胎肝基质细胞强化骨髓移植治疗急性放射病
作者：项莺松 杨如俊 闵 锐 蔡建明 杨 平
单位：200433 上海，第二军医大学放射医学研究室
关键词：骨髓移植；胎肝基质细胞；龛位；急性放射病；急性移植物抗宿主病
中华放射医学与防护杂志980412 目的 为进一步提高骨髓移植效果。方法 以昆明种小鼠急性放射病为模型，进行了胎肝基质细胞强化同种异基因骨髓移植，观察了小鼠造血重建、急性移植物抗宿主病(GVHD)及小鼠活存率。结果 胎肝基质细胞移植可强化骨髓移植效果，与单纯骨髓移植组比较，于照射后第11天小鼠外周血白细胞、骨髓有核细胞计数，CFU-E、CFU-GM、CFU-F、CFU-S回升较快，CFU-F已达正常，于照射后第17天造血得以重建；GVHD较轻，存活率显著提高，达60%。结论 胎肝基质细胞改善了造血微环境，可能既改善了“龛位”，又增加了“龛位”使干细胞更多的植入，促进了造血重建，提高了骨髓移植效果，是一种“种子与土壤”并重的移植新方法。
, http://www.100md.com
Therapy for acute radiation disease with bone marrow transplantation enhanced by fetal liver stromal cells in mice Xiang Yingsong,Yang Rujun,Min Rui,et al.department of Radiation Medicine,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China.
Objective To enhance the grafting efficiency of bone marrow transplantation (BMT)Method The survival rate of mice,hematopoietic reconstitution,and reduction of acute graft versus host disease (GVHD) were studied in an acute radiation disease model of Kungming mice by a mew method of BMT enhanced by addition of fetal liver stromal cells (BNT-FLSt).Results WBC and nucleated cell counts and indexes of restored to normal CFU-E,CFU-GM,CFU-S,especially CFU-F,in BMT-FLSt group were significantly higher than those in the group with BMT alone 11 days after irradiation.And all those indxes in BMT-FLSt group returned to normal 17 days after irradiation.The survival rate of mice in BMT-FLSt group (60%) was also significantly higher than that in the group with BMT alone (30%),and the degree of GVHD in BMT-FLSt group was slighter than that in the group with BMT alone. Conclusion These data suggested that hematopoietic microenvironment could be improved,and "niches" could be both improved and increased by fetal liver stromal cell transplantation; so,fetal liver stromal cells could prompt hematopietic reconstitation and enhance engrafting efficiency.
, 百拇医药
Key words Bone marrow transplantaition Niche Fetal liver stromal cells Graft versus host disease Acute radiation disease
放射损伤使造血干细胞和造血微环境中的“龛位”都受到损伤，如果在移植干细胞的基础上移植胎肝基质细胞就可以改善造血微环境，就可能改善“龛位”，增加“龛位”，使干细胞更多的植入，强化骨髓移植效果，这将是一种“种子与土壤”并重的移植新方法。
1 材料和方法
1.1 试剂：EPO、GM-CSF、甲基纤维素、琼脂购自sigma公司。小牛血清、牛血清白蛋白购自杭州四季青生物制品研究所。
1.2 动物及饲养：昆明种小鼠，6～8周龄，体重22±2g，昆明种孕鼠，头胎，胎龄15±1天，均为第二军医大学动物中心提供。受体鼠预处理为60Coγ射线照射，吸收剂量率为1.5Gy/min，总吸收剂量为8.0Gy。各移植小鼠放入洁净动物饲养柜内精心饲养，均不给予GVHD预防药物，以存活60天的动物数为存活数。
