低剂量X射线照射诱导G1期阻滞的适应性反应
作者：鞠桂芝 苏旭 范冰 刘建香 傅士波 刘树铮
单位：130021 长春，白求恩医科大学卫生部放射生物重点实验室
关键词：低剂量辐射；G1期阻滞；适应性反应
中华放射医学与防护杂志980303.htm
目的 观察低剂量X射线照射能否诱导G1期细胞阻滞。方法 采用碘化丙啶(PI)荧光探针标记细胞，流式细胞术(FCM)检测并分析细胞周期。结果 证实1.5Gy X射线全身照射后12小时，小鼠胸腺细胞发生明显G\-1期阻滞。而0.075Gy低剂量预照射可明显减轻其后1.5Gy攻击剂量所致G\-1期阻滞。离体照射EL\|4淋巴瘤细胞也得到类似结果。结论 0.075Gy X射线照射能诱导胸腺淋巴细胞及EL\|4细胞G1期阻滞的适应性反应。
, 百拇医药
Adaptive response of G\-1 arrest induced by low dose X\|rays.Ju Guizhi,Su Xu,Fan Bing,et al.MH Radiobiology Research Unit,Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021,China.
Objective To investigate whether or not adaptive response of G\-1 arrest could be induced by low dose radiation. Methods Flow cytometry (FCM) was used to analyze cell cycle stained with propidium iodide (PI). Results It was found that 12h after 1.5 Gy whole body X\|irradiation,G\-1 arrest of thymocytes took place in Kunming mice.However,G\-1 arrest was diminished when a 0.075 Gy conditioning dose was given 6h before 1.5 Gy challenge dose.The same result was also revealed in EL\|4 lymphoma cell line.Conclusion Adaptive response of G\-1 arrest could be induced by low dose X\|rays.
, 百拇医药
Key words Radiation G\-1 arrest Adaptive response
我室以往的研究证明，低剂量X射线照射可诱导免疫适应性反应[1]。为进一步探讨辐射诱导适应性反应的机理，本文作者对低剂量X射线整体照射能否诱导小鼠胸腺细胞G1期阻滞的适应性反应进行了研究。并同时观察了X射线离体照射EL\|4淋巴瘤细胞周期的变化，结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 动物：整体实验采用本校实验动物部饲养繁殖的昆明小鼠，雄性，体重20±2g,随机分组。
1.2 EL\|4淋巴瘤细胞培养：细胞在RPMI\|1640全培养液，37℃，5%CO2空气及饱和湿度条件下传代培养。细胞倍增时间为14小时。取指数生长期细胞，调细胞浓度为1×106/ml。24孔培养板每孔加入上述细胞悬液1ml，平行样6份。按以下条件处理。
, 百拇医药
1.3 照射及实验分组：照射源采用飞利浦深部X射线机，电压200kV,电流10mA，滤片采用0.5mmCu,1.0mmAl。
整体实验：1.5Gy攻击剂量照射前6小时，小鼠预先接受0.075Gy诱导剂量照射，剂量率为0.0125Gy/min。1.5Gy照射后12小时杀鼠取胸腺，检测胸腺细胞周期的变化。同时设1.5Gy照射及0Gy假照射对照组。
离体实验：2.0Gy攻击剂量照射前6小时，EL\|4细胞先接受0.075Gy诱导剂量照射。2.0Gy照射后12小时检测EL\|4细胞周期的变化。分别设单纯2.0Gy照射及0Gy假照射对照组。
1.4 细胞周期测定：参照我室已建立的常规方法[2]。采用PI(propidium iodide)染色，FACScan流式细胞仪(美国BD公司)进行细胞周期测定。用Cellfit软件收取细胞(每份样品收取10 000个细胞)，并分析细胞周期。结果以细胞周期各时相细胞百分比表示。实验组与对照组结果采用Student's t检验方法进行统计学处理。
