低剂量电离辐射对小鼠下丘脑和免疫器官POMC转录水平的影响
作者：万虹 刘树铮
单位：130021 长春，白求恩医科大学卫生部放射生物重点实验室
关键词：低剂量照射；下丘脑；POMC；原位杂交
中华放射医学与防护杂志980302.htm
目的 观察75mGy X射线全身照射后小鼠下丘脑和免疫器官POMC转录水平的变化。方法 地高辛标记碱性磷酸酶显色原位杂交。结果 假照组下丘脑和免疫器官即有POMC转录水平的表达，且下丘脑主要定位弓状核。75mGy全身照射后下丘脑POMC mRNA含量减少，1小时内降低明显，12小时仍在继续下降。免疫器官POMC mRNA含量在照射后逐步增加，8小时达顶点，而后开始回降。脾脏变化最明显。结论 低剂量电离辐射照射后下丘脑POMC的减少可能是下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴功能下调的直接原因，从而诱发免疫功能增强。
, http://www.100md.com
Effect of low dose radiation on POMC transcription level in mouse hypothalamus and immune organs Wang Hong,Liu Shuzheng.MH Radiobiology Research Unit,Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021,China.
Objective To disclose the changes in mRNA transcription level of POMC in the hypothalamus and immune organs after low dose radiation.Method In situ hybridization was used to examine the changes of POMC mRNA transcription level in mouse hypothalamus and immune organs following whole body irradiation (WBI) with 75mGy X\|rays.Results There was a basal expression of POMC mRNA in both the hypothalamus and immune organs.POMC mRNA\|positive neurone were located in the arcuate nucleus of hypothalamus.WBI with 75mGy X\|rays could significantly down\|regulate the POMC transcription level that was remarkable within 1h and remained low in the observation period of 12h.POMC transcription level in mouse immune organs increased with time within 8h after irradiation and then began to decrease but still remained at a higher than normal level.The changes of POMC transcription level were more marked in the spleen than in other immune organs.Conclusion These findings suggest that the immediate decrease of POMC transcription level in the hypothalamus might be the direct cause of the down\|regulation of the hypothalamus\|pituitary\|adrenocortical axis after WBI with 75mGy X\|rays,accompanied with an increase in POMC transcription in immune organs.
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Key words Low dose radiation Hypothalamus POMC In situ hybridization
前阿黑皮素(pro\|opiomelanocortin,POMC)是多种生物活性肽的前体，由POMC酶解生成的促肾上腺皮质激素(ACTH)、β-内啡肽(β-EP)和α-促黑激素(α-MSH)等在体内起着十分重要的作用。我室以往的实验证明，低剂量电离辐射可使HPA轴功能下调，免疫功能增强[1]。但对与HPA轴有直接关系的POMC的研究尚未见报道。本实验采用原位杂交的方法，观察低剂量电离辐射作用后小鼠下丘脑和免疫器官POMC转录水平时程的变化。
