五例60Co源辐射事故病人照后3.5～5.5年外周血淋巴细胞HPRT基因突变频率测定
作者：王惠琛 邢瑞云 赵艳华 夏寿萱
单位：100850 北京放射医学研究所
关键词：
中华放射医学与防护杂志980114.htm
HPRT基因(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因)位于X染色体上，易受物理化学因素的影响而产生突变，比常染色体隐性基因具有更高的突变频率(mutation frequency,MF)，是研究电离辐射效应的较为理想的靶基因。这个基因表达的HPRT酶参与嘌呤核苷酸的补救代谢，属非必需酶类。HPRT酶缺乏的细胞仍能活存。HPRT突变细胞对6\|TG有抗性，这为筛选HPRT突变子提供了重要的理论依据。
在上海“6.25”辐射事故中，我们从照后3.5年起连续3年对5例放射病人进行外周血淋巴细胞HPRT MF的测定。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 事故受照者的基本情况见本期刘本FDA1一文。对照样品来自5名年龄相当的健康男献血员。
1.2 淋巴细胞的分离和HPRT突变细胞的筛选和克隆：按Albertini法[1]略加改进。从5ml患者静脉血中用Ficoll液分离淋巴细胞，按1×106/ml细胞浓度种于含1μg/ml PHA、10%小牛血清的RPMI 1640培养液中培养。以健康人外周血淋巴细胞经PHA刺激后培养48小时的上清液作为淋巴细胞刺激液，沉淀细胞经100Gy γ射线照射后作为滋养细胞。在96孔培养板上进行淋巴细胞克隆和HPRT突变细胞筛选。方法详见文献[2]。按下式计算HPRT基因突变频率。
MF=(突变细胞克隆数)/(种植细胞数×细胞克隆效率)
2 结果
, 百拇医药
2.1 照后3.5～5.5年淋巴细胞的克隆效率
在这3年中，随着培养基、小牛血清和试剂批号的不同，克隆效率在年度之间有些波动，但总体上说，细胞克隆效率有随照射剂量的增大呈下降的趋势(表1)。
表1 照后3.5～5.5年患者外周血淋巴细胞克隆效率 患者
吸收剂量
(Gy)
淋巴细胞克隆效率(%)
3.5年
4.5年
5.5年
平均
, 百拇医药
龙
5.2
15.0
22.5
18.0
18.5
俊
4.1
17.0
25.0
20.0
20.7
武
, 百拇医药
2.5
13.0
24.0
20.0
19.0
给
2.4
15.0
31.0
23.0
23.0
军
2.0
, http://www.100md.com
20.0
26.0
25.0
23.7
正常对照
30.0
注：种植细胞数(1.0～5.0)×106
2.2 照后3.5～5.5年淋巴细胞HPRT突变频率
在与求细胞克隆效率平行的条件下，在培养基中加入6\|TG对HPRT突变细胞进行筛选并克隆。按上式计算MF值。照后3.5～5.5年的MF及平均值见表2。从表2可见人体受γ射线照射后HPRT MF比正常对照明显升高，升高程度与受照剂量有一定关系。在同一病人身上3年间MF值虽有波动，但差异无显著性。表2 照后3.5～5.5年患者外周血淋巴
, http://www.100md.com
细胞HPRT基因突变频率 患者
吸收剂量
(Gy)
MF(×10-6)
3.5年
4.5年
5.5年
平均
龙
5.2
18
20
20
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19.3
俊
4.1
15
13
20
16.0
武
2.5
15
15
25
18.3
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2.4
13
11
19
14.3
军
2.0
10
10
15
11.7
正常对照
0
, 百拇医药
2
3 讨论
测定HPRT基因突变频率的方法有放射自显影法、荧光显微镜法、多核细胞法、细胞克隆法等[3]。前3种方法虽较简单易行，但因对细胞表型的遗传性质不能证实，有的结果只能称为变异频率(variance frequency,VF)，不能混统称为突变频率。细胞克隆法能准确显示细胞遗传表型的突变和突变频率，被国际上多数实验室采用[3]。
HPRT基因的自发突变频率差别很大，且随年龄递增。由于事故的突发性，我们未能取得患者的照前正常值。但与健康男性平行对照相比，事故病人的MF值比对照升高5.0～12.5倍。MF的升高似与照射剂量的增加有一定依赖关系，但统计学相关不显著。这可能是由于多种因素造成，如照射的不均匀性，照射剂量事故后估算的误差，病人辐射敏感性，病程发展的不同和MF测定方法本身的误差等。这些因素都足以影响测定结果。
, http://www.100md.com
明确的剂量效应关系可以从我们的体外照射实验获得有力的证明。我们曾将健康人外周血在体外以60Coγ射线照射1～8Gy，通过淋巴细胞克隆法测得克隆效率按剂量的大小由53%递减至21%，HPRT MF则随剂量的加大由11.3×10-6递增至157.1×10-6。MF的升高与照射剂量成正比。直线回归方程式为Y=19.98X-11.55 (X为Gy数，Y=MF)，相关系数r=0.964，P<0.01，相关非常显著[2]。
从表2还可看到，在照后3.5～5.5年中HPRT MF保持在较高水平，未见下降，这符合体细胞基因突变长期存在的特征。