, 百拇医药
2 结果
发现中等剂量照射引起G1期细胞阻滞。1.5Gy X射线全身照射后小鼠胸腺细胞周期的变化及2.0Gy离体照射后EL\|4细胞周期的变化，见附表。从表中结果可见，受1.5Gy或2.0Gy照射后12小时，胸腺细胞或EL\|4细胞中的G\-0/G\-1期细胞数均显著高于0Gy假照射组(分别P<0.01及P<0.05)。表明，中等剂量X射线整体或离体照射均可使细胞发生明显的G1期阻滞。在整体照射条件下还发生明显的G2期阻滞。这可能是由于整体调节加速了S期细胞向G2期的过渡所致。
更有趣的是本实验还发现低剂量X射线照射能诱导G1期阻滞的适应性反应。1.5Gy全身照射前6小时，小鼠先接受0.075Gy预照射，胸腺细胞G1期阻滞明显低于单纯1.5Gy照射组(P<0.05)。同时也证实，2.0Gy离体照射前6小时，EL\|4细胞先接受0.075Gy预照射，G1期阻滞亦明显低于单纯2.0Gy照射组(P<0.05)。以上结果表明，0.075Gy预照射可诱导胸腺细胞及EL\|4细胞G1期阻滞的适应性反应(见附表)。
, 百拇医药
附表 X射线照射对细胞周期的影响(
±s) 剂量(Gy)
细胞周期各时相细胞的百分比(%)
G0/G1
S
G\-2+M
胸腺细胞
0
78.22±1.99
19.06±2.09
2.76±0.43
, http://www.100md.com
1.5
82.94±3.19△△
9.12±3.30△△
7.96±0.71△△
0.075+1.5
78.58±2.90*
11.98±2.34
9.42±2.63
EL\|4淋巴
瘤细胞
0
, http://www.100md.com
30.87±1.13
56.28±1.46
12.85±1.77
2.0
33.22±2.44△
55.94±3.40
10.84±1.74
0.075+2.0
29.37±2.08*
60.28±3.26*
11.24±1.48
, http://www.100md.com
注：n=6，1.5或2.0Gy与0Gy组比较ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；联合照射与单纯照射组比较*P<0.05
3 讨论
本实验证明中等剂量X射线照射可引起胸腺淋巴细胞和EL\|4淋巴瘤细胞明显的G1期阻滞。在整体实验中我们还证实3.0Gy照射后导致小鼠胸腺淋巴细胞更明显的G\-1期阻滞。早在1968年Little就报道X射线可引起细胞周期G1期阻滞[3]。此后的20多年中，辐射引起G1期阻滞的分子机制研究深受放射生物学界重视。近年来已揭示其分子调控机制[4，5]。并预示G1期阻滞与细胞损伤、细胞存活及细胞凋亡密切相关[6]。本实验之所以取照后12小时为观察点，是以照射后细胞周期时程变化为依据，此时间点已发生明显的G1期阻滞。
, http://www.100md.com
本实验中所观察的小鼠胸腺淋巴细胞及EL\|4淋巴瘤细胞G1期阻滞的剂量分别采用1.5Gy和2.0Gy。其原因是胸腺淋巴细胞与离体培养中的EL\|4淋巴瘤细胞对辐射的敏感性有所差别，故采用不同剂量。结果表明以上剂量可分别引起明显的G1期阻滞。目的是分别以其作为低剂量辐射诱导G1期阻滞适应性反应研究的最佳攻击剂量。
本实验证实，0.075Gy预照射可分别诱导小鼠胸腺细胞及EL\|4淋巴瘤细胞对其后大剂量所致G1期阻滞的适应性反应。而单纯0.075Gy照射对G1期细胞无明显影响。我们以往的研究已经证明低剂量辐射能诱导免疫适应性反应，表现在低剂量X射线能诱导小鼠脾脏淋巴细胞丝裂原反应(Con A 及LPS)对其后攻击剂量的抗性。G1期阻滞是辐射致细胞损伤所表现出的细胞周期效应。本实验证实低剂量X射线可减轻其后大剂量所致胸腺淋巴细胞G1期阻滞。说明低剂量辐射可减轻其后攻击剂量对胸腺淋巴细胞周期进程的损伤，并与我们照射所观察到的低剂量辐射可减少其后大剂量所致淋巴细胞凋亡的结果相一致。以上发现将成为解释低剂量辐射诱导免疫适应性反应重要的细胞机制。进而将从G1期检查点(G1 checkpoint)基因及其蛋白产物在G1→S过渡中的调控，对低剂量辐射诱导G1期阻滞适应性反应的分子机制进行深入研究，进一步揭示免疫适应性反应的本质。有关方面的研究将采用同步化细胞深入研究，以免除细胞周期各时相细胞比例变化的影响。
, 百拇医药
本课题受国家自然科学基金资助
参考文献
1 鞠桂芝，宋春华，齐进，等.小剂量全身照射诱导小鼠免疫适应性反应的剂量与时间研究.辐射研究与辐射工艺学报，1995，13：95.
