急性放射病救治存活第6年患者IRF-1、N-ras和bcr/abl基因的检测研究
作者：夏放 袁有忠 章卫平 刘本俶
单位：200433上海，第二军医大学长海医院血液科
关键词：
中华放射医学与防护杂志980116.htm 急性放射病(ARS)患者可能因其骨髓受损而逐步发展为骨髓增生异常综合征(MDS)，并进一步向白血病方向演化[1]。抑癌基因的失活和癌基因的激活可能与MDS和白血病的发生机理有关。我们采用逆转录多聚合酶链反应(RT-PCR)和多聚酶链反应结合单链构象多态分析法(PCR-SSCP)及银染技术，对5例ARS救治存活第6年患者、8例正常健康人和3种白血病细胞系的IRF-1、N-ras和bcr/abl基因表达进行了检测分析，结果如下。
1 材料和方法
1.1 标本：5例“6.25”60Co源辐射事故患者的基本情况见本期刘本俶一文。正常健康人8例，男女各4例，年龄16～69岁。K-562、HL-60、HIMeg细胞株，本室保存。
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1.2 引物合成：根据IRF-1基因[2]、参照基因β-actin和N-ras基因[3]、bcr/abl[4]融合基因cDNA序列，设计合成引物顺序(附表)。IRF-1基因扩增第2，3，4外显子片段，长度为356bp;β-actin基因扩增第1，2外显子片段，108bp；N-ras基因分别扩增第1和第2外显子，长度为115bp和103bp；bcr/abl基因扩增b3a2和b2a3片段，374bp和350bp。上述引物委托中科院上海细胞所合成。
1.3 细胞总RNA和DNA提取：按异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取细胞总RNA[5]；蛋白酶K-酚-氯仿法提取DNA[6]。
1.4 逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)：RT反应20μl体系，包括2μg细胞总RNA，2.5U/μl MMLV逆转录酶，50pmol随机引物，1U/μl RNA酶抑制剂，500μmol/L dNTPs,1×PCR缓冲液，5mmol/L MgCl2，42℃反应30分种，99℃加热5分钟，4℃保存。PCR反应50μl体系，含1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTPs,25pmol基因引物(IRF-1或β-actin或bcr/abl)，2U Taq酶，1μg以总RNA来源的cDNA为模板，扩增35个循环。
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附表 引物序列 引物
序 列
IRF\|1.1
5′\|TCTTCCCTCTTCCACTCGGAGTCC\|3′
IRF\|1.2
5′\|TGGCACAGCGAAAGTTGGCC\|3′
β\|actin1
5′\|AACGGCTCCGGCATGTACAA\|3′
β\|actin2
5′\|CTTCTGACCCATGCCCACCA\|3′
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N12,13S
5′\|CTGGTGTGAAATGACTGAGT\|3′
N12,13A
5′\|GGTGGGATCATATTCATCTA\|3′
N61S
5′\|GGTGAAACCTGTTTGTTGGA\|3′
N61A
5′\|ATACACAGAGGAAGCCTTCG\|3′
abl\|1
5′\|TGATTATAGCCTAAGACCCGG\|3′
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M\|bcr1
5′\|GAAGTGTTTCAGAAGCTTCTC\|3′
m\|bcr1
5′\|ACCATCGTGGGCTCCGCAAGA\|3′
abl\|2
5′\|ATCTCCACTGGCCAGAA\|3′
M\|bcr2
5′\|TGGAGCTGCAGATGCTGA\|3′
m\|bcr2
5′\|AGATCTGGCCCAACGAT\|3′
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1.5 聚合酶链反应结合单链构象多态分析法(PCR\|SSCP):PCR反应50μl体系内，包括100ng DNA模板，25pmol N\|ras基因引物，余同1.4项。SSCP分析，PCR扩增产物10μl，测序终止液10μl，100℃，5分钟热变性；0.5mol/L NaOH,10mmol/L EDTA混合液2μl,42℃水浴5分钟，甲酰胺上样液1μl碱变性。1.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳—银染：5μlRT\|PCR或PCR\|SSCP产物经10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，在10%乙醇，1.13%硝酸(固定液)中处理20分钟；12mmol/L硝酸银(染色液)中处理10分钟；3%碳酸钠，0.06%甲醛(显影液)中处理1分钟，凉干。
1.7 吸收光密度扫描：日本SHARP公司JX330扫描仪，Compaq.575计算机，Image.MasterTM软件处理凝胶扫描值。
1.8 统计学处理：用t检验，相关分析。
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2 结果
2.1 正常健康人检测结果：正常健康人骨髓细胞(8例)均检测到IRF\|1基因表达(图1)，其扫描值分别为IRF\|1:1.04±0.04；β\|actin:1.73±0.06；IRF\|1/β\|actin:0.60±0.03。我们取IRF\|1/β\|actin=0.6为IRF\|1基因正常组扫描标准值1.00。正常组N\|ras癌基因第1，2外显子均未发现突变条带，bcr/abl融合基因也未检测出表达。