与我们的实验相平行，金璀珍等观察了事故病人淋巴细胞染色体畸变，比较分析表明HPRT MF的升高与染色体稳定性畸变增加的趋势一致。提示基因突变是染色体稳定性畸变的分子基础。我们对HPRT基因突变谱的分析证明HPRT基因外显子缺失是辐射损伤的主要形式[2]。这也为MF持续升高和染色体稳定性畸变长期存在提供根据。
, http://www.100md.com
Hakoda等[4]报道在日本原爆40年后30名幸存者(受照剂量大于0.01Gy)的HPRT MF仍明显高于对照。Hirai等[5]用细胞克隆法检测了254名原爆幸存者外周血淋巴细胞HPRT MF，虽然原爆已过了近50年，仍能观察到MF略有升高。
突变细胞在体内的消失速度可能与突变发生在T淋巴细胞的分化阶段有关。本文患者中HPRT突变的长期存在，可能是由于突变发生在干细胞或多功能祖细胞上[6]。
综上所述，HPRT MF能粗略反映机体受电离辐射剂量的大小，突变能在体内长期存留。MF的测定可为判断事故病人的辐射损伤程度和评价远后效应提供有价值的信息。随访观察仍应继续。
本课题受国家自然科学基金资助参 考 文 献
1、Albertini RJ,Castle KL,Borcherding WR.T\|cell cloning to detect the mutant 6\|thioguanine\|resistant lymphocytes present in human peripheral blood.Proc Natl Acad Sci USA,1982,79:6617\|6621.
, 百拇医药
2、王惠琛，邢瑞云，夏寿萱.电离辐射引起人外周血淋巴细胞HPRT基因突变研究.生物化学杂志，1996，12：131.
3、Cole J,Skopek TR.Somatic mutant frequency,mutat rates and mutat spectra in the human population in vivo.Mutat Res,1994,304:33.
4、Hakoda M, Akiyama M,Kyoizumi S.Increased somatic cell mutant frequency in atomic bomb survivors.Mutat Res,1988,201:39.
5、Hirai Y,Kusunoki Y,Kyoizumi S.Mutant frequency at the HPRT locus in peripheral blood T\|lymphocytes of atomic bomb survivors.Mutat Res,1995,329:183.
6、Nicklas JA,O'Neill JP,Albertini RJ.Use of T\|cell receptor gene probes to quantify the in vivo HPRT mutat in human T\|lymphocytes.Mutat Res,1986,173:67.
(收稿：1997-04-15 修回：1997-05-20), 百拇医药
单位：100850 北京放射医学研究所
关键词：
中华放射医学与防护杂志980114.htm
HPRT基因(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因)位于X染色体上，易受物理化学因素的影响而产生突变，比常染色体隐性基因具有更高的突变频率(mutation frequency,MF)，是研究电离辐射效应的较为理想的靶基因。这个基因表达的HPRT酶参与嘌呤核苷酸的补救代谢，属非必需酶类。HPRT酶缺乏的细胞仍能活存。HPRT突变细胞对6\|TG有抗性，这为筛选HPRT突变子提供了重要的理论依据。
在上海“6.25”辐射事故中，我们从照后3.5年起连续3年对5例放射病人进行外周血淋巴细胞HPRT MF的测定。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 事故受照者的基本情况见本期刘本FDA1一文。对照样品来自5名年龄相当的健康男献血员。
1.2 淋巴细胞的分离和HPRT突变细胞的筛选和克隆：按Albertini法[1]略加改进。从5ml患者静脉血中用Ficoll液分离淋巴细胞，按1×106/ml细胞浓度种于含1μg/ml PHA、10%小牛血清的RPMI 1640培养液中培养。以健康人外周血淋巴细胞经PHA刺激后培养48小时的上清液作为淋巴细胞刺激液，沉淀细胞经100Gy γ射线照射后作为滋养细胞。在96孔培养板上进行淋巴细胞克隆和HPRT突变细胞筛选。方法详见文献[2]。按下式计算HPRT基因突变频率。
MF=(突变细胞克隆数)/(种植细胞数×细胞克隆效率)
2 结果
, 百拇医药
2.1 照后3.5～5.5年淋巴细胞的克隆效率
在这3年中，随着培养基、小牛血清和试剂批号的不同，克隆效率在年度之间有些波动，但总体上说，细胞克隆效率有随照射剂量的增大呈下降的趋势(表1)。
表1 照后3.5～5.5年患者外周血淋巴细胞克隆效率 患者
吸收剂量
(Gy)
淋巴细胞克隆效率(%)
3.5年
4.5年
5.5年
平均
, 百拇医药
龙
5.2
15.0
22.5
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18.5
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4.1
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正常对照
