-myc oncogene messenger RNA with 111 In antisense probes in amammary tumor-bearing mouse model. J Nucl Med, 1994, 35:1054-1063.
8，Hnatowich DJ, Winnard JrP, Virzi F, et al. 99 Tcm labelling of DNA oligonucleotides. J Nucl Med, 1995, 36:2306-2314.
(收稿日期:1999-08-18), http://www.100md.com
单位：北京,中国医学科学院、中国协和医科大学阜外心血管病医院生化研究室 100037
关键词：
中华核医学杂志000420 近20年来,以DNA重组技术的发展和应用为标志,分子生物学在理论和应用上都取得了重要进展,并逐步扩展到生命科学研究的一切领域,包括与人类生存质量直接相关的医学领域。目前核医学发展的一个重要领域就是分子核医学。本文简要介绍一些分子生物学的基本理论和方法及其在分子核医学中的应用。
一、分子生物学技术
1. 重组DNA和扩增技术。重组DNA技术是分子生物学的基础,它是将外源DNA(单个基因,DNA片段或染色体片段)通过连接反应插入某种载体(质粒、噬菌体、粘粒或人工染色体等),并转化相应的宿主细胞(细菌、噬菌体或真核细胞等),使外源DNA得以在体外长期保存和随时进行操作[1]。将目标基因与适当的载体连接构建为重组载体即基因克隆,在此基础上进行后续的研究。在研究中往往需要大量的目标DNA,应运而生了DNA扩增技术。常用的DNA扩增技术是通过重组质粒的大量复制而得到大量插入DNA片段;另外常用的方法是PCR扩增即多聚酶链式反应,它是利用1对与目标DNA双链5′端序列相同的寡核苷酸片段作为引物,通过DNA聚合酶进行延伸反应,从而得到1段与目标DNA在两引物间序列相同的复制品。1个常规的PCR循环包括3个步骤,即变性、退火或复性、延伸反应。1次PCR反应往往采用30个循环,每一循环的产物可作为下一步循环的模板,目标DNA片段即得到大量复制,数量可达2×(106～107)拷贝。DNA重组技术和PCR扩增技术使得分子生物学技术被广泛应用。
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2. 分离目标基因。在重组DNA和PCR扩增技术基础上,可进行多项研究,例如疾病相关基因的分离[2]。在生物体内,基因首先转录为mRNA,然后翻译成蛋白质从而行使其特定功能。因此,要分离得到疾病的相关基因,需要建立相应的基因(cDNA)文库,即从相应组织或细胞中提取mRNA,并将其反转录为双链cDNA。将所有的cDNA片段利用重组技术克隆到适当的载体上,然后以重组子转化宿主菌,这样就可建立1个cDNA文库,其中含有所用组织和细胞中的所有表达序列,包括要分离的目标基因。从cDNA文库中分离目标基因可以采用许多方法,例如用包含该基因序列的基因组DNA或以同源基因的cDNA片段作为探针,通过杂交从文库中钓取相应的cDNA;利用基因表达产物的抗体通过免疫印迹获得相应的cDNA克隆;利用基因的表达变化通过差减杂交或差异显示PCR(DD-PCR)的方法分离目的基因。另外还可用mRNA分子为材料直接分离基因,如根据已知的序列或同源的基因序列,采用反转录PCR的方法获得目的基因。分离目标基因是整个研究的关键步骤,采用何种方法取决于基因本身和已有的实验条件。
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3. 基因序列测定。得到疾病相关基因后的第一步工作就是序列测定[1]。测序的方法有化学断裂法和双脱氧核苷终止法,后者最为常用。其基本原理是在DNA聚合反应的链延伸过程中引入双脱氧核苷酸底物,这种底物在脱氧核糖的3′羟基位点脱氧化,不能参与随后的延伸反应,从而终止链的延伸。这样加入不同的双脱氧底物,使合成的DNA链在不同位点终止,不同长度的DNA链通过变性胶电泳分离并按顺序进行排列,即得出所测样品的核苷酸序列。序列测定可在实验室进行手工测序,也可通过自动测序仪进行。有了相关基因的序列资料就可以进行各种分析,包括同源性比较和基因结构、功能预测。
4. 基因的表达分析。细胞内的基因表达分析是将重组的表达载体转染培养细胞,并在其中表达目的基因,通过观察细胞表型或功能变化来推测该基因可能具有的功能。但在细胞模型中的结果还需要在体内作进一步鉴定,常用的是转基因动物模型[3]。转基因技术可分为在动物体内转入目的基因和失活体内原有基因2种方法。在人类疾病相关基因的研究中所使用的转基因动物模型较多。转基因动物是指以实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代。可建立不同的转基因动物模型如小鼠、大鼠直到大动物,以研究外源基因在整体动物中的表达调控规律。建立转基因动物的方法主要有显微注射法、反转录病毒感染法与胚胎干细胞法,较为常用和成熟的方法是显微注射法。其一般程序是首先构建表达载体,并从载体上卸下目的基因DNA片段,纯化、定量后留待显微注射用。在显微注射仪下将目的DNA片段注射入2个极核期的受精卵中,培养后移入假孕母鼠的输卵管或子宫内,成活后鉴定其是否为转基因动物。存活的转基因动物可将遗传信息遗传给后代。失活体内原有基因的方法即基因敲除(knock-out)方法,是近年来发展起来的新技术,是通过导入基因使目的基因失活。正是通过引入目的基因和失活目的基因,使转基因后动物生理或病理状况发生改变,从而确认该基因在动物体内的功能。但由于动物与人类的种属差异,一些在动物体内得到的结论不能完全照搬到人身上,分析这类实验结果时必须慎重。
