重组人骨形成蛋白-2成熟肽对小鼠辐射损伤的治疗作用及其机理的探讨
作者：田琼 张绍章 薄勤 张发科 任东青 陈苏民
单位：710032 西安，第四军医大学放射医学教研室(田琼 张绍章 张发科 任东青)，生物化学教研室(蒲勤 陈苏民)
关键词：重组人骨形成蛋白-2成熟肽；放射损伤；粒巨细胞集落形成单位
中华放射医学与防护杂志980413 目的 探讨重组人骨形成蛋白-2成熟肽(rhBMP-2m)对小鼠经6.5～7.5Gyγ射线全身照射引起的放射损伤的治疗作用及其机理。方法 小鼠照射后1～6天于腹腔内注射rhBMP-2m生理盐水溶液，每天一次，每次剂量为0.5～2.0mg。观察动物的30天存活情况及几种造血指标。结果 治疗组的30天存活率，平均活存时间，CFU-GM集落形成数，骨髓细胞DNA含量，骨髓有核细胞数，脾结节形成数，脾体比及外周血白细胞数均较照射对照组增加，差异有非常显著性(P<0.01)。结论 rhBMP-2m对小鼠的放射损伤有治疗作用，其机理可能同诱导造血因子释放，改善造血微环境，促进造血功能恢复有关。
, 百拇医药
Effect and mechanism of rhBMP-2m on acute hemopoietic radiation injury in mice. Tian Qiong,Zhang Shaozhang,Pu Qin,et al.The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China.
Objective To sytudy the effect of thBMP-2m on irradiated mice.Method 104 male BALB/c mice were randomized to several groups and exposed to 6.5-7.5 Gy whole-body 60Co γ-rays.After irradiation a dose from 0.5 to 2.0 mg rhBMP-2m in saline were injected i.p. once daily in 1-6 consecutive days,and the animals' 30-day survival was scored.Some indices with relation to hematogenesis were observed as well at ninth day after irradiation.Results It was showed that the 30-day survival,mean survival time,count of bone marrow cells,DNA content of bone marrow cells,count of CFU-GM on agar culture,peripheral blood WBC count, spleen/body weight ratio and number of spleen colony formation were all significantly higher in 2.0 mg rhBMP-2m-treated groups than those in the corresponding irradiated controls (P<0.01).Conclusion The beneficial effect of rhBMP-2m on the hemaotogenesis in irradiated mice can be ascribed supposedly to that the rhBMP-2m may induce the release of hematopoietic growth factor(s) in irradiated animal body,or it may act as a hematopoietic growth factor itself,or it may induce a hematopoietic microenvironment to support the growth of stem cells.
, 百拇医药
Key words words rhBMP-2m Acute radiation injury Bone marrow form CFU-GM
