用荧光原位杂交快速检测医用诊断X射线工作者染色体结构重排及其剂量估算的探讨
作者：王知权 孙元明 李进 青山 乔 刘旭平 王晓琳 唐卫生 王芹
单位：300192 天津，中国医学科学院，中国协和医科大学放射医学研究所(王知权 孙元明、李进、刘旭平、王晓琳、唐卫生、王芹)；日本，滋贺医科大学实验放射学部(青山 乔)
关键词：荧光原位杂交；医用诊断X射线工作者；生物剂量
中华放射医学与防护杂志980416 目的 对早年从事医用诊断X射线工作者作生剂量估算。方法 用4和7号全染色体探针的荧光原位杂交分析染色体的结构性重排。结果 医用诊断X射线组与对照组比，易位率明显增高，用易位率可以推算出医用诊断X射线工作者的生物剂量，与用G带方法所得易位率基本一致。结论 首次用荧光原位杂交技术，对没有或基本没有剂量记载的医用诊断X射线工作者的生物剂量作了估算。
Rapid detectin of chromosome rearrangement in medical diagnostic X-ray workers by using fluorescence in situ gybridization and study on dose estimation. Wang Zhiquan,Sun Yuanming,Li Jin,et al.Institute of Radiation Medicine,CAMS & PUMC
Objective Biological doses were estimated for medical diagnostic X-ray workers.Method Chromosome rearrangements in X-ray workers were analysed by fluorescence in situ hybridization (FISH) with composite whole chromosome paintings 4# and 7#.Results The frequency of translocation in medical diagnostic X-ray workers was much ihgher than thatin control group (P<0.01).The biological doses to individual X-ray workers were calculated by their translocation frequency.The translocation frequencies of both FISH and G-banding were in good agreement.Conclusion The biological doses to X-ray workers are estimated by FISH first when their dosimetry records are not documented.
, 百拇医药
Key words Fluorescence in situ hybridization Medical diagnostic X-ray workers Biological dose
大量的原爆幸存者，事故受照者和慢性职业受照者的细胞遗传学实验已经表明，辐射诱发的稳定性染色体畸变率可在体内数十年基本一致。在可测定的稳定性染色体畸变中，易位占有较大比例。到目前为止，易位的识别可用常规法组型或G显带法，都因费时等因素，而不能普遍地开展。1992年，美国Lawrence Livermore国家实验室(LLNL)建立了荧光原位杂交(FISH)技术，几经发展和改进，已成功地建立了多种射线源的离体剂量-效应关系和用于原爆幸存者和事故受照者物理剂量验证等方面已显现出是一种很有前途的新方法。
流行病学调查的结果表明：医用诊断X射线工作者的白血病、皮肤癌和女性乳腺癌的发病率都明显高于对照组。为了评估患癌的危险度，辐照剂量的估算是至关重要的。迄今为止，人们已经使用了血型糖蛋白A(GPA)，次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因(HPRT)和染色体畸变(CA)等方法来推算剂量，但都存在有操作麻烦，技术性要求高或有一定的局限性等而不能很好的开展。为此，本文作者拟采用新近发展起来的EISH方法来检测染色体结构重排，进而估算医用诊断X射线工作者的接收剂量。
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1 材料和方法
1.1 调查对象：X射线组为23名医用诊断X射线工作者，均为男性，平均放射工龄为35.1年，均在岗工作，1985年前没有剂量记载。对照组10名，为医院中同性别，同年龄段，同工作条件的不接触X射线的医务人员。
1.2 细胞培养和制片：按本实验室操作程序进行[1]。
1.3 原位杂交：用4和7号全染色体探针(美国Oncor公司)，根据该公司操作程序略加改进[2]。
1.4 畸变的识别和计数：用Nikon荧光显微镜在1 000倍油镜下检查中期细胞，用组滤片可同时观察FITC和PI荧光，然后用PI来复核，最后，待荧光淬灭后，再用Giemsa染色作进一步校正。正常中期细胞中有二对黄色金荧光染色体，根据其大小和着丝粒位置可区别4和7号染色体。双色(红色/黄色)染色体上有一个着丝粒(用Giemsa 染色后校正)者，为完全易位或不完全易位，或为插入，均计为一次畸变；双色染色体有两个着丝粒者，为双着丝粒；双色或只带黄色荧光而未见着丝粒者，为无着丝粒断片。若伴有易位或双着丝粒者，只计易位或双着丝粒，无着丝粒断片不单独计数。
, 百拇医药
2 结果
2.1 医用诊断X射线工作者的起始工龄，除X-13为1977年外，其余为1953～1970年，而对照组为1955～1970年。用FISH法分析医用诊断X射线工作者和对照组人员外周血的染色体畸变结果列于表1。
表1 用FISH检测染色体重排的结果 组别
例数
细胞数
基因组
当量
染色体畸变(个/细胞)
t
ins
, 百拇医药
dic
ace
total
X射线组
23
37043
7964
127**