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1.3 细胞制备：按常规方法[1]制备骨髓单个核细胞和胎肝细胞、胎肝基质细胞后直接投入-80℃深低温冰箱保存[2]。冷冻液不加血清，复苏后立即回输给受体小鼠。
1.4 造血重建指标的测定：于照后第11，17天，按常规方法进行外周血细胞、骨髓有核细胞计数，及CFU-E、CFU-GM、CFU-F、CFU-S的测定。
1.5 GVHD的观察：取照后第35天存活小鼠的足垫、肝脏、小肠肠管作病理学检查。
1.6 统计学方法：活存率用χ2检验，各计数资料用t检验。
2 结果
2.1 胎肝基质细胞移植：由表1可见，胎肝基质细胞4×106个移植组与胎肝细胞2×107个移植组动物存活率相同，与对照组比较经统计学处理两组差异有显著性，但是胎肝基质细胞移植与胎肝移植组比较死亡动物平均活存天数要少4天，初步反映了胎肝基质细胞能够改善造血微环境，可促进移植的干祖细胞或残存的自身干祖细胞增殖分化，使造血重建。一人为胎肝移植提高小鼠存活率的一个主要机制是由于移植了胎肝造血干细胞，但是表1结果却提示胎肝基质细胞是胎肝移植发挥作用的一个重要原因。
, 百拇医药
2.2 胎肝基质细胞移植对骨髓移植小鼠存活率的影响：在移植相同数量的骨髓细胞时，先
表1 胎肝基质细胞移植对受照小鼠
存活的影响(
±s) 组别
动物数
细胞数量
存活率
(%)
死亡动物平
均活存天数
(天)
, 百拇医药 胎肝基质细胞
30
4×106
30
8.8±1.75**
胎肝细胞
30
4×107
30
12.9±2.14
空白对照
30
, http://www.100md.com
0
0
8.3±2.14
注：与胎肝细胞移植组，**P<0.01
移植胎肝细胞或胎肝基质细胞，能显著提高小鼠存活率，进一步表明胎肝基质细胞移植能促进干祖细胞的植入，并加快增殖分化，增强骨髓移植效果(表2)。我们称这种移植方法为胎肝基质强化骨髓移植。表2 胎肝基质细胞移植对骨髓
移植小鼠活存率的影响 组别
细胞数量
动物数
活存率(%)
胎肝细胞+骨髓
, 百拇医药
2×107+1×107
30
60**
基质细胞+骨髓
4×106+1×107
30
60**
骨髓细胞
1×107
30
30
, http://www.100md.com
胎肝细胞
2×107
30
30
注：与骨髓细胞移植组比，**P<0.01
2.3 胎肝基质强化骨髓移植对小鼠外周血白细胞、骨髓有核细胞计数的影响：由表3可见，于照后第11天胎肝基质强化骨髓移植与单纯骨髓移植组比较，前者外周血白细胞、骨髓有核细胞计数回升更快，于照后第17天接近正常值范围。表3 胎肝基质细胞强化骨髓移植对受照小鼠外周血白细胞和骨髓有核细胞的影响(
±s)
组别
动物数
, 百拇医药
外周血白细胞(×109/L)
骨髓有核细胞(×106/股骨)
11d
17d
11d
17d
基质细胞强化移植
10
1.20±0.08
6.20±0.56
20.30±0.45
41.80±2.88
, 百拇医药
单纯骨髓移植
10
0.96±0.06
4.50±0.21
16.20±0.76
32.90±2.65
正常对照组
10
10.89±0.66
10.88±0.57
71.40±5.09
56.60±3.29
, 百拇医药
照射对照组
10
—
—
—
—
注：表示照射对照组小鼠在照射后第11天前已经死亡，指标未测，以下相同
2.4 胎肝基质强化骨髓移植对小鼠造血干祖细胞的影响：胎肝基质细胞强化骨髓移植组于照后第11天造血祖细胞CFU-E、CFU-GM的恢复比单纯骨髓移植组稍快但未达显著效果，而于照后第17天达正常水平，与正常对照组比较夫统计学差别。造血基质祖细胞CFU-F的恢复更快，于照后第11天已达正常。造血干细胞CFU-S的恢复是较慢的，于照后第17天恢复至正常水平(表4)，但比单纯骨髓移植组要好。
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2.5 胎肝基质强化骨髓移植对急性GVHD的影响：单纯骨髓移植组小鼠均出现皮肤基底层水肿变性、嗜酸性变；肝细胞变性、坏死，胆小管塞；小肠绒毛末端坏死脱落、肠腺减少。病理改变GVHDⅡ～Ⅲ级。胎肝基质强化骨髓移植组小鼠仅见皮肤少量淋巴细胞浸润，部分病理切片有轻度嗜酸性，肝细胞轻度水肿变性，小肠粘膜水肿。病理改变轻，GVHDⅠ级。
表4 胎肝基质细胞强化骨髓移植对受照小鼠骨髓造血干祖细胞的影响(
±s) 组别
CFU-GM/105BMC
CFU-E/105BMC
CFU-F/5×105BMC
, 百拇医药 CFU-S/105BMC
11d
17d
11d
17d
11d
17d
11d
17d
胎肝强化移植
60.0±6.4
100.0±5.4*
, 百拇医药
200.0±30.3
330±9.5*
12.2±2.0
13.4±1.8
10.8±3.5
20.5±1.5
单纯骨髓移植
46.0±6.2
48.0±2.4
135.0±11.9
228.0±14.1
8.4±2.9
, 百拇医药
12.2±1.9...