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5. 基因的表达调控。在确证基因功能的同时,对基因的表达调控的研究也很重要[4],特别是对于疾病相关基因的研究,往往能提供一些新的治疗方法的线索,如人为地改变基因的表达水平来达到治疗目的。研究基因的表达调控包括顺式调控元件(启动子、增强子等)和反式作用因子(各种DNA结合蛋白)的鉴定。前者可以通过构建含有报告基因并拼接有各种顺式调控元件的重组质粒转染细胞,从报告基因的表达变化来寻找其中的调控序列;或者根据已知的调控蛋白,采用DNasel足迹法确定相应的蛋白质结合区域。后者可利用其通过结合DNA来调节基因表达特点,采用酵母双杂交体系统分离。总之,一个基因从最初的分离到最后的功能鉴定和表达调控分析,需用多种分子生物学方法。
二、分子生物学在核医学的应用
核医学以其无创伤性,能反映脏器的功能和代谢情况,在临床医学及其基础研究中有着毋庸置疑的优势。而核医学中引入分子生物学方法已越来越普遍。从90年代始,核医学已跨入了分子核医学的时代,成为药物作用原理、细胞和基因水平调控、疾病发生的分子机制等研究的有效手段。分子核医学可从生理和生化的水平认识疾病,提供疾病变化的分子信息,以帮助诊断、治疗及对疗效作出正确评价。尤其在受体显像和受体介导的治疗技术、基因显像和相关的治疗技术、放射免疫显像和治疗及代谢显像等方面已有许多成功的临床应用。
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1. 受体显像。受体与配体的结合涉及细胞之间及细胞与其他分子间的识别,介导着信息跨膜转导和细胞的生理病理反应等生命基本现象。用放射性核素标记的配体在体内直接探测受体,这是分子核医学发展的新领域,实际上受体显像已在各种肿瘤和其他疾病的诊断以及基础医学研究等方面有许多成功的报道。如利用知母甙元可促进脑受体形成、提高脑受体密度、改善老年人脑功能障碍的机制就是由此发现的[6]。另外放射性药物的开发[5]也可以利用其能特异地与某种细胞受体结合,达到定点探测的目的,这在肿瘤诊断治疗上有重要的应用前景。
2. 放射免疫显像。放射免疫显像的原理与受体显像相似,只不过将受体和配体反应改为抗原抗体反应,利用放射性核素标记的识别特定抗原的抗体或其片段对相应的组织或细胞进行定位。与后者一样,放射免疫显像也可以利用肿瘤特异的抗原成分,通过抗体标记进行诊断和定位,且也可用于放射性治疗。
3. 基因显像。基因显像是反义技术和核医学结合的产物,它是利用标记的短链反义核苷酸与体内基因表达产物mRNA结合,从而将目标基因进行定位。如用111In[7]、99Tcm[8]标记反义寡核苷酸探针,通过体内分子杂交和体外显像,显示肿瘤发生时呈超表达状态的mRNA,达到早期诊断肿瘤的目的。另外,用发射α、β或俄歇电子的放射性核素进行标记,定向到达肿瘤组织,可抑制癌基因的过度表达,进而抑制癌细胞的增殖;又可利用放射性核素的电离辐射生物效应,破坏癌细胞,达到反义治疗和内照射治疗的双重目的。这方面的研究已在细胞水平、动物水平做了大量实验,在临床上也做了一些有益的尝试,可能会成为治疗肿瘤的理想方法。
, 百拇医药
4. 代谢显像。代谢显像是利用病变或其他靶组织或细胞所特有的代谢特点,通过放射性核素标记的代谢前体对其进行定位。如肿瘤组织代谢活跃,体内注入18F-脱氧葡萄糖(FDG)后,在肿瘤部位聚集,从而将肿瘤与其他代谢正常区域区分开来,采用类似方法也可用于评价心肌组织的局部代谢情况如缺血或坏死。代谢显像对了解疾病或其他生理过程中的代谢变化有重要意义。
虽然作为诊断和治疗手段,上述技术还有许多需要改进的地方,有些还仅限于实验阶段,但是它们的最终应用将会使临床和基础医学产生新的飞跃。
志谢 丁金凤、刘秀杰教授对本文给予了指导
参 考 文 献
1，萨母布鲁克 J, 弗里奇 EF, 曼尼阿蒂斯 T, 等. 分子克隆实验指南. 北京: 科学出版社, 1992. 34-69.
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2，徐洵, 刘震乾. DNA重组技术. 北京: 科学出版社, 1990. 107-164.
3，田小利, 陈兰英, 扈荣良, 主编. 转基因动物原理、技术与应用. 长春: 吉林科学技术出版社, 1994. 13-64.
4，Li YM, Zhao YQ. Practical protocols in molecular biology. 北京: Science Press, 1995. 175-230.
5，刘秀杰, 马寄晓, 主编. 临床心肺核医学. 北京: 北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社, 1993. 53-68.
6，周金黄, 王建华, 主编. 中药药理与临床研究进展(第4册). 北京: 军事医学科学出版社, 1996. 180-192.
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7，Dewanjee MK, Ghafouripour AK, Kapadvanjwala M, et al. Noninvasive imaging of c-myc oncogene messenger RNA with 111 In antisense probes in amammary tumor-bearing mouse model. J Nucl Med, 1994, 35:1054-1063.
8，Hnatowich DJ, Winnard JrP, Virzi F, et al. 99 Tcm labelling of DNA oligonucleotides. J Nucl Med, 1995, 36:2306-2314.
(收稿日期:1999-08-18), http://www.100md.com