2 苏旭，张迎春，刘建香，等.不同剂量电离辐射对EL\|4细胞周期的影响.实用肿瘤学杂志，1995，2：14.
3 Little JB.Delayed initiation of DNA synthesis in irradiated human diploid cells.Nature,1968,218:1064.
4 Bae I,Fan S,Bhatia K,et al.Relationships between G\-1 arrest and stability of the p53 and p21Cipl/Wafl proteins following γ\|irradiation of human lymphoma cells.Cancer Res,1995,55:2387.
, 百拇医药
5 Bae I,Smith ML,Sheikh MS,et al.An abnormality in the p53 pathway following γ\|irradiation in many wild\|type p53 human melanoma lines.Cancer Res,1996,56:840.
6 Cupta N,Vij R,Haas\|kogan DA,et al.Cytogenetic damage and the radiation\|induced G\-1\|phase checkpoint.Radiat Res,1996,145:289.
(收稿：1997-02-28 修回：1997-10-20), 百拇医药
单位：130021 长春，白求恩医科大学卫生部放射生物重点实验室
关键词：低剂量辐射；G1期阻滞；适应性反应
中华放射医学与防护杂志980303.htm
目的 观察低剂量X射线照射能否诱导G1期细胞阻滞。方法 采用碘化丙啶(PI)荧光探针标记细胞，流式细胞术(FCM)检测并分析细胞周期。结果 证实1.5Gy X射线全身照射后12小时，小鼠胸腺细胞发生明显G\-1期阻滞。而0.075Gy低剂量预照射可明显减轻其后1.5Gy攻击剂量所致G\-1期阻滞。离体照射EL\|4淋巴瘤细胞也得到类似结果。结论 0.075Gy X射线照射能诱导胸腺淋巴细胞及EL\|4细胞G1期阻滞的适应性反应。
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Adaptive response of G\-1 arrest induced by low dose X\|rays.Ju Guizhi,Su Xu,Fan Bing,et al.MH Radiobiology Research Unit,Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021,China.
Objective To investigate whether or not adaptive response of G\-1 arrest could be induced by low dose radiation. Methods Flow cytometry (FCM) was used to analyze cell cycle stained with propidium iodide (PI). Results It was found that 12h after 1.5 Gy whole body X\|irradiation,G\-1 arrest of thymocytes took place in Kunming mice.However,G\-1 arrest was diminished when a 0.075 Gy conditioning dose was given 6h before 1.5 Gy challenge dose.The same result was also revealed in EL\|4 lymphoma cell line.Conclusion Adaptive response of G\-1 arrest could be induced by low dose X\|rays.