2.2 白血病细胞系检测结果：从细胞系IRF\|1基因表达可见HL\|60细胞系的N\|ras癌基因第2外显子区出现异常突变条带；K\|562细胞系可扩增出bcr/abl融合基因的b3a2和b2a3特异性片段。
2.3 急性放射病救治存活第6年患者检测结果：IRF\|1基因表达检测见图2；5例患者均未检测到N\|ras基因突变和bcr/abl融合基因表达。
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3 讨论
骨髓型急性放射病是由于短时间内大剂量电离辐射作用于人体所致的急性全身性疾病，其中由于骨髓受损导致的造血障碍是其主要表现。中度以上的骨髓型急性放射病患者的远期效应中可能出现由于骨髓受损而逐渐发展成骨髓增生异常综合征(MDS)，并进一步演化为白血病的情况。近年文献报道在经β射线、X射线和紫外线照射后产生的小鼠皮肤和骨肿瘤细胞中，检测出ras癌基因的点突变以及p53抑癌基因的缺失与失活，提示电离辐射损伤的致癌远期效应之一可能是DNA双链断裂，形成修复中的碱基置换、缺失或移位，激活原癌基因或使抑癌基因失活，诱发白血病或实体肿瘤产生[7，8]。IRF\|1基因定位于5q31.1，编码干扰素调控因子IRF\|1蛋白，其主要功能是激活Ⅰ型干扰素和某些干扰素介导基因的转录活性，DNA全长7.72kb，包括10个外显子和9个内含子，其中第2，3，4外显子是高度保守的序列。近年研究证实IRF\|1基因具有抑癌基因特性，在5号染色体异常(5q-或5-)的MDS和白血病患者中发现IRF\|1基因缺失和失活[9]。N\|ras癌基因点突变也已被证实与白血病和MDS的发生机理有关[3]；bcr/abl融合基因则是Ph(+)白血病细胞的分子遗传学标志[4]。
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我们检测了5名“6.25”60Co源辐射事故的中、重度骨髓型急性放射病患者第6年随访期中的骨髓细胞的IRF\|1基因表达，发现3例与正常组相近，2例(“俊”和“给”)比正常组降低约30%。这两名患者年龄均大于45岁，在同期体检中发现其红细胞和血清免疫学检查结果均较正常偏低，骨髓细胞形态呈低增生状态，而另3例同项检查均正常。5名患者骨髓细胞中均未发现N\|ras癌基因点突变和bcr/abl融合基因表达，今后是否会随其病情发展而出现异常仍应进一步观察。尽管“俊”和“给”各项检查值尚未达到MDS诊断标准，但我们推测其IRF\|1基因表达下降可能与骨髓低生有关，提示IRF\|1基因的表达检测对骨髓型急性放射病远后效应的随访监测可能有一定价值。但明确的结论及其机理，尚需作深入的回顾性研究和长期的随访观察。
急性放射病救治存活第6年患者IRF-1，N-ras和bcr/abl基因的检测研究
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图1 正常骨髓细胞和白血病细胞系IRF-1基因表达
图2 5例急性放射病救治存活第6年IRF-1基因表达
参 考 文 献
1、夏寿萱.放射分子生物学.北京：原子能出版社，1991.
2、Nobuyuki,Masahiko,Kitagawa,et al.Cellular commitment to oncogene\|induced transformation or apoptosis is dependent on IRF\|1.Cell,1994,77:829.
3、Radich JP.N\|ras mutation in acute myelogenous leuke-mia.Leukemia Lymphoma,1992,6:325.
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4、Dobroric A,Mieczyslaw R,Jerry W,et al.Molecular diagnosis of Ph(-) CML using the PCR and DNA analysis.Leukemia,1991,5:187.
Piotr,Nicoletta.Single\|step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate\|phenol\|chloroform extraction.Anal Biochem,1987,162:156.
6、Blin N,Stafford DW.A general method for isolation of high molecular weight DNA.Nucleic Acids Res,1976,3:2303.
7、Hall EJ.Molecular biology in radiation therapy:the potential impact of recombinant technology on clinical practice.Int J Radiat Oncol Biol Phys,1994,30:1019.
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8、Ball NJ,Shawn P,Jerry W,et al.Ras mutations in human melanoma:a marker of malignant progression.J Invest Dermatol,1994,102(3):285.
9、Cheryl L,Cordelia E,Maria G,et al.Deletion of IRF\|1,mapping to 5q31.1,in human leukemia and MDS.Science,1993,259:968.