12.6±3.5
正常对照组
93.0±5.8
112.0±8.8
405.0±16.6
334.0±10.4
13.4±1.1
14.4±1.2
21.6±1.8
21.0±5.1
照射对照组
, 百拇医药
—
—
—
—
—
注：*表示与正常组比，*表示P>0.05；...表示CFU-S测定失败；CFU-GM,CFU-S的试验动物数为8只；CFU-F的试验动物数为6只
3 讨论
胎肝中存在造血基质祖细胞CFU-F，数量约为(16～18)/106胎肝细胞[3]，这些基质细胞是可以移植的，可在受体内增殖分化，并分泌和局部富集多种造血调控因子，形成供造血干祖细胞增殖分化的调控小区-“龛位”[4]。造血系统受放射损伤后一方面使干祖细胞发生增殖期死亡(reproductive death)，在不同时间内腾出“龛拉”，供移植的干祖细胞植入[5]；另一方面也损伤了造血微环境，CFU-F的D0值为137cGy，致死剂量照射后发生间质充血水肿，淋巴细胞浸润，出血坏死，骨髓空虚，晚期可发生纤维性变，使“龛位”在数量上和质量上都受到损伤，而不利于干细胞更多更好地植入。先移植胎肝基质细胞就可以改善造血微环境，通过细胞与细胞间的相互作用以及分泌多种造血调控因子，就可能改善“龛位”与增加“龛位”，有利于干细胞植入和增殖分化，促进造血重建。文献报道骨髓CFU-F与骨髓细胞混输能使小鼠造血重建加快[6]，胎肝基质细胞还可促进免疫功能重建[7]。在我们的实验中，胎肝基质细胞移植能提高小鼠存活率，也说明了胎肝基质细胞能促进造血重建，是胎肝移植发挥作用的一个重要原因。先移植胎肝基质细胞再移植骨髓细胞的胎肝基质细胞强化骨髓移植方法，CFU-F恢复更早，“龛位”恢复更好更多，干细胞植入增加，增殖分化加快，从而促进了造血重建。此外，移植的胎肝基质细胞中，也可能存在着幼稚细胞，可分泌多种抑制因子，可抑制GVHD的发生[8]，进一步提高小鼠存活率。这种移植方法未查到文献报道，是一种“种子与土壤”并重的移植新方法。
, 百拇医药
参考文献
1 Zhao S F,Wu C T.Comparison of the hemopoietic growth factors produced during in vitro culture of murine and human fetal liver cells.Exp Hematol,1990,18:367.
2 朱为国，邢献志，吴霭，等.人脐血造血干细胞深低温保存效果观察.中华血液学杂志，1994，15：291.
3 黄东生，谭汉君，陈家佩，等.人脐血、成人骨髓和小鼠骨髓杨纤维细胞系祖细胞培养.实验血液学杂志，1995，3：433.
4 Weissman IL.Developmental switches in the immune system.Cell,1994,76:207.
, 百拇医药
5 Jamali M,Tratt KR.Persistent increase in the rates of apoptosis and dicentric chromosomes in surviving V79 cells after X-irradiation.Int J Radiat Biol,1996,70:705.
6 张辛茹，刘及.不同剂量全身照射的造血基质祖细胞对造血组织放射损伤修复的影响.白求恩医科大学学报，1989，13：388.
