60Coγ射线诱发小鼠胸腺细胞凋亡及其DNA裂解测定方法的研究
作者：吴 玮 孔宪涛 李 雨 杨如俊 屈昌民 李 莉 张玲珍
单位：200433 上海，第二军医大学长征医院临床免疫中心(吴玮 孔宪涛 李莉 张玲珍)；放射医学研究所(李雨 杨如俊)；济南军区第88医院内科(屈昌民)
关键词：
60Coγ射线诱发小鼠胸腺细胞 凋亡及其DNA裂解测定方法的研究
胸腺是T淋巴细胞分化、发育的场所，以往研究表明胸腺又是辐射的敏感器官，一定量的辐射即可引起胸腺细胞发生细胞程度化死亡(Programmed cell death,PCD)即细胞凋亡[1]。目前对60Coγ射线诱发的胸腺细胞凋亡的系统研究报道不变，本实验采用流式细胞依和胶块恒场凝胶电泳(agarose plug constant\|field gel electrophoresis,aCFGE)方法，探讨60Coγ射线诱发胸腺细胞凋亡的量效、时效关系。为进一步研究其损伤及修复提供实验模型。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 实验动物：昆明种小鼠，雄性，体重20g±2g，本校实验动物中心提供。
1.2 照射条件：采用60Coγ照射，设2.0，4.0，6.0Gy单次全身照射组及未照射对照组，每组15只。剂量率：1.5Gy/min。
1.3 胸腺细胞制备：小鼠眼球放血，剖胸取胸腺组织PBS冲洗，研磨过200目尼龙网制取单细胞悬液，离心，计数后调整细胞浓度2×107/ml备用；一部分加台盼蓝计数活细胞。
1.4 PCD细胞检测：采用本中心常规方法，150×g离心收取胸腺细胞，荧光染色溶液(propidium iodide.PI)60μg/ml，避光30分钟，流式细胞仪(coulter,EPICS\|XL,美国)，测细胞荧光，软件处理，计算PCD细胞的百分率。
, 百拇医药
1.5 DNA裂解片段的测定：采用Wlodek改良aCFGF方法[2]。取胸腺细胞(2×107/ml)与1%的低熔点琼脂糖1∶2混合，制成胶块，在0.25mol/L EDTA、0.01mol/L Tris、1%SDS、0.5mg/ml蛋白酶K，pH8.0，的反液中50℃保温24小时，用TE溶液清洗后进行琼脂糖凝胶电泳。电泳条件：电压：0.7V/cm、0.5×TBE缓冲液(pH8.0)、0.75%琼脂糖凝胶(内加入0.5μg/ml EB)、10～15℃、电泳24～30小时，紫外线灯下观察DNA裂解片段。
2 结果
2.1 各剂量组照射后不同时间段小鼠胸腺PCD细胞FACS分析的时间—效应关系见图1。正常组的凋亡率在2.13%～3.5%之间；各剂量组在照后2小时凋亡率明显升高，与正常组差异有非常显著性(P<0.01)；照后4～8小时凋亡率达高峰，至照后36小时达正常。各时间点随剂量的增加凋亡率上升，照后8小时的剂量—效应关系见图2，在2～4Gy之间的斜率较大。各组在相应时间点与正常组、及各剂量组间(即2Gy与4Gy，4Gy与6Gy)差异均有非常显著性(P<0.01)。
, http://www.100md.com
2.2 aCFGF结果显示见图3：4Gy照射后2小时、8小时出现明显的梯状图谱，后者更为清晰、条带多。照后18小时、24小时及36小时可见DNA背景，无明显条带，与FACS测得结果相吻合。
图1 胸腺PCD细胞FACS分析时间-效应关系图 图2 照后8小时的时间-效应关系图
3 讨论
PCD概念是Lockshin等学者于60年代首先提出，目前认为PCD是由于核酸内切酶被激活所致，PCD是一个主动过程，作为一种死亡形式，近年来倍受重视。实验发现，胸腺细胞受2，4，6Gy照射后2小时出现明显的细胞凋亡，细胞凋亡率在4～8小时达高峰，后渐回降，36小时基本达正常。同时显示出本实验的3个剂量上达凋亡率峰值时，分别为正常细胞凋亡率的8倍、15倍、16倍；而4Gy凋亡率的峰值基本是2Gy的2倍。凋亡率回降至正常凋亡率的4倍时，时间依次为2Gy在照后12小时，4Gy在照后24小时，6Gy在照后36小时，提示辐射对胸腺细胞诱发的细胞凋亡呈剂量依赖性。可能随剂量的增加，射线所激活的与细胞凋亡相关的各种酶的作用强度，活性及作用持续时间也呈剂量依赖性，详细机理尚待进一步探讨。
, 百拇医药
凝胶电泳观察4Gy照后不同时间的DNA裂解片段，在照后2，8小时时间点上显示出明显的梯状图谱，结果与FACS测得结果相吻合。1984年Wyllie[3]等人首次报道检测细胞凋亡的方法以来，各家研究细胞凋亡的学者均引用该方法，有的根据实验条件稍加改良，但实验步骤多，需反复离心，细胞易丢失，且增加外来因素对结果的干扰，常出现假阴性结果，条件很难控制。本实验首次采用检测DNA双链断裂的aCFGE，测定细胞凋亡过程中DNA裂解。结果表明aCFGE能准确清晰地显示细胞凋亡的特征性梯状图谱，由于该方法采用原位裂解，大大减少了外来因素的干扰及可能的DNA片断丢失，假阴性结果减少，使测定方法更敏感，结果更为准确，而且我们认为aCFGE比Wyllie氏方法更简便、快速、经济。因此，aCFGE是测定PCD过程中DNA裂解的好方法，很值得推广。