(收稿：1997-04-15 修回：1997-05-20)
欢 迎 作 者 踊 跃 投 稿, 百拇医药
单位：200433上海，第二军医大学长海医院血液科
关键词：
中华放射医学与防护杂志980116.htm 急性放射病(ARS)患者可能因其骨髓受损而逐步发展为骨髓增生异常综合征(MDS)，并进一步向白血病方向演化[1]。抑癌基因的失活和癌基因的激活可能与MDS和白血病的发生机理有关。我们采用逆转录多聚合酶链反应(RT-PCR)和多聚酶链反应结合单链构象多态分析法(PCR-SSCP)及银染技术，对5例ARS救治存活第6年患者、8例正常健康人和3种白血病细胞系的IRF-1、N-ras和bcr/abl基因表达进行了检测分析，结果如下。
1 材料和方法
1.1 标本：5例“6.25”60Co源辐射事故患者的基本情况见本期刘本俶一文。正常健康人8例，男女各4例，年龄16～69岁。K-562、HL-60、HIMeg细胞株，本室保存。
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1.2 引物合成：根据IRF-1基因[2]、参照基因β-actin和N-ras基因[3]、bcr/abl[4]融合基因cDNA序列，设计合成引物顺序(附表)。IRF-1基因扩增第2，3，4外显子片段，长度为356bp;β-actin基因扩增第1，2外显子片段，108bp；N-ras基因分别扩增第1和第2外显子，长度为115bp和103bp；bcr/abl基因扩增b3a2和b2a3片段，374bp和350bp。上述引物委托中科院上海细胞所合成。
1.3 细胞总RNA和DNA提取：按异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取细胞总RNA[5]；蛋白酶K-酚-氯仿法提取DNA[6]。
1.4 逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)：RT反应20μl体系，包括2μg细胞总RNA，2.5U/μl MMLV逆转录酶，50pmol随机引物，1U/μl RNA酶抑制剂，500μmol/L dNTPs,1×PCR缓冲液，5mmol/L MgCl2，42℃反应30分种，99℃加热5分钟，4℃保存。PCR反应50μl体系，含1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTPs,25pmol基因引物(IRF-1或β-actin或bcr/abl)，2U Taq酶，1μg以总RNA来源的cDNA为模板，扩增35个循环。
, 百拇医药
附表 引物序列 引物
序 列
IRF\|1.1
5′\|TCTTCCCTCTTCCACTCGGAGTCC\|3′
IRF\|1.2
5′\|TGGCACAGCGAAAGTTGGCC\|3′
β\|actin1
5′\|AACGGCTCCGGCATGTACAA\|3′
β\|actin2
5′\|CTTCTGACCCATGCCCACCA\|3′
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N12,13S
5′\|CTGGTGTGAAATGACTGAGT\|3′
N12,13A
5′\|GGTGGGATCATATTCATCTA\|3′
N61S
5′\|GGTGAAACCTGTTTGTTGGA\|3′
N61A
5′\|ATACACAGAGGAAGCCTTCG\|3′
abl\|1
5′\|TGATTATAGCCTAAGACCCGG\|3′
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M\|bcr1
5′\|GAAGTGTTTCAGAAGCTTCTC\|3′
m\|bcr1
5′\|ACCATCGTGGGCTCCGCAAGA\|3′
abl\|2
5′\|ATCTCCACTGGCCAGAA\|3′
M\|bcr2
5′\|TGGAGCTGCAGATGCTGA\|3′
m\|bcr2
5′\|AGATCTGGCCCAACGAT\|3′
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1.5 聚合酶链反应结合单链构象多态分析法(PCR\|SSCP):PCR反应50μl体系内，包括100ng DNA模板，25pmol N\|ras基因引物，余同1.4项。SSCP分析，PCR扩增产物10μl，测序终止液10μl，100℃，5分钟热变性；0.5mol/L NaOH,10mmol/L EDTA混合液2μl,42℃水浴5分钟，甲酰胺上样液1μl碱变性。1.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳—银染：5μlRT\|PCR或PCR\|SSCP产物经10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，在10%乙醇，1.13%硝酸(固定液)中处理20分钟；12mmol/L硝酸银(染色液)中处理10分钟；3%碳酸钠，0.06%甲醛(显影液)中处理1分钟，凉干。
1.7 吸收光密度扫描：日本SHARP公司JX330扫描仪，Compaq.575计算机，Image.MasterTM软件处理凝胶扫描值。
1.8 统计学处理：用t检验，相关分析。
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2 结果
2.1 正常健康人检测结果：正常健康人骨髓细胞(8例)均检测到IRF\|1基因表达(图1)，其扫描值分别为IRF\|1:1.04±0.04；β\|actin:1.73±0.06；IRF\|1/β\|actin:0.60±0.03。我们取IRF\|1/β\|actin=0.6为IRF\|1基因正常组扫描标准值1.00。正常组N\|ras癌基因第1，2外显子均未发现突变条带，bcr/abl融合基因也未检测出表达。
