低剂量辐射诱导小鼠胸腺细胞RIP28的分离及磷酸化特性
作者：陈沙力 孟庆勇 刘树铮
单位：130021 长春，白求恩医科大学卫生部放射生物重点实验室
关键词：
低剂量辐射诱导小鼠胸腺细胞 RIP28的分离及磷酸化特性
低剂量辐射可在动物和人体诱发出兴奋效应的多种及多层次的表现，已被广泛证实[1]。以往的研究表明，75mGy X射线全身照射可影响小鼠胸腺细胞蛋白分子表达，包括表达上调或下调及新蛋白分子的诱导[2]。为了进一步了解这些变化的蛋白分子在辐射兴奋效应机制中的生物学意义，本研究对28kD(RIP28)蛋白分子进行了分离及磷酸化特性的研究，现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 动物及照射条件：健康雄性昆明系小鼠，体重18～22g。采用Philips深部X射线机照射，电压200kV,电流10wA，滤板0.5mmCU，1.0mmAl，靶皮距离212cm。单次全血照射，剂量率12.5mGy/min，照射剂量75mGy。
, 百拇医药
1.2 小鼠胸腺细胞悬液制备、细胞浆和核分离及蛋白质提取参见文献[2，3]。
1.3 Sephadex G\|100凝胶过滤：采用Bio\|Rad层析仪，洗脱液为0.15mol/L PBS,以0.06 ml/min的流速进行洗脱，每管收集5ml洗脱物，洗脱20小时。
1.4 SDS-PAGE及双向电泳方法参见文献[4]。
1.5 Western印迹：将5×106细胞溶解于0.5ml裂解液(1% NP-40，20 mmol/L Tris,pH 8.0,137 mmol/L NaCl,10% glycerol,1 mmol/L PMSF,0.15 U aprotinin/ml,1.0 mmol/L Na\-3VO\-4)中，置4℃30分钟，间或振荡。裂解物反复通过23号注射针头，4℃ 12000γ/min离心10分钟，上清及蛋白提取物的第6～7层析组份分别加等倍2×SDS-PAGE上样液，沸水浴5分钟。用8%分离胶进行SDS-PAGE，100V电泳1小时，150V电泳6～8小时。40V，4℃电转印过液。丽春红S染色，标记蛋白标准位置。硝纤膜封闭2小时，与磷酸化酪氨酸单克隆抗体杂交瘤细胞培养上清(clone 2G8.D6，1∶10)反应2小时，与碱性磷酸酶标记的单抗鼠IgG(sigma)反应2小时，BCID、NBT显然，用水洗膜终止反应。
, 百拇医药
2 结果
75mGy X射线全身照射小鼠后4小时分离提取胸腺细胞蛋白质，经双向电泳发现细胞核RIP28明显增强，其PI为7.9。经Sephadex G\|100凝胶过滤，将不同组份进行SDS-PAGE及吸光度扫描分析，结果表明照射组6～7组份RIP28分别增强1.7及2.3倍。
75mGy X射线全身照射小鼠后，分别于0，4，8，12及24小时提取胸腺细胞蛋白，Western印迹结果表明辐射后胸腺细胞28kD蛋白分子发生酪氨酸磷酸化，照射后4～12小时明显表达，24小时则恢复至原有水平。同时照射组6～7层析组份28kD蛋白分子发生酪氨酸磷酸化，提示RIP28具有酪氨酸磷酸化特性。
3 讨论
电离辐射可诱导激活多种细胞一系列基因的表达式使另一些基因表达下调和关闭[5]。所诱导的基因产物中许多参与细胞的酶促反应和细胞信息传递通路。低剂量辐射全身作用可使免疫反应上调，这涉及一系列细胞和分子变化，免疫器官内的细胞反应十分复杂，其中T细胞激活是关键的环节[6]。
, http://www.100md.com
预先的研究证实，低剂量全身照射可诱导小鼠胸腺细胞蛋白分子发生酪氨酸磷酸化，照射后部分蛋白分子开始发生磷酸化，8～12小时达峰值，24小时则回降至原有水平；同时也激活胸腺细胞转录因子NF-kB，从而使特定的基因转录启动(资料另文发表)。本组实验发现，75 mGy X射线全身照射小鼠后4小时，胸腺细胞核RIP28明显增强，并具有酶2氨酸磷酸化特性，推测其可能与T细胞激活有关。综合上述结果分析认为，酪氨酸磷酸化，PKC及NF-kB的激活可能是低剂量辐射兴奋效应主要的信号传递及转录调控方式。关于RIP28的功能及其它生物学特性尚需进一步的深入研究。
本课题受国家自然科学基金资助
参考文献
1 Liu SZ,Current status of research on radiation hormesis in the immune system after low level radiation.J Radiat Res Radiat Proc.1995,13(3):129.
, http://www.100md.com
2 陈沙力，孟庆勇，刘树铮.低剂量电离辐射诱导小鼠胸腺细胞蛋白的早期表达.中华放射医学与防护杂志，1996，16：161.
3 Dignam JP,Lebovitr RM,Roeder RG.Accurate trans cription initiation by RNA polymerase Ⅱ in a solwble extract from isolated mammalian nuclei.Nucleic Acids Res,1983,11:1475.
4 陈沙力，孟庆勇，刘树铮.水平板一垂直板双向电泳.白求恩医科大学学院，1996，22：316.
5 Fornace AJ.Mammalian genes induced by radiation activation of genes associated with growth control.AnnRev Genet,1992,26:507.
6 刘树铮.低水平辐射诱导免疫系统兴奋效应的研究现状.中华放射医学与防护杂志，1995，15：217.