DNA双链断裂因与细胞存活密切相关，在DNA多种形式的损伤中倍受重视[4，5]。细胞凋亡的生成与抑制是目前研究的热点，大部分人的观察方法是从DNA片段定性的角度来观察，很少有人将细胞凋亡的生成与抑制和DNA双链断裂的损伤与修复同时研究，本实验借助aCFGE方法，可同时定性定量的检则DNA的裂解片段和不同分子量的DNA断裂带，本研究为进一步探讨细胞凋亡生成与抑制和DNA双链断裂损伤与修复的关系提供了理想的模型。
, http://www.100md.com
本课题受全军医药卫生科研基金资助
参考文献
1 Klassen NV,Walker PR,Ross CK,et al.Tow\|stage cell shrinkage and the OER for radiation\|induced apoptosis of rat thymocytes.Int J Radiat Biol,1993;64:571
2 Wlodek D,Banath J,Olive PL,Comparison between pulsed\|field and constant\|field gel electrophoresis for measurement of DNA double\|strand breaks in irradiated Chinese hamster ovary cells.Int J Radiat Biol,1991;60:779
, http://www.100md.com
3 Wyllie AH,Morris RG,Smith AL,et al.Chromatin cleavage in apoptosis:association with condensed chromatin morphology and dependence on macromolecular synthesis.J Pathol,1984;142:67
4 夏寿萱.分子放射生物学.北京：原子能出版社，1992：125～127
5 夏寿萱.分子放射生物学研究新进展国外医学.放射医学核医学分册 1996；20：74
(收稿：1997-3-24 修回：1997-05-29)
v, 百拇医药
单位：200433 上海，第二军医大学长征医院临床免疫中心(吴玮 孔宪涛 李莉 张玲珍)；放射医学研究所(李雨 杨如俊)；济南军区第88医院内科(屈昌民)
关键词：
60Coγ射线诱发小鼠胸腺细胞 凋亡及其DNA裂解测定方法的研究
胸腺是T淋巴细胞分化、发育的场所，以往研究表明胸腺又是辐射的敏感器官，一定量的辐射即可引起胸腺细胞发生细胞程度化死亡(Programmed cell death,PCD)即细胞凋亡[1]。目前对60Coγ射线诱发的胸腺细胞凋亡的系统研究报道不变，本实验采用流式细胞依和胶块恒场凝胶电泳(agarose plug constant\|field gel electrophoresis,aCFGE)方法，探讨60Coγ射线诱发胸腺细胞凋亡的量效、时效关系。为进一步研究其损伤及修复提供实验模型。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 实验动物：昆明种小鼠，雄性，体重20g±2g，本校实验动物中心提供。
1.2 照射条件：采用60Coγ照射，设2.0，4.0，6.0Gy单次全身照射组及未照射对照组，每组15只。剂量率：1.5Gy/min。
1.3 胸腺细胞制备：小鼠眼球放血，剖胸取胸腺组织PBS冲洗，研磨过200目尼龙网制取单细胞悬液，离心，计数后调整细胞浓度2×107/ml备用；一部分加台盼蓝计数活细胞。
1.4 PCD细胞检测：采用本中心常规方法，150×g离心收取胸腺细胞，荧光染色溶液(propidium iodide.PI)60μg/ml，避光30分钟，流式细胞仪(coulter,EPICS\|XL,美国)，测细胞荧光，软件处理，计算PCD细胞的百分率。
, 百拇医药
1.5 DNA裂解片段的测定：采用Wlodek改良aCFGF方法[2]。取胸腺细胞(2×107/ml)与1%的低熔点琼脂糖1∶2混合，制成胶块，在0.25mol/L EDTA、0.01mol/L Tris、1%SDS、0.5mg/ml蛋白酶K，pH8.0，的反液中50℃保温24小时，用TE溶液清洗后进行琼脂糖凝胶电泳。电泳条件：电压：0.7V/cm、0.5×TBE缓冲液(pH8.0)、0.75%琼脂糖凝胶(内加入0.5μg/ml EB)、10～15℃、电泳24～30小时，紫外线灯下观察DNA裂解片段。
2 结果