1965年Urist报道将纯化的牛骨形成蛋白植入肌袋内，可诱导新的软骨和骨组织形成，以后又获得重组人骨形成蛋白[1]，但骨形成蛋白(BMP)的研究一直侧重于临床骨缺损的修复。在观察软骨和骨组织形成过程中，许多人注意到在BMP诱导部位，有新生骨髓组织形成[2]。我们的实验也观察到纯化的牛BMP植入急性放射损伤的BALB/c小鼠的股部肌袋内，可促进CFU-GM集落形成。本文作者旨在探索重组人骨形成蛋白-2成熟肽对小鼠急性放射损伤的治疗作用及其机理。
1 材料和方法
1.1 动物：BALB/c小鼠104只，雄性，体重19～21g，日龄70～80天。
, 百拇医药
1.2 照射条件：60Coγ射线全身照射，吸收剂量为6.5Gy和7.5Gy，吸收剂量率0.96Gy/min。
1.3 rhBMP-2m:rhBMP-2m是从Ecoli表达制备的114氨基酸的hBMP-2成熟肽。由陈苏民教授提供。该药系冻干品，可溶解于生理盐水，临用时新鲜配制成4.0g/L。
1.4 方法：104只BALB/c小鼠分为两个实验大组。
1.4.1 实验1：观察不同剂量rhBMP-2m对小鼠7.5Gy照射后的治疗作用。BALB/c小鼠80只，随机分为照射对照、治疗1、治疗2和治疗3，四个组。照后1～6天，治疗1、治疗2和治疗3组每只小鼠每天分别腹腔注入(ip)rhBMP-2m 0.5，1.0和2.0mg，对照小鼠ip等量生理盐水，照后30天内，每日记录动物死亡情况，计算30天存活率和死亡动物平均活存天数。
, http://www.100md.com
1.4.2 实验2：观察rhBMP-2m对受6.5Gy γ射线照射小鼠造血组织的保护作用。BALB/c 24只，随机分为对照、对照+rhBMP-2m、照射和照射+rhBMP-2m四个组。照后1～6天，将rhBMP-2m 2.0mg溶于0.5ml生理盐水中ip,每日1次共6次，照后9天，取血查外周血中WBC数，后处死动物，取出小鼠股骨，以1640培养液冲出细胞，检测骨髓细胞总数，并用紫外分光光度计测定其DNA含量，以双层琼脂培养法测定CFU-GM集落形成能力，取脾脏称重，计算脾体比(脾脏与体重之比)，并浸泡在Bouin氏液体中24小时，观察脾结节形成率。
1.5 统计处理：数据以
±s表示，显著性差异采用卡方检验或小样本t检验。
2 结果
2.1 rhBMP-2m对受照小鼠活存的影响(表1)。
, 百拇医药
表1 rhBMP-2m对7.5Gy γ射线全身照射
后小鼠30天活存的影响 组 别
rhBmp-2m剂量
(mg/鼠)
活存数
活存率
(%)
平均活存
(d)
照射对照
0.0
0
, 百拇医药
0
9.5±3.3
治疗1
0.5
2
10
8.5±3.4
治疗2
1.0
3
15
11.8±4.3
治疗3
, 百拇医药
2.0
7
35**
13.2±4.7
注：n=20;与照射对照组比较，**P<0.01
由表1可见，治疗3(rhBMP-2m 2.0mg)与照射对照组相比差异有非常显著性(P<0.01)。
2.2 rhBMP-2m对受照小鼠治疗作用的机理
2.2.1 rhBMP-2m对骨髓细胞的影响(表2)。
表2 rhBMP-2m对小鼠受6.5Gy照后天骨髓细胞的影响 组 别
, 百拇医药
骨髓细胞数
(×109)
骨髓细胞DNA
含量(吸光度，A)
CFU-GM集落数
(×102/股骨)
对 照
12.99±1.26
0.7346±0.002
48.20±0.16
对照+BMP
, http://www.100md.com 10.89±1.03
0.7477±0.002
97.19±0.27
照射对照
2.23±0.04
0.4509±0.001
11.20±0.03
照射+BMP
9.86±1.07
0.6720±0.001**
80.03±0.22
注：n=6；与照射对照组比较，**P<0.01
, http://www.100md.com
2.2.2 rhBMP-2m对外周血WBC脾体比和脾结节形成的作用(表3)。
表3 rhBMP-2m对小鼠6.5Gy照后9天WBC脾体比和脾结节数的影响 组 别
WBC数
(×109/L)
脾体化
脾结节数
对 照
16.33±0.10
0.0065±0.0002……
对照+BMP
, 百拇医药 14.92±0.05
0.0120±0.0002……
照射对照
2.08±0.01
0.0028±0.0001
0.4±0.1
照射+BMP
12.17±0.04**
0.0074±0.0001**
4.7±0.3**
注：n=6；与照射对照组比较，**P<0.01