1 材料和方法
1.1 动物：实验用雄性健康昆明小鼠，体重20±2g，由本校实验动物部提供。随机分为正常对照组和照射组。
, http://www.100md.com 1.2 动物照射：采用飞利浦深部X射线机，电流10mA，电压200kV，滤过板0.5mm Cu,1.0mm Al。球靶与动物皮肤距离212cm，吸收剂量率12.5mGy/min,累积吸收剂量75mGy。正常对照组进行假照射。
1.3 标本制备：见参考文献[1]。
1.4 质粒线性DNA模板的制备：取5μl POMC质粒，加10×buffer 5μl，去离子水35μl，XhoⅠ 2.5μl,DdeⅠ2.0μl,37℃过夜。取出2μl于2%琼脂糖凝胶中电泳。紫外灯下观察，确定酶切全部完成后加入4μl的0.5mol/L EDTA。苯酚和氯仿抽提，冷乙醇沉淀、洗涤，室温干燥，重蒸水溶解核酸沉淀。
1.5 地高辛标记cDNA探针：按地高辛标记试剂盒(德国B.Mannheim)说明书操作。
1.6 原位杂交免疫组织化学：杂交前处理见参考文献[2]。灭菌滤纸吸干后滴加杂交液。杂交液的组成见文献[3]。覆盖蜡膜，43℃保温过夜。SSC逐级冲洗。PBS冲洗。滴加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，室温4小时。NBT和BICP室温显色。PBS冲洗，室温干燥，甘油明胶封片，镜检。
, 百拇医药
1.7 对照实验：用25μg/ml RNA酶预处理切片30分钟，使组织中的mRNA预先被RNA酶降解，然后再进行杂交。
1.8 采用积分指数法(CI)定量分析原位杂交结果。
2 结果
假照组下丘脑弓状核和免疫器官中的免疫细胞即有POMC中等程度的表达。阳性细胞的形态特点为胞浆中充满浅染的紫蓝色颗粒，分布均匀，胞核区无或部分核也见淡染的紫蓝色颗粒。
CI定量分析表明，75mGy全身照射后，随着时间的推移，下丘脑弓状核POMC mRNA含量逐渐减少，1小时内下降即已显著(P<0.01)，12小时仍在继续下降。免疫器官POMC转录水平有所增加，8小时达峰值，并差异有显著性(P<0.05)，而后开始回降。脾脏变化最明显，胸腺次之，淋巴结变化稍轻。
3 讨论
, 百拇医药
POMC衍生肽与神经、内分泌及免疫系统关系密切，在人体分布很广。除了脑垂体和腺垂体的中间部、下丘脑弓状核以外，在肾上腺、脾、胸腺、肺、外周血细胞等组织器官中也有POMC的基因表达[4，5]。下丘脑是内分泌和免疫系统的整合中枢，其神经元的功能状态直接影响着内分泌和免疫功能。现已证明，下丘脑POMC的变化受多种因素的调节。有报道表明，糖皮质激素可抑制下丘脑POMC mRNA的表达；雄激素可促进POMC的表达，也可抑制POMC的表达，报道结果不一致。多巴胺受体的阻断剂及α-肾上腺素能受体的激动剂抑制下丘脑POMC基因的表达。现已证明，这些物质是通过胞膜上的受体，引发一系列的细胞内反应，最终导致POMC基因表达的改变。
我室以往的实验证明，低剂量电离辐射可引起小鼠免疫功能增强[6]，但体外低剂量照射脾细胞未能完全复制此结果[7]。提示免疫功能增强可能受整体系统的调节。在整体系统调节研究中，我们着重研究了HPA轴的功能变化，而POMC又是HPA轴功能调节的重要基因，所以研究低剂量辐射作用后下丘脑POMC表达的变化，对理解低剂量的辐射兴奋效应的发生机理有重要意义。
, 百拇医药
近来的研究表明，75mGy X射线全身照射可诱导小鼠脑和下丘脑c\|fos的转录和表达[2]，同时可引起下丘脑5-HT含量增高[8]，血浆ACTH和CS水平降低[1]。说明低剂量电离辐射可使下丘脑神经元功能改变，而致HPA轴功能下调。本实验证明，低剂量电离辐射作用后下丘脑弓状核POMC转录水平下调，在75mGy X射线照射后1小时即已显著下降，12小时内进一步降低。下丘脑POMC表达的下调可能是HPA轴功能下调的直接原因，致使正常HPA轴对免疫系统张力性抑制作用减弱，因而促进低剂量全身照射后的免疫功能增强。
实验结果表明，75mGy X射线全身照射在降低下丘脑POMC基因转录水平的同时，使免疫器官的POMC转录水平上调，以脾脏最明显，于照射后8小时达峰值，以后于24小时内保持在对照水平以上。已知免疫细胞，包括巨噬细胞、T和B淋巴细胞等，均有ACTH受体，低剂量辐射全身作用后，下丘脑弓状核POMC转录水平下降，使血清ACTH减少[1]，从而使免疫细胞ACTH受体接受的信息减弱，可能通过正反馈作用引起免疫细胞的POMC水平上调。上述实验结果提示，低剂量辐射全身作用后，HPA轴和免疫系统间的双向调节仍然发挥作用，血清ACTH含量在照射后2天降至最低点(约为对照的58%)以后开始回升，于4天达对照的73%，7天恢复正常[1]。在这一时相性变化过程中，淋巴器官及其他外周组织的参与程度有待进一步通过检测POMC相关肽类的分泌水平加以澄清。
, 百拇医药
本课题受国家自然科学基金资助
参考文献
1 刘树铮，赵勇，韩振波，等.下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴功能变化在低剂量辐射诱发免疫增强机制中的作用.中华放射医学与防护杂志，1994，14：11.