7 高汉林，谢蜀生，杨四旬，等.胸腺基质细胞促进骨髓移植小鼠免疫功能重建.中华免疫学杂志，1995，16：81.
8 陈欢，郭乃榄，郑缓，等.应用胎肝与胎胸腺输注预防移植物抗宿主病。中华血液学杂志，1996，17：73.
(收稿：1997-09-1 修回：1997-10-27), 百拇医药
单位：200433 上海，第二军医大学放射医学研究室
关键词：骨髓移植；胎肝基质细胞；龛位；急性放射病；急性移植物抗宿主病
中华放射医学与防护杂志980412 目的 为进一步提高骨髓移植效果。方法 以昆明种小鼠急性放射病为模型，进行了胎肝基质细胞强化同种异基因骨髓移植，观察了小鼠造血重建、急性移植物抗宿主病(GVHD)及小鼠活存率。结果 胎肝基质细胞移植可强化骨髓移植效果，与单纯骨髓移植组比较，于照射后第11天小鼠外周血白细胞、骨髓有核细胞计数，CFU-E、CFU-GM、CFU-F、CFU-S回升较快，CFU-F已达正常，于照射后第17天造血得以重建；GVHD较轻，存活率显著提高，达60%。结论 胎肝基质细胞改善了造血微环境，可能既改善了“龛位”，又增加了“龛位”使干细胞更多的植入，促进了造血重建，提高了骨髓移植效果，是一种“种子与土壤”并重的移植新方法。
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Therapy for acute radiation disease with bone marrow transplantation enhanced by fetal liver stromal cells in mice Xiang Yingsong,Yang Rujun,Min Rui,et al.department of Radiation Medicine,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China.
Objective To enhance the grafting efficiency of bone marrow transplantation (BMT)Method The survival rate of mice,hematopoietic reconstitution,and reduction of acute graft versus host disease (GVHD) were studied in an acute radiation disease model of Kungming mice by a mew method of BMT enhanced by addition of fetal liver stromal cells (BNT-FLSt).Results WBC and nucleated cell counts and indexes of restored to normal CFU-E,CFU-GM,CFU-S,especially CFU-F,in BMT-FLSt group were significantly higher than those in the group with BMT alone 11 days after irradiation.And all those indxes in BMT-FLSt group returned to normal 17 days after irradiation.The survival rate of mice in BMT-FLSt group (60%) was also significantly higher than that in the group with BMT alone (30%),and the degree of GVHD in BMT-FLSt group was slighter than that in the group with BMT alone. Conclusion These data suggested that hematopoietic microenvironment could be improved,and "niches" could be both improved and increased by fetal liver stromal cell transplantation; so,fetal liver stromal cells could prompt hematopietic reconstitation and enhance engrafting efficiency.
, 百拇医药
Key words Bone marrow transplantaition Niche Fetal liver stromal cells Graft versus host disease Acute radiation disease
放射损伤使造血干细胞和造血微环境中的“龛位”都受到损伤，如果在移植干细胞的基础上移植胎肝基质细胞就可以改善造血微环境，就可能改善“龛位”，增加“龛位”，使干细胞更多的植入，强化骨髓移植效果，这将是一种“种子与土壤”并重的移植新方法。
1 材料和方法
1.1 试剂：EPO、GM-CSF、甲基纤维素、琼脂购自sigma公司。小牛血清、牛血清白蛋白购自杭州四季青生物制品研究所。
1.2 动物及饲养：昆明种小鼠，6～8周龄，体重22±2g，昆明种孕鼠，头胎，胎龄15±1天，均为第二军医大学动物中心提供。受体鼠预处理为60Coγ射线照射，吸收剂量率为1.5Gy/min，总吸收剂量为8.0Gy。各移植小鼠放入洁净动物饲养柜内精心饲养，均不给予GVHD预防药物，以存活60天的动物数为存活数。