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Key words Radiation G\-1 arrest Adaptive response
我室以往的研究证明，低剂量X射线照射可诱导免疫适应性反应[1]。为进一步探讨辐射诱导适应性反应的机理，本文作者对低剂量X射线整体照射能否诱导小鼠胸腺细胞G1期阻滞的适应性反应进行了研究。并同时观察了X射线离体照射EL\|4淋巴瘤细胞周期的变化，结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 动物：整体实验采用本校实验动物部饲养繁殖的昆明小鼠，雄性，体重20±2g,随机分组。
1.2 EL\|4淋巴瘤细胞培养：细胞在RPMI\|1640全培养液，37℃，5%CO2空气及饱和湿度条件下传代培养。细胞倍增时间为14小时。取指数生长期细胞，调细胞浓度为1×106/ml。24孔培养板每孔加入上述细胞悬液1ml，平行样6份。按以下条件处理。
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1.3 照射及实验分组：照射源采用飞利浦深部X射线机，电压200kV,电流10mA，滤片采用0.5mmCu,1.0mmAl。
整体实验：1.5Gy攻击剂量照射前6小时，小鼠预先接受0.075Gy诱导剂量照射，剂量率为0.0125Gy/min。1.5Gy照射后12小时杀鼠取胸腺，检测胸腺细胞周期的变化。同时设1.5Gy照射及0Gy假照射对照组。
离体实验：2.0Gy攻击剂量照射前6小时，EL\|4细胞先接受0.075Gy诱导剂量照射。2.0Gy照射后12小时检测EL\|4细胞周期的变化。分别设单纯2.0Gy照射及0Gy假照射对照组。
1.4 细胞周期测定：参照我室已建立的常规方法[2]。采用PI(propidium iodide)染色，FACScan流式细胞仪(美国BD公司)进行细胞周期测定。用Cellfit软件收取细胞(每份样品收取10 000个细胞)，并分析细胞周期。结果以细胞周期各时相细胞百分比表示。实验组与对照组结果采用Student's t检验方法进行统计学处理。
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2 结果
发现中等剂量照射引起G1期细胞阻滞。1.5Gy X射线全身照射后小鼠胸腺细胞周期的变化及2.0Gy离体照射后EL\|4细胞周期的变化，见附表。从表中结果可见，受1.5Gy或2.0Gy照射后12小时，胸腺细胞或EL\|4细胞中的G\-0/G\-1期细胞数均显著高于0Gy假照射组(分别P<0.01及P<0.05)。表明，中等剂量X射线整体或离体照射均可使细胞发生明显的G1期阻滞。在整体照射条件下还发生明显的G2期阻滞。这可能是由于整体调节加速了S期细胞向G2期的过渡所致。
更有趣的是本实验还发现低剂量X射线照射能诱导G1期阻滞的适应性反应。1.5Gy全身照射前6小时，小鼠先接受0.075Gy预照射，胸腺细胞G1期阻滞明显低于单纯1.5Gy照射组(P<0.05)。同时也证实，2.0Gy离体照射前6小时，EL\|4细胞先接受0.075Gy预照射，G1期阻滞亦明显低于单纯2.0Gy照射组(P<0.05)。以上结果表明，0.075Gy预照射可诱导胸腺细胞及EL\|4细胞G1期阻滞的适应性反应(见附表)。
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附表 X射线照射对细胞周期的影响(
±s) 剂量(Gy)细胞周期各时相细胞的百分比(%)
G0/G1
S
G\-2+M
胸腺细胞
0
78.22±1.99
19.06±2.09
2.76±0.43
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1.5
82.94±3.19△△
9.12±3.30△△
7.96±0.71△△
0.075+1.5
78.58±2.90*
11.98±2.34
9.42±2.63
EL\|4淋巴
瘤细胞
0
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30.87±1.13
56.28±1.46
12.85±1.77
2.0
33.22±2.44△
55.94±3.40
10.84±1.74
0.075+2.0
29.37±2.08*