2 万虹，龚守良，刘树铮.低剂量电离辐射诱导小鼠脑c\|fos原癌基因的表达.中华放射医学与防护杂志，1996，16：15.
3 苏慧慈.原位杂交.第一版.北京：中国科学技术出版社,1994:72～73.
4 Chowen BU,Fraser HM,Vician L,et al.Testoterone regulation of POMC messenger ribonucleic acid in the arcuate nucleus of the malerat.Endocrinology,1989,124:1697.
, 百拇医药
5 Debold CR,Tudson KM,Wendell EN,et al.Proopiomelanocortin gene is expressed in many normal human tissues and tumors not associated with ectopic adrenocorticotropin syndrome.Mol Endocrinol,1988,2:862.
6 刘树铮.加强辐射兴奋效应机制的研究.中华放射医学与防护杂志，1992，12：1.
7 刘伟宏，刘树铮.低剂量X射线照射对小鼠淋巴细胞丝裂原反应的影响.辐射防护，1992，12：284.
8 龚守良，赵勇，刘树铮.下丘脑-垂体-性腺轴功能在低剂量辐射免疫刺激效应中的作用.中国病理生理杂志，1996，12：231.
(收稿：1996-12-31 修回：1997-03-17), 百拇医药
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关键词：低剂量照射；下丘脑；POMC；原位杂交
中华放射医学与防护杂志980302.htm
目的 观察75mGy X射线全身照射后小鼠下丘脑和免疫器官POMC转录水平的变化。方法 地高辛标记碱性磷酸酶显色原位杂交。结果 假照组下丘脑和免疫器官即有POMC转录水平的表达，且下丘脑主要定位弓状核。75mGy全身照射后下丘脑POMC mRNA含量减少，1小时内降低明显，12小时仍在继续下降。免疫器官POMC mRNA含量在照射后逐步增加，8小时达顶点，而后开始回降。脾脏变化最明显。结论 低剂量电离辐射照射后下丘脑POMC的减少可能是下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴功能下调的直接原因，从而诱发免疫功能增强。
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Effect of low dose radiation on POMC transcription level in mouse hypothalamus and immune organs Wang Hong,Liu Shuzheng.MH Radiobiology Research Unit,Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021,China.
Objective To disclose the changes in mRNA transcription level of POMC in the hypothalamus and immune organs after low dose radiation.Method In situ hybridization was used to examine the changes of POMC mRNA transcription level in mouse hypothalamus and immune organs following whole body irradiation (WBI) with 75mGy X\|rays.Results There was a basal expression of POMC mRNA in both the hypothalamus and immune organs.POMC mRNA\|positive neurone were located in the arcuate nucleus of hypothalamus.WBI with 75mGy X\|rays could significantly down\|regulate the POMC transcription level that was remarkable within 1h and remained low in the observation period of 12h.POMC transcription level in mouse immune organs increased with time within 8h after irradiation and then began to decrease but still remained at a higher than normal level.The changes of POMC transcription level were more marked in the spleen than in other immune organs.Conclusion These findings suggest that the immediate decrease of POMC transcription level in the hypothalamus might be the direct cause of the down\|regulation of the hypothalamus\|pituitary\|adrenocortical axis after WBI with 75mGy X\|rays,accompanied with an increase in POMC transcription in immune organs.