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1.3 细胞制备：按常规方法[1]制备骨髓单个核细胞和胎肝细胞、胎肝基质细胞后直接投入-80℃深低温冰箱保存[2]。冷冻液不加血清，复苏后立即回输给受体小鼠。
1.4 造血重建指标的测定：于照后第11，17天，按常规方法进行外周血细胞、骨髓有核细胞计数，及CFU-E、CFU-GM、CFU-F、CFU-S的测定。
1.5 GVHD的观察：取照后第35天存活小鼠的足垫、肝脏、小肠肠管作病理学检查。
1.6 统计学方法：活存率用χ2检验，各计数资料用t检验。
2 结果
2.1 胎肝基质细胞移植：由表1可见，胎肝基质细胞4×106个移植组与胎肝细胞2×107个移植组动物存活率相同，与对照组比较经统计学处理两组差异有显著性，但是胎肝基质细胞移植与胎肝移植组比较死亡动物平均活存天数要少4天，初步反映了胎肝基质细胞能够改善造血微环境，可促进移植的干祖细胞或残存的自身干祖细胞增殖分化，使造血重建。一人为胎肝移植提高小鼠存活率的一个主要机制是由于移植了胎肝造血干细胞，但是表1结果却提示胎肝基质细胞是胎肝移植发挥作用的一个重要原因。
, 百拇医药
2.2 胎肝基质细胞移植对骨髓移植小鼠存活率的影响：在移植相同数量的骨髓细胞时，先
表1 胎肝基质细胞移植对受照小鼠
存活的影响(
±s) 组别动物数
细胞数量
存活率
(%)
死亡动物平
均活存天数
(天)
, 百拇医药 胎肝基质细胞
30
4×106
30
8.8±1.75**
胎肝细胞
30
4×107
30
12.9±2.14
空白对照
30
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0
0
8.3±2.14
注：与胎肝细胞移植组，**P<0.01
移植胎肝细胞或胎肝基质细胞，能显著提高小鼠存活率，进一步表明胎肝基质细胞移植能促进干祖细胞的植入，并加快增殖分化，增强骨髓移植效果(表2)。我们称这种移植方法为胎肝基质强化骨髓移植。表2 胎肝基质细胞移植对骨髓
移植小鼠活存率的影响 组别
细胞数量
动物数
活存率(%)
胎肝细胞+骨髓
, 百拇医药
2×107+1×107
30
60**
基质细胞+骨髓
4×106+1×107
30
60**
骨髓细胞
1×107
30
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胎肝细胞
2×107
30
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注：与骨髓细胞移植组比，**P<0.01
2.3 胎肝基质强化骨髓移植对小鼠外周血白细胞、骨髓有核细胞计数的影响：由表3可见，于照后第11天胎肝基质强化骨髓移植与单纯骨髓移植组比较，前者外周血白细胞、骨髓有核细胞计数回升更快，于照后第17天接近正常值范围。表3 胎肝基质细胞强化骨髓移植对受照小鼠外周血白细胞和骨髓有核细胞的影响(
±s)组别
动物数
, 百拇医药
外周血白细胞(×109/L)
骨髓有核细胞(×106/股骨)
11d
17d
11d
17d
基质细胞强化移植
10
1.20±0.08
6.20±0.56
20.30±0.45
41.80±2.88
, 百拇医药
单纯骨髓移植
10
0.96±0.06
4.50±0.21
16.20±0.76
32.90±2.65
正常对照组
10
10.89±0.66
10.88±0.57
71.40±5.09
56.60±3.29
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照射对照组
10
—
—
—
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注：表示照射对照组小鼠在照射后第11天前已经死亡，指标未测，以下相同
2.4 胎肝基质强化骨髓移植对小鼠造血干祖细胞的影响：胎肝基质细胞强化骨髓移植组于照后第11天造血祖细胞CFU-E、CFU-GM的恢复比单纯骨髓移植组稍快但未达显著效果，而于照后第17天达正常水平，与正常对照组比较夫统计学差别。造血基质祖细胞CFU-F的恢复更快，于照后第11天已达正常。造血干细胞CFU-S的恢复是较慢的，于照后第17天恢复至正常水平(表4)，但比单纯骨髓移植组要好。
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2.5 胎肝基质强化骨髓移植对急性GVHD的影响：单纯骨髓移植组小鼠均出现皮肤基底层水肿变性、嗜酸性变；肝细胞变性、坏死，胆小管塞；小肠绒毛末端坏死脱落、肠腺减少。病理改变GVHDⅡ～Ⅲ级。胎肝基质强化骨髓移植组小鼠仅见皮肤少量淋巴细胞浸润，部分病理切片有轻度嗜酸性，肝细胞轻度水肿变性，小肠粘膜水肿。病理改变轻，GVHDⅠ级。
表4 胎肝基质细胞强化骨髓移植对受照小鼠骨髓造血干祖细胞的影响(
±s) 组别CFU-GM/105BMC
CFU-E/105BMC
CFU-F/5×105BMC
, 百拇医药 CFU-S/105BMC
11d
17d
11d
17d
11d
17d
11d
17d
胎肝强化移植
60.0±6.4
100.0±5.4*
, 百拇医药
200.0±30.3
330±9.5*
12.2±2.0
13.4±1.8
10.8±3.5
20.5±1.5
单纯骨髓移植
46.0±6.2
48.0±2.4
135.0±11.9
228.0±14.1
8.4±2.9
, 百拇医药
12.2±1.9...