(收稿：1996-08-12 修回：1997-01-28), http://www.100md.com
单位：130021 长春，白求恩医科大学卫生部放射生物重点实验室
关键词：
低剂量辐射诱导小鼠胸腺细胞 RIP28的分离及磷酸化特性
低剂量辐射可在动物和人体诱发出兴奋效应的多种及多层次的表现，已被广泛证实[1]。以往的研究表明，75mGy X射线全身照射可影响小鼠胸腺细胞蛋白分子表达，包括表达上调或下调及新蛋白分子的诱导[2]。为了进一步了解这些变化的蛋白分子在辐射兴奋效应机制中的生物学意义，本研究对28kD(RIP28)蛋白分子进行了分离及磷酸化特性的研究，现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 动物及照射条件：健康雄性昆明系小鼠，体重18～22g。采用Philips深部X射线机照射，电压200kV,电流10wA，滤板0.5mmCU，1.0mmAl，靶皮距离212cm。单次全血照射，剂量率12.5mGy/min，照射剂量75mGy。
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1.2 小鼠胸腺细胞悬液制备、细胞浆和核分离及蛋白质提取参见文献[2，3]。
1.3 Sephadex G\|100凝胶过滤：采用Bio\|Rad层析仪，洗脱液为0.15mol/L PBS,以0.06 ml/min的流速进行洗脱，每管收集5ml洗脱物，洗脱20小时。
1.4 SDS-PAGE及双向电泳方法参见文献[4]。
1.5 Western印迹：将5×106细胞溶解于0.5ml裂解液(1% NP-40，20 mmol/L Tris,pH 8.0,137 mmol/L NaCl,10% glycerol,1 mmol/L PMSF,0.15 U aprotinin/ml,1.0 mmol/L Na\-3VO\-4)中，置4℃30分钟，间或振荡。裂解物反复通过23号注射针头，4℃ 12000γ/min离心10分钟，上清及蛋白提取物的第6～7层析组份分别加等倍2×SDS-PAGE上样液，沸水浴5分钟。用8%分离胶进行SDS-PAGE，100V电泳1小时，150V电泳6～8小时。40V，4℃电转印过液。丽春红S染色，标记蛋白标准位置。硝纤膜封闭2小时，与磷酸化酪氨酸单克隆抗体杂交瘤细胞培养上清(clone 2G8.D6，1∶10)反应2小时，与碱性磷酸酶标记的单抗鼠IgG(sigma)反应2小时，BCID、NBT显然，用水洗膜终止反应。
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2 结果
75mGy X射线全身照射小鼠后4小时分离提取胸腺细胞蛋白质，经双向电泳发现细胞核RIP28明显增强，其PI为7.9。经Sephadex G\|100凝胶过滤，将不同组份进行SDS-PAGE及吸光度扫描分析，结果表明照射组6～7组份RIP28分别增强1.7及2.3倍。
75mGy X射线全身照射小鼠后，分别于0，4，8，12及24小时提取胸腺细胞蛋白，Western印迹结果表明辐射后胸腺细胞28kD蛋白分子发生酪氨酸磷酸化，照射后4～12小时明显表达，24小时则恢复至原有水平。同时照射组6～7层析组份28kD蛋白分子发生酪氨酸磷酸化，提示RIP28具有酪氨酸磷酸化特性。
3 讨论
电离辐射可诱导激活多种细胞一系列基因的表达式使另一些基因表达下调和关闭[5]。所诱导的基因产物中许多参与细胞的酶促反应和细胞信息传递通路。低剂量辐射全身作用可使免疫反应上调，这涉及一系列细胞和分子变化，免疫器官内的细胞反应十分复杂，其中T细胞激活是关键的环节[6]。
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预先的研究证实，低剂量全身照射可诱导小鼠胸腺细胞蛋白分子发生酪氨酸磷酸化，照射后部分蛋白分子开始发生磷酸化，8～12小时达峰值，24小时则回降至原有水平；同时也激活胸腺细胞转录因子NF-kB，从而使特定的基因转录启动(资料另文发表)。本组实验发现，75 mGy X射线全身照射小鼠后4小时，胸腺细胞核RIP28明显增强，并具有酶2氨酸磷酸化特性，推测其可能与T细胞激活有关。综合上述结果分析认为，酪氨酸磷酸化，PKC及NF-kB的激活可能是低剂量辐射兴奋效应主要的信号传递及转录调控方式。关于RIP28的功能及其它生物学特性尚需进一步的深入研究。
本课题受国家自然科学基金资助
参考文献
1 Liu SZ,Current status of research on radiation hormesis in the immune system after low level radiation.J Radiat Res Radiat Proc.1995,13(3):129.
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2 陈沙力，孟庆勇，刘树铮.低剂量电离辐射诱导小鼠胸腺细胞蛋白的早期表达.中华放射医学与防护杂志，1996，16：161.
3 Dignam JP,Lebovitr RM,Roeder RG.Accurate trans cription initiation by RNA polymerase Ⅱ in a solwble extract from isolated mammalian nuclei.Nucleic Acids Res,1983,11:1475.
4 陈沙力，孟庆勇，刘树铮.水平板一垂直板双向电泳.白求恩医科大学学院，1996，22：316.
5 Fornace AJ.Mammalian genes induced by radiation activation of genes associated with growth control.AnnRev Genet,1992,26:507.
6 刘树铮.低水平辐射诱导免疫系统兴奋效应的研究现状.中华放射医学与防护杂志，1995，15：217.
(收稿：1996-08-12 修回：1997-01-28), http://www.100md.com