2.1 各剂量组照射后不同时间段小鼠胸腺PCD细胞FACS分析的时间—效应关系见图1。正常组的凋亡率在2.13%～3.5%之间；各剂量组在照后2小时凋亡率明显升高，与正常组差异有非常显著性(P<0.01)；照后4～8小时凋亡率达高峰，至照后36小时达正常。各时间点随剂量的增加凋亡率上升，照后8小时的剂量—效应关系见图2，在2～4Gy之间的斜率较大。各组在相应时间点与正常组、及各剂量组间(即2Gy与4Gy，4Gy与6Gy)差异均有非常显著性(P<0.01)。
, http://www.100md.com
2.2 aCFGF结果显示见图3：4Gy照射后2小时、8小时出现明显的梯状图谱，后者更为清晰、条带多。照后18小时、24小时及36小时可见DNA背景，无明显条带，与FACS测得结果相吻合。
图1 胸腺PCD细胞FACS分析时间-效应关系图 图2 照后8小时的时间-效应关系图
3 讨论
PCD概念是Lockshin等学者于60年代首先提出，目前认为PCD是由于核酸内切酶被激活所致，PCD是一个主动过程，作为一种死亡形式，近年来倍受重视。实验发现，胸腺细胞受2，4，6Gy照射后2小时出现明显的细胞凋亡，细胞凋亡率在4～8小时达高峰，后渐回降，36小时基本达正常。同时显示出本实验的3个剂量上达凋亡率峰值时，分别为正常细胞凋亡率的8倍、15倍、16倍；而4Gy凋亡率的峰值基本是2Gy的2倍。凋亡率回降至正常凋亡率的4倍时，时间依次为2Gy在照后12小时，4Gy在照后24小时，6Gy在照后36小时，提示辐射对胸腺细胞诱发的细胞凋亡呈剂量依赖性。可能随剂量的增加，射线所激活的与细胞凋亡相关的各种酶的作用强度，活性及作用持续时间也呈剂量依赖性，详细机理尚待进一步探讨。
, 百拇医药
凝胶电泳观察4Gy照后不同时间的DNA裂解片段，在照后2，8小时时间点上显示出明显的梯状图谱，结果与FACS测得结果相吻合。1984年Wyllie[3]等人首次报道检测细胞凋亡的方法以来，各家研究细胞凋亡的学者均引用该方法，有的根据实验条件稍加改良，但实验步骤多，需反复离心，细胞易丢失，且增加外来因素对结果的干扰，常出现假阴性结果，条件很难控制。本实验首次采用检测DNA双链断裂的aCFGE，测定细胞凋亡过程中DNA裂解。结果表明aCFGE能准确清晰地显示细胞凋亡的特征性梯状图谱，由于该方法采用原位裂解，大大减少了外来因素的干扰及可能的DNA片断丢失，假阴性结果减少，使测定方法更敏感，结果更为准确，而且我们认为aCFGE比Wyllie氏方法更简便、快速、经济。因此，aCFGE是测定PCD过程中DNA裂解的好方法，很值得推广。
DNA双链断裂因与细胞存活密切相关，在DNA多种形式的损伤中倍受重视[4，5]。细胞凋亡的生成与抑制是目前研究的热点，大部分人的观察方法是从DNA片段定性的角度来观察，很少有人将细胞凋亡的生成与抑制和DNA双链断裂的损伤与修复同时研究，本实验借助aCFGE方法，可同时定性定量的检则DNA的裂解片段和不同分子量的DNA断裂带，本研究为进一步探讨细胞凋亡生成与抑制和DNA双链断裂损伤与修复的关系提供了理想的模型。
, http://www.100md.com
本课题受全军医药卫生科研基金资助
参考文献
1 Klassen NV,Walker PR,Ross CK,et al.Tow\|stage cell shrinkage and the OER for radiation\|induced apoptosis of rat thymocytes.Int J Radiat Biol,1993;64:571
2 Wlodek D,Banath J,Olive PL,Comparison between pulsed\|field and constant\|field gel electrophoresis for measurement of DNA double\|strand breaks in irradiated Chinese hamster ovary cells.Int J Radiat Biol,1991;60:779
, http://www.100md.com
3 Wyllie AH,Morris RG,Smith AL,et al.Chromatin cleavage in apoptosis:association with condensed chromatin morphology and dependence on macromolecular synthesis.J Pathol,1984;142:67
4 夏寿萱.分子放射生物学.北京：原子能出版社，1992：125～127
5 夏寿萱.分子放射生物学研究新进展国外医学.放射医学核医学分册 1996；20：74
(收稿：1997-3-24 修回：1997-05-29)
v, 百拇医药