, http://www.100md.com
3 讨论
BMP是分化因子，尤其能促进早期细胞的分化，它与造血关系密切，能诱导胚胎腹侧中胚层的发生，其结果是形成含有血细胞的“间质球”。BMP植入成年动物的肌肉或皮下，在软骨形成后，血管侵入软骨，小淋巴样细胞聚集，围绕血管出现大量造血干细胞，这些干细胞繁殖。分化就形成了骨髓造血组织。所以研究它对造血组织的作用很有理论和应用意义。
实验结果表明：rhBMP-2m对受7.5Gyγ射线照射的BALB/c小鼠有治疗作用，可增加小鼠30天存活数和延长动物存活时间(表1)。治疗1、治疗2和治疗4组与照射对照组相比分别提高存活率10%、15%和35%，其中治疗3组与照射对照组比较差异有非常显著性，P<0.01。经直线回归说明rhBMP-2m剂量与动物存活率之间呈正相关(r=0.9945)，但何者是rhBMP-2m的最佳剂量和注射次数仍需进一步研究。
小鼠受6.5Gy照后9天，检测与造血有关的指标，包括CFU-GM集落形成数，骨髓细胞DNA含量，骨髓有核细胞数，脾结节形成数；脾体比及外周血白细胞数均明显减少；而照后1～6天ip.2.0mg rhBMP-2m组动物的上述指标均明显增加，与照射对照组比较差异有非常显著性(P<0.01),提示rhBMP-2m对小鼠辐射损伤治疗作用的机理可能或与诱导造血因子释放，或者本身就是一种造血生长因子，或者改善造血微环境[3]，从而促进受照小鼠造血功能恢复有关。但对照+BMP组与对照组相比，除CFU-GM集落数差异有非常显著性(P<0.01)外，其余指标均无统计学意义，其原因值得深入研究。
, http://www.100md.com
参考文献
1 John MW,Vicki R,Anthony JC,et al.Novel regulators of bone formation:Molecular Clones and Activities.Science,1988,242:1528-1534.
2 Kusumoto K,Bessho K,Fujimura K,et al.Comparative study of bone marrow induced by purified BMP and recombinant human BMP-2. Biochem Biophys Rew Commun,1995,215:205-211.
3 Jing A,Vicki R,Karin C,et al.Recombinant human bone morphogenetic protein-2 induces a hematopoietic microenvironment in the rat that supports the growth of stem cells. Exp Hematol,1996,24:768-775.
(收稿：1997-11-05 修回：1998-03-03), http://www.100md.com
单位：710032 西安，第四军医大学放射医学教研室(田琼 张绍章 张发科 任东青)，生物化学教研室(蒲勤 陈苏民)
关键词：重组人骨形成蛋白-2成熟肽；放射损伤；粒巨细胞集落形成单位
中华放射医学与防护杂志980413 目的 探讨重组人骨形成蛋白-2成熟肽(rhBMP-2m)对小鼠经6.5～7.5Gyγ射线全身照射引起的放射损伤的治疗作用及其机理。方法 小鼠照射后1～6天于腹腔内注射rhBMP-2m生理盐水溶液，每天一次，每次剂量为0.5～2.0mg。观察动物的30天存活情况及几种造血指标。结果 治疗组的30天存活率，平均活存时间，CFU-GM集落形成数，骨髓细胞DNA含量，骨髓有核细胞数，脾结节形成数，脾体比及外周血白细胞数均较照射对照组增加，差异有非常显著性(P<0.01)。结论 rhBMP-2m对小鼠的放射损伤有治疗作用，其机理可能同诱导造血因子释放，改善造血微环境，促进造血功能恢复有关。
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Effect and mechanism of rhBMP-2m on acute hemopoietic radiation injury in mice. Tian Qiong,Zhang Shaozhang,Pu Qin,et al.The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China.