60.28±3.26*
11.24±1.48
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注：n=6，1.5或2.0Gy与0Gy组比较ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；联合照射与单纯照射组比较*P<0.05
3 讨论
本实验证明中等剂量X射线照射可引起胸腺淋巴细胞和EL\|4淋巴瘤细胞明显的G1期阻滞。在整体实验中我们还证实3.0Gy照射后导致小鼠胸腺淋巴细胞更明显的G\-1期阻滞。早在1968年Little就报道X射线可引起细胞周期G1期阻滞[3]。此后的20多年中，辐射引起G1期阻滞的分子机制研究深受放射生物学界重视。近年来已揭示其分子调控机制[4，5]。并预示G1期阻滞与细胞损伤、细胞存活及细胞凋亡密切相关[6]。本实验之所以取照后12小时为观察点，是以照射后细胞周期时程变化为依据，此时间点已发生明显的G1期阻滞。
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本实验中所观察的小鼠胸腺淋巴细胞及EL\|4淋巴瘤细胞G1期阻滞的剂量分别采用1.5Gy和2.0Gy。其原因是胸腺淋巴细胞与离体培养中的EL\|4淋巴瘤细胞对辐射的敏感性有所差别，故采用不同剂量。结果表明以上剂量可分别引起明显的G1期阻滞。目的是分别以其作为低剂量辐射诱导G1期阻滞适应性反应研究的最佳攻击剂量。
本实验证实，0.075Gy预照射可分别诱导小鼠胸腺细胞及EL\|4淋巴瘤细胞对其后大剂量所致G1期阻滞的适应性反应。而单纯0.075Gy照射对G1期细胞无明显影响。我们以往的研究已经证明低剂量辐射能诱导免疫适应性反应，表现在低剂量X射线能诱导小鼠脾脏淋巴细胞丝裂原反应(Con A 及LPS)对其后攻击剂量的抗性。G1期阻滞是辐射致细胞损伤所表现出的细胞周期效应。本实验证实低剂量X射线可减轻其后大剂量所致胸腺淋巴细胞G1期阻滞。说明低剂量辐射可减轻其后攻击剂量对胸腺淋巴细胞周期进程的损伤，并与我们照射所观察到的低剂量辐射可减少其后大剂量所致淋巴细胞凋亡的结果相一致。以上发现将成为解释低剂量辐射诱导免疫适应性反应重要的细胞机制。进而将从G1期检查点(G1 checkpoint)基因及其蛋白产物在G1→S过渡中的调控，对低剂量辐射诱导G1期阻滞适应性反应的分子机制进行深入研究，进一步揭示免疫适应性反应的本质。有关方面的研究将采用同步化细胞深入研究，以免除细胞周期各时相细胞比例变化的影响。
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本课题受国家自然科学基金资助
参考文献
1 鞠桂芝，宋春华，齐进，等.小剂量全身照射诱导小鼠免疫适应性反应的剂量与时间研究.辐射研究与辐射工艺学报，1995，13：95.
2 苏旭，张迎春，刘建香，等.不同剂量电离辐射对EL\|4细胞周期的影响.实用肿瘤学杂志，1995，2：14.
3 Little JB.Delayed initiation of DNA synthesis in irradiated human diploid cells.Nature,1968,218:1064.
4 Bae I,Fan S,Bhatia K,et al.Relationships between G\-1 arrest and stability of the p53 and p21Cipl/Wafl proteins following γ\|irradiation of human lymphoma cells.Cancer Res,1995,55:2387.
, 百拇医药
5 Bae I,Smith ML,Sheikh MS,et al.An abnormality in the p53 pathway following γ\|irradiation in many wild\|type p53 human melanoma lines.Cancer Res,1996,56:840.
6 Cupta N,Vij R,Haas\|kogan DA,et al.Cytogenetic damage and the radiation\|induced G\-1\|phase checkpoint.Radiat Res,1996,145:289.
(收稿：1997-02-28 修回：1997-10-20), 百拇医药