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Key words Low dose radiation Hypothalamus POMC In situ hybridization
前阿黑皮素(pro\|opiomelanocortin,POMC)是多种生物活性肽的前体，由POMC酶解生成的促肾上腺皮质激素(ACTH)、β-内啡肽(β-EP)和α-促黑激素(α-MSH)等在体内起着十分重要的作用。我室以往的实验证明，低剂量电离辐射可使HPA轴功能下调，免疫功能增强[1]。但对与HPA轴有直接关系的POMC的研究尚未见报道。本实验采用原位杂交的方法，观察低剂量电离辐射作用后小鼠下丘脑和免疫器官POMC转录水平时程的变化。
1 材料和方法
1.1 动物：实验用雄性健康昆明小鼠，体重20±2g，由本校实验动物部提供。随机分为正常对照组和照射组。
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1.3 标本制备：见参考文献[1]。
1.4 质粒线性DNA模板的制备：取5μl POMC质粒，加10×buffer 5μl，去离子水35μl，XhoⅠ 2.5μl,DdeⅠ2.0μl,37℃过夜。取出2μl于2%琼脂糖凝胶中电泳。紫外灯下观察，确定酶切全部完成后加入4μl的0.5mol/L EDTA。苯酚和氯仿抽提，冷乙醇沉淀、洗涤，室温干燥，重蒸水溶解核酸沉淀。
1.5 地高辛标记cDNA探针：按地高辛标记试剂盒(德国B.Mannheim)说明书操作。
1.6 原位杂交免疫组织化学：杂交前处理见参考文献[2]。灭菌滤纸吸干后滴加杂交液。杂交液的组成见文献[3]。覆盖蜡膜，43℃保温过夜。SSC逐级冲洗。PBS冲洗。滴加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，室温4小时。NBT和BICP室温显色。PBS冲洗，室温干燥，甘油明胶封片，镜检。
, 百拇医药
1.7 对照实验：用25μg/ml RNA酶预处理切片30分钟，使组织中的mRNA预先被RNA酶降解，然后再进行杂交。
1.8 采用积分指数法(CI)定量分析原位杂交结果。
2 结果
假照组下丘脑弓状核和免疫器官中的免疫细胞即有POMC中等程度的表达。阳性细胞的形态特点为胞浆中充满浅染的紫蓝色颗粒，分布均匀，胞核区无或部分核也见淡染的紫蓝色颗粒。
CI定量分析表明，75mGy全身照射后，随着时间的推移，下丘脑弓状核POMC mRNA含量逐渐减少，1小时内下降即已显著(P<0.01)，12小时仍在继续下降。免疫器官POMC转录水平有所增加，8小时达峰值，并差异有显著性(P<0.05)，而后开始回降。脾脏变化最明显，胸腺次之，淋巴结变化稍轻。
3 讨论
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POMC衍生肽与神经、内分泌及免疫系统关系密切，在人体分布很广。除了脑垂体和腺垂体的中间部、下丘脑弓状核以外，在肾上腺、脾、胸腺、肺、外周血细胞等组织器官中也有POMC的基因表达[4，5]。下丘脑是内分泌和免疫系统的整合中枢，其神经元的功能状态直接影响着内分泌和免疫功能。现已证明，下丘脑POMC的变化受多种因素的调节。有报道表明，糖皮质激素可抑制下丘脑POMC mRNA的表达；雄激素可促进POMC的表达，也可抑制POMC的表达，报道结果不一致。多巴胺受体的阻断剂及α-肾上腺素能受体的激动剂抑制下丘脑POMC基因的表达。现已证明，这些物质是通过胞膜上的受体，引发一系列的细胞内反应，最终导致POMC基因表达的改变。