3
7
12
149**
(0.016)
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(0.019
对照组
10
20536
4415
26
1
4
13
44
(0.006)
(0.010)
注：t为易位，ins为插入；dic为双着丝粒；ace为无着丝粒畸变;**P<0.01
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总共分析了57 579个中期细胞，相当于基因组的细胞当量为12 379。基因组当量是观察细胞数乘以被检测染色体DNA含量的百分数[3]，而被检测染色体DNA含量是按Mendelsohn等[4]实验得出。从表1可知，易位在所有畸变中为85%。X射线组的易位频率明显高于对照组，P<0.01。这就表明残存于细胞中的绝大多数畸变 稳定性染色体畸变，其中易位占有明显优势。
2.2 表2列出了每例X射线工作者起始放射工龄，分析中期细胞数和易位率以及根据Straume等[5]推荐的方程H=[(Y-K)/α]Q，H为累积剂量(Gy)，Y为医用诊断X射线工作者的易位率，K为易位的自发畸变率，α为线性平方剂量-效应关系的线性项系数0.030，根据Finnon等[6]以离体X射线照射所诱发的
表2 用FISH检测的易位频率和剂量估算 例数
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起始工龄(年)
细胞数
易位/细胞
生物剂量(Gy)*
X-01
1953
1223
0.023
0.57
X-02
1957
2108
, http://www.100md.com 0.013
0.23
X-03
1958
1410
0.026
0.67
X-04
1958
1072
0.035
0.97
X-05
, 百拇医药
1952
960
0.015
0.30
X-06
1954
2931
0.025
0.63
X-07
1959
1557
0.009
, 百拇医药
0.10
X-08
1954
554
0.017
0.37
X-09
1956
1027
0.014
0.27
X-10
1963
, 百拇医药
1130
0.004
0.00
X-11
1960
1125
0.012
0.20
X-12
1966
7788
0.018
0.40
, 百拇医药
X-13
1977
1711
0.005
0.00
X-14
1965
1530
0.021
0.50
X-15
1960
2446
, 百拇医药
0.010
0.13
X-16
1969
2622
0.018
0.40
X-17
1962
1427
0.042
1.20
X-18
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1969
2936
0.017
0.37
X-19
1970
910
0.010
0.13
X-20
1961
1899
0.017
, http://www.100md.com
0.37
X-21
1963
1169
0.012
0.20
X-22
1967
3492
0.007
0.03
X-23
1970
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1026
0.000
0.00
注：*α 系数来自Finnon等(1995)实验资料
双着丝粒拟合的方程得出的(大量的实验已表明，离休一照射所诱发的相互易位和双着丝粒具有相同的频率)，Q为辐射品质因子。这样，代入相关的系数和数值即可推算出每个医用诊断X射线工作者所接受的一生累积剂量。若按起始放射工龄不同，以1960年为界分为两组，1960年前参加工作组其平均易位率为0.020/细胞，平均累积剂量为0.47Gy，而1960年后组分别为0.014/细胞和0.27Gy。这两组值与我室新近对84例X射线组和17例对照组用G-显带的检测结果和推算出的平均累积剂量基本一致。
3 讨论
, 百拇医药 到目前为止，估算远后效应的生物学指标有GPA，HPRT和稳定性染色体畸变(Cs)等，更多的实验证实，Cs确实是一种估算剂量的好方法，但是Cs法操作繁复，技术性强，阅片要求高，需要大量的人力物力而不便于广泛开展。由美国LLNL建立的荧光原位杂交方法是一种快速，准确和客观检测染色体各类结构性重排，特别是相互易位 方法。经过近几年的实践，已得到国内外学者的一致认可。
有关易位自发频率问题，1988年，Bender等[7]报道未受照射人群的易位率倾向0.5‰～4‰,随后Straum,等[5]和Lucas,等[8]，用FISH法表明的易位率为2.1‰～4.6‰之间，而日本广岛对照照组，易位率高达5.6‰～7.9‰。我们对10例对照者分析的20 536个中期细胞，基因组当量为4 415时，发现的易位率为6‰。与此同时，这一结果与我们室用G-显带法[1]测定的易位率是完全一致的。
1994年，Tucker等[9]用FISH法检测了55例不同年龄段人群，发现稳定性染色体畸变与受检查者年龄的平方之间有明显关系，得出Y(稳定性染色体畸变)=0.0615+0.000304(年龄)2方程。由此可以看出稳定性染色体畸变是随着年龄的增长而逐渐增加的，在稳定性染色体畸变中，易位有非常大的份额。从我们的结果也可以证实在10例对照组中，平均年龄在54岁，他们的易位率也较高。
, 百拇医药
1985年前，医用诊断工作者均没有受照剂量的记载，而1985～1992年间对35个地区的实测的结果，仅为2.0mSv/a，可见受照有效剂量当量是非常非常低，这表明，早年工作条件和X射线机的防护性能差是致使他们受照的主要来源。
Straume,等(1992)[5]还报道了一例长期受到小剂量照射时的剂量验证工作。根据剂量计记录，他接受了0.56Sv的剂量当量，用FISH和G-显带技术，测定其易位率为0.017畸变/细胞，应用H=[(Y-K)/α]Q，推算出该工人的剂量当量为0.60Sv，与实际记载的剂量当量非常吻合。本文作者也应用同一方程。α系数采用Finnon等[6]以X射线为放射源，用FISH法得出的α系数代入方程后算出其生物剂量。和我们用G-显带法测出易位率，进而估算出生物剂量的结果是非常吻合的。这一工作用荧光原位杂交方法，对没有或基本没有剂量记载下的一组职业受照人群的生物剂量作的估算，是一种新的尝试，今后学需积累资料作进一步深入研究。