2.2 白血病细胞系检测结果：从细胞系IRF\|1基因表达可见HL\|60细胞系的N\|ras癌基因第2外显子区出现异常突变条带；K\|562细胞系可扩增出bcr/abl融合基因的b3a2和b2a3特异性片段。
2.3 急性放射病救治存活第6年患者检测结果：IRF\|1基因表达检测见图2；5例患者均未检测到N\|ras基因突变和bcr/abl融合基因表达。
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3 讨论
骨髓型急性放射病是由于短时间内大剂量电离辐射作用于人体所致的急性全身性疾病，其中由于骨髓受损导致的造血障碍是其主要表现。中度以上的骨髓型急性放射病患者的远期效应中可能出现由于骨髓受损而逐渐发展成骨髓增生异常综合征(MDS)，并进一步演化为白血病的情况。近年文献报道在经β射线、X射线和紫外线照射后产生的小鼠皮肤和骨肿瘤细胞中，检测出ras癌基因的点突变以及p53抑癌基因的缺失与失活，提示电离辐射损伤的致癌远期效应之一可能是DNA双链断裂，形成修复中的碱基置换、缺失或移位，激活原癌基因或使抑癌基因失活，诱发白血病或实体肿瘤产生[7，8]。IRF\|1基因定位于5q31.1，编码干扰素调控因子IRF\|1蛋白，其主要功能是激活Ⅰ型干扰素和某些干扰素介导基因的转录活性，DNA全长7.72kb，包括10个外显子和9个内含子，其中第2，3，4外显子是高度保守的序列。近年研究证实IRF\|1基因具有抑癌基因特性，在5号染色体异常(5q-或5-)的MDS和白血病患者中发现IRF\|1基因缺失和失活[9]。N\|ras癌基因点突变也已被证实与白血病和MDS的发生机理有关[3]；bcr/abl融合基因则是Ph(+)白血病细胞的分子遗传学标志[4]。
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我们检测了5名“6.25”60Co源辐射事故的中、重度骨髓型急性放射病患者第6年随访期中的骨髓细胞的IRF\|1基因表达，发现3例与正常组相近，2例(“俊”和“给”)比正常组降低约30%。这两名患者年龄均大于45岁，在同期体检中发现其红细胞和血清免疫学检查结果均较正常偏低，骨髓细胞形态呈低增生状态，而另3例同项检查均正常。5名患者骨髓细胞中均未发现N\|ras癌基因点突变和bcr/abl融合基因表达，今后是否会随其病情发展而出现异常仍应进一步观察。尽管“俊”和“给”各项检查值尚未达到MDS诊断标准，但我们推测其IRF\|1基因表达下降可能与骨髓低生有关，提示IRF\|1基因的表达检测对骨髓型急性放射病远后效应的随访监测可能有一定价值。但明确的结论及其机理，尚需作深入的回顾性研究和长期的随访观察。
急性放射病救治存活第6年患者IRF-1，N-ras和bcr/abl基因的检测研究
, http://www.100md.com
图1 正常骨髓细胞和白血病细胞系IRF-1基因表达
图2 5例急性放射病救治存活第6年IRF-1基因表达
参 考 文 献
1、夏寿萱.放射分子生物学.北京：原子能出版社，1991.
2、Nobuyuki,Masahiko,Kitagawa,et al.Cellular commitment to oncogene\|induced transformation or apoptosis is dependent on IRF\|1.Cell,1994,77:829.
3、Radich JP.N\|ras mutation in acute myelogenous leuke-mia.Leukemia Lymphoma,1992,6:325.
, http://www.100md.com
4、Dobroric A,Mieczyslaw R,Jerry W,et al.Molecular diagnosis of Ph(-) CML using the PCR and DNA analysis.Leukemia,1991,5:187.
Piotr,Nicoletta.Single\|step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate\|phenol\|chloroform extraction.Anal Biochem,1987,162:156.
6、Blin N,Stafford DW.A general method for isolation of high molecular weight DNA.Nucleic Acids Res,1976,3:2303.
7、Hall EJ.Molecular biology in radiation therapy:the potential impact of recombinant technology on clinical practice.Int J Radiat Oncol Biol Phys,1994,30:1019.
, 百拇医药
8、Ball NJ,Shawn P,Jerry W,et al.Ras mutations in human melanoma:a marker of malignant progression.J Invest Dermatol,1994,102(3):285.
9、Cheryl L,Cordelia E,Maria G,et al.Deletion of IRF\|1,mapping to 5q31.1,in human leukemia and MDS.Science,1993,259:968.
(收稿：1997-04-15 修回：1997-05-20)
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