Objective To sytudy the effect of thBMP-2m on irradiated mice.Method 104 male BALB/c mice were randomized to several groups and exposed to 6.5-7.5 Gy whole-body 60Co γ-rays.After irradiation a dose from 0.5 to 2.0 mg rhBMP-2m in saline were injected i.p. once daily in 1-6 consecutive days,and the animals' 30-day survival was scored.Some indices with relation to hematogenesis were observed as well at ninth day after irradiation.Results It was showed that the 30-day survival,mean survival time,count of bone marrow cells,DNA content of bone marrow cells,count of CFU-GM on agar culture,peripheral blood WBC count, spleen/body weight ratio and number of spleen colony formation were all significantly higher in 2.0 mg rhBMP-2m-treated groups than those in the corresponding irradiated controls (P<0.01).Conclusion The beneficial effect of rhBMP-2m on the hemaotogenesis in irradiated mice can be ascribed supposedly to that the rhBMP-2m may induce the release of hematopoietic growth factor(s) in irradiated animal body,or it may act as a hematopoietic growth factor itself,or it may induce a hematopoietic microenvironment to support the growth of stem cells.
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Key words words rhBMP-2m Acute radiation injury Bone marrow form CFU-GM
1965年Urist报道将纯化的牛骨形成蛋白植入肌袋内，可诱导新的软骨和骨组织形成，以后又获得重组人骨形成蛋白[1]，但骨形成蛋白(BMP)的研究一直侧重于临床骨缺损的修复。在观察软骨和骨组织形成过程中，许多人注意到在BMP诱导部位，有新生骨髓组织形成[2]。我们的实验也观察到纯化的牛BMP植入急性放射损伤的BALB/c小鼠的股部肌袋内，可促进CFU-GM集落形成。本文作者旨在探索重组人骨形成蛋白-2成熟肽对小鼠急性放射损伤的治疗作用及其机理。
1 材料和方法
1.1 动物：BALB/c小鼠104只，雄性，体重19～21g，日龄70～80天。
, 百拇医药
1.2 照射条件：60Coγ射线全身照射，吸收剂量为6.5Gy和7.5Gy，吸收剂量率0.96Gy/min。
1.3 rhBMP-2m:rhBMP-2m是从Ecoli表达制备的114氨基酸的hBMP-2成熟肽。由陈苏民教授提供。该药系冻干品，可溶解于生理盐水，临用时新鲜配制成4.0g/L。
1.4 方法：104只BALB/c小鼠分为两个实验大组。
1.4.1 实验1：观察不同剂量rhBMP-2m对小鼠7.5Gy照射后的治疗作用。BALB/c小鼠80只，随机分为照射对照、治疗1、治疗2和治疗3，四个组。照后1～6天，治疗1、治疗2和治疗3组每只小鼠每天分别腹腔注入(ip)rhBMP-2m 0.5，1.0和2.0mg，对照小鼠ip等量生理盐水，照后30天内，每日记录动物死亡情况，计算30天存活率和死亡动物平均活存天数。
, http://www.100md.com
1.4.2 实验2：观察rhBMP-2m对受6.5Gy γ射线照射小鼠造血组织的保护作用。BALB/c 24只，随机分为对照、对照+rhBMP-2m、照射和照射+rhBMP-2m四个组。照后1～6天，将rhBMP-2m 2.0mg溶于0.5ml生理盐水中ip,每日1次共6次，照后9天，取血查外周血中WBC数，后处死动物，取出小鼠股骨，以1640培养液冲出细胞，检测骨髓细胞总数，并用紫外分光光度计测定其DNA含量，以双层琼脂培养法测定CFU-GM集落形成能力，取脾脏称重，计算脾体比(脾脏与体重之比)，并浸泡在Bouin氏液体中24小时，观察脾结节形成率。
1.5 统计处理：数据以
±s表示，显著性差异采用卡方检验或小样本t检验。2 结果
2.1 rhBMP-2m对受照小鼠活存的影响(表1)。