我室以往的实验证明，低剂量电离辐射可引起小鼠免疫功能增强[6]，但体外低剂量照射脾细胞未能完全复制此结果[7]。提示免疫功能增强可能受整体系统的调节。在整体系统调节研究中，我们着重研究了HPA轴的功能变化，而POMC又是HPA轴功能调节的重要基因，所以研究低剂量辐射作用后下丘脑POMC表达的变化，对理解低剂量的辐射兴奋效应的发生机理有重要意义。
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近来的研究表明，75mGy X射线全身照射可诱导小鼠脑和下丘脑c\|fos的转录和表达[2]，同时可引起下丘脑5-HT含量增高[8]，血浆ACTH和CS水平降低[1]。说明低剂量电离辐射可使下丘脑神经元功能改变，而致HPA轴功能下调。本实验证明，低剂量电离辐射作用后下丘脑弓状核POMC转录水平下调，在75mGy X射线照射后1小时即已显著下降，12小时内进一步降低。下丘脑POMC表达的下调可能是HPA轴功能下调的直接原因，致使正常HPA轴对免疫系统张力性抑制作用减弱，因而促进低剂量全身照射后的免疫功能增强。
实验结果表明，75mGy X射线全身照射在降低下丘脑POMC基因转录水平的同时，使免疫器官的POMC转录水平上调，以脾脏最明显，于照射后8小时达峰值，以后于24小时内保持在对照水平以上。已知免疫细胞，包括巨噬细胞、T和B淋巴细胞等，均有ACTH受体，低剂量辐射全身作用后，下丘脑弓状核POMC转录水平下降，使血清ACTH减少[1]，从而使免疫细胞ACTH受体接受的信息减弱，可能通过正反馈作用引起免疫细胞的POMC水平上调。上述实验结果提示，低剂量辐射全身作用后，HPA轴和免疫系统间的双向调节仍然发挥作用，血清ACTH含量在照射后2天降至最低点(约为对照的58%)以后开始回升，于4天达对照的73%，7天恢复正常[1]。在这一时相性变化过程中，淋巴器官及其他外周组织的参与程度有待进一步通过检测POMC相关肽类的分泌水平加以澄清。
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本课题受国家自然科学基金资助
参考文献
1 刘树铮，赵勇，韩振波，等.下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴功能变化在低剂量辐射诱发免疫增强机制中的作用.中华放射医学与防护杂志，1994，14：11.
2 万虹，龚守良，刘树铮.低剂量电离辐射诱导小鼠脑c\|fos原癌基因的表达.中华放射医学与防护杂志，1996，16：15.
3 苏慧慈.原位杂交.第一版.北京：中国科学技术出版社,1994:72～73.
4 Chowen BU,Fraser HM,Vician L,et al.Testoterone regulation of POMC messenger ribonucleic acid in the arcuate nucleus of the malerat.Endocrinology,1989,124:1697.
, 百拇医药
5 Debold CR,Tudson KM,Wendell EN,et al.Proopiomelanocortin gene is expressed in many normal human tissues and tumors not associated with ectopic adrenocorticotropin syndrome.Mol Endocrinol,1988,2:862.
6 刘树铮.加强辐射兴奋效应机制的研究.中华放射医学与防护杂志，1992，12：1.
7 刘伟宏，刘树铮.低剂量X射线照射对小鼠淋巴细胞丝裂原反应的影响.辐射防护，1992，12：284.
8 龚守良，赵勇，刘树铮.下丘脑-垂体-性腺轴功能在低剂量辐射免疫刺激效应中的作用.中国病理生理杂志，1996，12：231.
(收稿：1996-12-31 修回：1997-03-17), 百拇医药