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参考文献
1 王知权，刘旭平，李 进，等.用稳定性染色体畸变作为莠用诊断X线工作 者生物剂量估算的研究.辐射研究与辐射工艺学报，1996，14：168.
2 王知权，孙元明.荧光原位杂交.见：王继先等编著，放射生物剂量学.北京：原子能出版社，1997，97.
3 Matsuoka A,Tucker JD,Hayashi M,et al.Chromosome painting analysis of X-ray-induced aberrations in human lymphocytes in vitro.Mutagenesis 1994,9:151.
4 Mendelsohn ML,Mayall BH,Bogart E,et al.DN content and DNA-based centromeric index of the 24 human chromosomes.Science,1973,179:1126.
, 百拇医药
5 Straume T,Lucas JN,Tucker JD,et al.Biodosimetry for a radiation worker using multiple assays.Health phy,1992,62:122.
6 Finnon P,Lloyd DC,Edwards AA.Fluorescence in situ hybridization detection of chromosomal aberrations in human lymphocytes:applicability to biological dosimetry.Int Radiat Biol,1995,68:429.
7 Bender MA,Awa AA,Brooks AL,et al.Current status of cytogenetic procedures to detect and quantify previous exposures to radiation.Mutat Res,1988,196:103.
, http://www.100md.com
8 Lucas JN,Hill F,Burk C,et al.Dose-response curve for chromosome translocations measured in human lymphocytes exposed to 60Co gamma rays.Health phy,1995,68:761.
9 Tucker JD,Lee DA,Ramsly MJ,et al.On the frequency of chromosome exchanges in a control population measured by chromosome painting.Mutat Res,1994,313:193.
(收稿：1997-10-31 修回：1997-12-22), 百拇医药
单位：300192 天津，中国医学科学院，中国协和医科大学放射医学研究所(王知权 孙元明、李进、刘旭平、王晓琳、唐卫生、王芹)；日本，滋贺医科大学实验放射学部(青山 乔)
关键词：荧光原位杂交；医用诊断X射线工作者；生物剂量
中华放射医学与防护杂志980416 目的 对早年从事医用诊断X射线工作者作生剂量估算。方法 用4和7号全染色体探针的荧光原位杂交分析染色体的结构性重排。结果 医用诊断X射线组与对照组比，易位率明显增高，用易位率可以推算出医用诊断X射线工作者的生物剂量，与用G带方法所得易位率基本一致。结论 首次用荧光原位杂交技术，对没有或基本没有剂量记载的医用诊断X射线工作者的生物剂量作了估算。
Rapid detectin of chromosome rearrangement in medical diagnostic X-ray workers by using fluorescence in situ gybridization and study on dose estimation. Wang Zhiquan,Sun Yuanming,Li Jin,et al.Institute of Radiation Medicine,CAMS & PUMC
Objective Biological doses were estimated for medical diagnostic X-ray workers.Method Chromosome rearrangements in X-ray workers were analysed by fluorescence in situ hybridization (FISH) with composite whole chromosome paintings 4# and 7#.Results The frequency of translocation in medical diagnostic X-ray workers was much ihgher than thatin control group (P<0.01).The biological doses to individual X-ray workers were calculated by their translocation frequency.The translocation frequencies of both FISH and G-banding were in good agreement.Conclusion The biological doses to X-ray workers are estimated by FISH first when their dosimetry records are not documented.