, 百拇医药
表1 rhBMP-2m对7.5Gy γ射线全身照射
后小鼠30天活存的影响 组 别
rhBmp-2m剂量
(mg/鼠)
活存数
活存率
(%)
平均活存
(d)
照射对照
0.0
0
, 百拇医药
0
9.5±3.3
治疗1
0.5
2
10
8.5±3.4
治疗2
1.0
3
15
11.8±4.3
治疗3
, 百拇医药
2.0
7
35**
13.2±4.7
注：n=20;与照射对照组比较，**P<0.01
由表1可见，治疗3(rhBMP-2m 2.0mg)与照射对照组相比差异有非常显著性(P<0.01)。
2.2 rhBMP-2m对受照小鼠治疗作用的机理
2.2.1 rhBMP-2m对骨髓细胞的影响(表2)。
表2 rhBMP-2m对小鼠受6.5Gy照后天骨髓细胞的影响 组 别
, 百拇医药
骨髓细胞数
(×109)
骨髓细胞DNA
含量(吸光度，A)
CFU-GM集落数
(×102/股骨)
对 照
12.99±1.26
0.7346±0.002
48.20±0.16
对照+BMP
, http://www.100md.com 10.89±1.03
0.7477±0.002
97.19±0.27
照射对照
2.23±0.04
0.4509±0.001
11.20±0.03
照射+BMP
9.86±1.07
0.6720±0.001**
80.03±0.22
注：n=6；与照射对照组比较，**P<0.01
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2.2.2 rhBMP-2m对外周血WBC脾体比和脾结节形成的作用(表3)。
表3 rhBMP-2m对小鼠6.5Gy照后9天WBC脾体比和脾结节数的影响 组 别
WBC数
(×109/L)
脾体化
脾结节数
对 照
16.33±0.10
0.0065±0.0002……
对照+BMP
, 百拇医药 14.92±0.05
0.0120±0.0002……
照射对照
2.08±0.01
0.0028±0.0001
0.4±0.1
照射+BMP
12.17±0.04**
0.0074±0.0001**
4.7±0.3**
注：n=6；与照射对照组比较，**P<0.01
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3 讨论
BMP是分化因子，尤其能促进早期细胞的分化，它与造血关系密切，能诱导胚胎腹侧中胚层的发生，其结果是形成含有血细胞的“间质球”。BMP植入成年动物的肌肉或皮下，在软骨形成后，血管侵入软骨，小淋巴样细胞聚集，围绕血管出现大量造血干细胞，这些干细胞繁殖。分化就形成了骨髓造血组织。所以研究它对造血组织的作用很有理论和应用意义。
实验结果表明：rhBMP-2m对受7.5Gyγ射线照射的BALB/c小鼠有治疗作用，可增加小鼠30天存活数和延长动物存活时间(表1)。治疗1、治疗2和治疗4组与照射对照组相比分别提高存活率10%、15%和35%，其中治疗3组与照射对照组比较差异有非常显著性，P<0.01。经直线回归说明rhBMP-2m剂量与动物存活率之间呈正相关(r=0.9945)，但何者是rhBMP-2m的最佳剂量和注射次数仍需进一步研究。
小鼠受6.5Gy照后9天，检测与造血有关的指标，包括CFU-GM集落形成数，骨髓细胞DNA含量，骨髓有核细胞数，脾结节形成数；脾体比及外周血白细胞数均明显减少；而照后1～6天ip.2.0mg rhBMP-2m组动物的上述指标均明显增加，与照射对照组比较差异有非常显著性(P<0.01),提示rhBMP-2m对小鼠辐射损伤治疗作用的机理可能或与诱导造血因子释放，或者本身就是一种造血生长因子，或者改善造血微环境[3]，从而促进受照小鼠造血功能恢复有关。但对照+BMP组与对照组相比，除CFU-GM集落数差异有非常显著性(P<0.01)外，其余指标均无统计学意义，其原因值得深入研究。
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参考文献
1 John MW,Vicki R,Anthony JC,et al.Novel regulators of bone formation:Molecular Clones and Activities.Science,1988,242:1528-1534.
2 Kusumoto K,Bessho K,Fujimura K,et al.Comparative study of bone marrow induced by purified BMP and recombinant human BMP-2. Biochem Biophys Rew Commun,1995,215:205-211.
3 Jing A,Vicki R,Karin C,et al.Recombinant human bone morphogenetic protein-2 induces a hematopoietic microenvironment in the rat that supports the growth of stem cells. Exp Hematol,1996,24:768-775.
(收稿：1997-11-05 修回：1998-03-03), http://www.100md.com