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注：种植细胞数(1.0～5.0)×106
2.2 照后3.5～5.5年淋巴细胞HPRT突变频率
在与求细胞克隆效率平行的条件下，在培养基中加入6\|TG对HPRT突变细胞进行筛选并克隆。按上式计算MF值。照后3.5～5.5年的MF及平均值见表2。从表2可见人体受γ射线照射后HPRT MF比正常对照明显升高，升高程度与受照剂量有一定关系。在同一病人身上3年间MF值虽有波动，但差异无显著性。表2 照后3.5～5.5年患者外周血淋巴
, http://www.100md.com
细胞HPRT基因突变频率 患者
吸收剂量
(Gy)
MF(×10-6)
3.5年
4.5年
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2
3 讨论
测定HPRT基因突变频率的方法有放射自显影法、荧光显微镜法、多核细胞法、细胞克隆法等[3]。前3种方法虽较简单易行，但因对细胞表型的遗传性质不能证实，有的结果只能称为变异频率(variance frequency,VF)，不能混统称为突变频率。细胞克隆法能准确显示细胞遗传表型的突变和突变频率，被国际上多数实验室采用[3]。
HPRT基因的自发突变频率差别很大，且随年龄递增。由于事故的突发性，我们未能取得患者的照前正常值。但与健康男性平行对照相比，事故病人的MF值比对照升高5.0～12.5倍。MF的升高似与照射剂量的增加有一定依赖关系，但统计学相关不显著。这可能是由于多种因素造成，如照射的不均匀性，照射剂量事故后估算的误差，病人辐射敏感性，病程发展的不同和MF测定方法本身的误差等。这些因素都足以影响测定结果。
, http://www.100md.com
明确的剂量效应关系可以从我们的体外照射实验获得有力的证明。我们曾将健康人外周血在体外以60Coγ射线照射1～8Gy，通过淋巴细胞克隆法测得克隆效率按剂量的大小由53%递减至21%，HPRT MF则随剂量的加大由11.3×10-6递增至157.1×10-6。MF的升高与照射剂量成正比。直线回归方程式为Y=19.98X-11.55 (X为Gy数，Y=MF)，相关系数r=0.964，P<0.01，相关非常显著[2]。
从表2还可看到，在照后3.5～5.5年中HPRT MF保持在较高水平，未见下降，这符合体细胞基因突变长期存在的特征。
与我们的实验相平行，金璀珍等观察了事故病人淋巴细胞染色体畸变，比较分析表明HPRT MF的升高与染色体稳定性畸变增加的趋势一致。提示基因突变是染色体稳定性畸变的分子基础。我们对HPRT基因突变谱的分析证明HPRT基因外显子缺失是辐射损伤的主要形式[2]。这也为MF持续升高和染色体稳定性畸变长期存在提供根据。
, http://www.100md.com
Hakoda等[4]报道在日本原爆40年后30名幸存者(受照剂量大于0.01Gy)的HPRT MF仍明显高于对照。Hirai等[5]用细胞克隆法检测了254名原爆幸存者外周血淋巴细胞HPRT MF，虽然原爆已过了近50年，仍能观察到MF略有升高。
突变细胞在体内的消失速度可能与突变发生在T淋巴细胞的分化阶段有关。本文患者中HPRT突变的长期存在，可能是由于突变发生在干细胞或多功能祖细胞上[6]。
综上所述，HPRT MF能粗略反映机体受电离辐射剂量的大小，突变能在体内长期存留。MF的测定可为判断事故病人的辐射损伤程度和评价远后效应提供有价值的信息。随访观察仍应继续。
本课题受国家自然科学基金资助参 考 文 献
1、Albertini RJ,Castle KL,Borcherding WR.T\|cell cloning to detect the mutant 6\|thioguanine\|resistant lymphocytes present in human peripheral blood.Proc Natl Acad Sci USA,1982,79:6617\|6621.
, 百拇医药
2、王惠琛，邢瑞云，夏寿萱.电离辐射引起人外周血淋巴细胞HPRT基因突变研究.生物化学杂志，1996，12：131.
3、Cole J,Skopek TR.Somatic mutant frequency,mutat rates and mutat spectra in the human population in vivo.Mutat Res,1994,304:33.
4、Hakoda M, Akiyama M,Kyoizumi S.Increased somatic cell mutant frequency in atomic bomb survivors.Mutat Res,1988,201:39.
5、Hirai Y,Kusunoki Y,Kyoizumi S.Mutant frequency at the HPRT locus in peripheral blood T\|lymphocytes of atomic bomb survivors.Mutat Res,1995,329:183.
6、Nicklas JA,O'Neill JP,Albertini RJ.Use of T\|cell receptor gene probes to quantify the in vivo HPRT mutat in human T\|lymphocytes.Mutat Res,1986,173:67.
(收稿：1997-04-15 修回：1997-05-20), 百拇医药