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Key words Fluorescence in situ hybridization Medical diagnostic X-ray workers Biological dose
大量的原爆幸存者，事故受照者和慢性职业受照者的细胞遗传学实验已经表明，辐射诱发的稳定性染色体畸变率可在体内数十年基本一致。在可测定的稳定性染色体畸变中，易位占有较大比例。到目前为止，易位的识别可用常规法组型或G显带法，都因费时等因素，而不能普遍地开展。1992年，美国Lawrence Livermore国家实验室(LLNL)建立了荧光原位杂交(FISH)技术，几经发展和改进，已成功地建立了多种射线源的离体剂量-效应关系和用于原爆幸存者和事故受照者物理剂量验证等方面已显现出是一种很有前途的新方法。
流行病学调查的结果表明：医用诊断X射线工作者的白血病、皮肤癌和女性乳腺癌的发病率都明显高于对照组。为了评估患癌的危险度，辐照剂量的估算是至关重要的。迄今为止，人们已经使用了血型糖蛋白A(GPA)，次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因(HPRT)和染色体畸变(CA)等方法来推算剂量，但都存在有操作麻烦，技术性要求高或有一定的局限性等而不能很好的开展。为此，本文作者拟采用新近发展起来的EISH方法来检测染色体结构重排，进而估算医用诊断X射线工作者的接收剂量。
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1 材料和方法
1.1 调查对象：X射线组为23名医用诊断X射线工作者，均为男性，平均放射工龄为35.1年，均在岗工作，1985年前没有剂量记载。对照组10名，为医院中同性别，同年龄段，同工作条件的不接触X射线的医务人员。
1.2 细胞培养和制片：按本实验室操作程序进行[1]。
1.3 原位杂交：用4和7号全染色体探针(美国Oncor公司)，根据该公司操作程序略加改进[2]。
1.4 畸变的识别和计数：用Nikon荧光显微镜在1 000倍油镜下检查中期细胞，用组滤片可同时观察FITC和PI荧光，然后用PI来复核，最后，待荧光淬灭后，再用Giemsa染色作进一步校正。正常中期细胞中有二对黄色金荧光染色体，根据其大小和着丝粒位置可区别4和7号染色体。双色(红色/黄色)染色体上有一个着丝粒(用Giemsa 染色后校正)者，为完全易位或不完全易位，或为插入，均计为一次畸变；双色染色体有两个着丝粒者，为双着丝粒；双色或只带黄色荧光而未见着丝粒者，为无着丝粒断片。若伴有易位或双着丝粒者，只计易位或双着丝粒，无着丝粒断片不单独计数。
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2 结果
2.1 医用诊断X射线工作者的起始工龄，除X-13为1977年外，其余为1953～1970年，而对照组为1955～1970年。用FISH法分析医用诊断X射线工作者和对照组人员外周血的染色体畸变结果列于表1。
表1 用FISH检测染色体重排的结果 组别
例数
细胞数
基因组
当量
染色体畸变(个/细胞)
t
ins
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dic
ace
total
X射线组
23
37043
7964
127**
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(0.016)
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(0.019
对照组
10
20536
4415
26
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(0.006)
(0.010)
注：t为易位，ins为插入；dic为双着丝粒；ace为无着丝粒畸变;**P<0.01
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总共分析了57 579个中期细胞，相当于基因组的细胞当量为12 379。基因组当量是观察细胞数乘以被检测染色体DNA含量的百分数[3]，而被检测染色体DNA含量是按Mendelsohn等[4]实验得出。从表1可知，易位在所有畸变中为85%。X射线组的易位频率明显高于对照组，P<0.01。这就表明残存于细胞中的绝大多数畸变 稳定性染色体畸变，其中易位占有明显优势。
2.2 表2列出了每例X射线工作者起始放射工龄，分析中期细胞数和易位率以及根据Straume等[5]推荐的方程H=[(Y-K)/α]Q，H为累积剂量(Gy)，Y为医用诊断X射线工作者的易位率，K为易位的自发畸变率，α为线性平方剂量-效应关系的线性项系数0.030，根据Finnon等[6]以离体X射线照射所诱发的
表2 用FISH检测的易位频率和剂量估算 例数
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起始工龄(年)
细胞数
易位/细胞
生物剂量(Gy)*
X-01
1953
1223
0.023
0.57
X-02
1957
2108
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X-03
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1410
0.026
0.67
X-04
1958
1072
0.035
0.97
X-05
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1952
960
0.015
0.30
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X-07
1959
1557
0.009
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0.10
X-08
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X-11
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1970
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1026
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注：*α 系数来自Finnon等(1995)实验资料
双着丝粒拟合的方程得出的(大量的实验已表明，离休一照射所诱发的相互易位和双着丝粒具有相同的频率)，Q为辐射品质因子。这样，代入相关的系数和数值即可推算出每个医用诊断X射线工作者所接受的一生累积剂量。若按起始放射工龄不同，以1960年为界分为两组，1960年前参加工作组其平均易位率为0.020/细胞，平均累积剂量为0.47Gy，而1960年后组分别为0.014/细胞和0.27Gy。这两组值与我室新近对84例X射线组和17例对照组用G-显带的检测结果和推算出的平均累积剂量基本一致。
3 讨论
, 百拇医药 到目前为止，估算远后效应的生物学指标有GPA，HPRT和稳定性染色体畸变(Cs)等，更多的实验证实，Cs确实是一种估算剂量的好方法，但是Cs法操作繁复，技术性强，阅片要求高，需要大量的人力物力而不便于广泛开展。由美国LLNL建立的荧光原位杂交方法是一种快速，准确和客观检测染色体各类结构性重排，特别是相互易位 方法。经过近几年的实践，已得到国内外学者的一致认可。
有关易位自发频率问题，1988年，Bender等[7]报道未受照射人群的易位率倾向0.5‰～4‰,随后Straum,等[5]和Lucas,等[8]，用FISH法表明的易位率为2.1‰～4.6‰之间，而日本广岛对照照组，易位率高达5.6‰～7.9‰。我们对10例对照者分析的20 536个中期细胞，基因组当量为4 415时，发现的易位率为6‰。与此同时，这一结果与我们室用G-显带法[1]测定的易位率是完全一致的。
1994年，Tucker等[9]用FISH法检测了55例不同年龄段人群，发现稳定性染色体畸变与受检查者年龄的平方之间有明显关系，得出Y(稳定性染色体畸变)=0.0615+0.000304(年龄)2方程。由此可以看出稳定性染色体畸变是随着年龄的增长而逐渐增加的，在稳定性染色体畸变中，易位有非常大的份额。从我们的结果也可以证实在10例对照组中，平均年龄在54岁，他们的易位率也较高。
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1985年前，医用诊断工作者均没有受照剂量的记载，而1985～1992年间对35个地区的实测的结果，仅为2.0mSv/a，可见受照有效剂量当量是非常非常低，这表明，早年工作条件和X射线机的防护性能差是致使他们受照的主要来源。
Straume,等(1992)[5]还报道了一例长期受到小剂量照射时的剂量验证工作。根据剂量计记录，他接受了0.56Sv的剂量当量，用FISH和G-显带技术，测定其易位率为0.017畸变/细胞，应用H=[(Y-K)/α]Q，推算出该工人的剂量当量为0.60Sv，与实际记载的剂量当量非常吻合。本文作者也应用同一方程。α系数采用Finnon等[6]以X射线为放射源，用FISH法得出的α系数代入方程后算出其生物剂量。和我们用G-显带法测出易位率，进而估算出生物剂量的结果是非常吻合的。这一工作用荧光原位杂交方法，对没有或基本没有剂量记载下的一组职业受照人群的生物剂量作的估算，是一种新的尝试，今后学需积累资料作进一步深入研究。
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参考文献
1 王知权，刘旭平，李 进，等.用稳定性染色体畸变作为莠用诊断X线工作 者生物剂量估算的研究.辐射研究与辐射工艺学报，1996，14：168.
2 王知权，孙元明.荧光原位杂交.见：王继先等编著，放射生物剂量学.北京：原子能出版社，1997，97.
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(收稿：1997-10-31 修回：1997-12-22), 百拇医药