12.6±3.5
正常对照组
93.0±5.8
112.0±8.8
405.0±16.6
334.0±10.4
13.4±1.1
14.4±1.2
21.6±1.8
21.0±5.1
照射对照组
, 百拇医药
—
—
—
—
—
注：*表示与正常组比，*表示P>0.05；...表示CFU-S测定失败；CFU-GM,CFU-S的试验动物数为8只；CFU-F的试验动物数为6只
3 讨论
胎肝中存在造血基质祖细胞CFU-F，数量约为(16～18)/106胎肝细胞[3]，这些基质细胞是可以移植的，可在受体内增殖分化，并分泌和局部富集多种造血调控因子，形成供造血干祖细胞增殖分化的调控小区-“龛位”[4]。造血系统受放射损伤后一方面使干祖细胞发生增殖期死亡(reproductive death)，在不同时间内腾出“龛拉”，供移植的干祖细胞植入[5]；另一方面也损伤了造血微环境，CFU-F的D0值为137cGy，致死剂量照射后发生间质充血水肿，淋巴细胞浸润，出血坏死，骨髓空虚，晚期可发生纤维性变，使“龛位”在数量上和质量上都受到损伤，而不利于干细胞更多更好地植入。先移植胎肝基质细胞就可以改善造血微环境，通过细胞与细胞间的相互作用以及分泌多种造血调控因子，就可能改善“龛位”与增加“龛位”，有利于干细胞植入和增殖分化，促进造血重建。文献报道骨髓CFU-F与骨髓细胞混输能使小鼠造血重建加快[6]，胎肝基质细胞还可促进免疫功能重建[7]。在我们的实验中，胎肝基质细胞移植能提高小鼠存活率，也说明了胎肝基质细胞能促进造血重建，是胎肝移植发挥作用的一个重要原因。先移植胎肝基质细胞再移植骨髓细胞的胎肝基质细胞强化骨髓移植方法，CFU-F恢复更早，“龛位”恢复更好更多，干细胞植入增加，增殖分化加快，从而促进了造血重建。此外，移植的胎肝基质细胞中，也可能存在着幼稚细胞，可分泌多种抑制因子，可抑制GVHD的发生[8]，进一步提高小鼠存活率。这种移植方法未查到文献报道，是一种“种子与土壤”并重的移植新方法。
, 百拇医药
参考文献
1 Zhao S F,Wu C T.Comparison of the hemopoietic growth factors produced during in vitro culture of murine and human fetal liver cells.Exp Hematol,1990,18:367.
2 朱为国，邢献志，吴霭，等.人脐血造血干细胞深低温保存效果观察.中华血液学杂志，1994，15：291.
3 黄东生，谭汉君，陈家佩，等.人脐血、成人骨髓和小鼠骨髓杨纤维细胞系祖细胞培养.实验血液学杂志，1995，3：433.
4 Weissman IL.Developmental switches in the immune system.Cell,1994,76:207.
, 百拇医药
5 Jamali M,Tratt KR.Persistent increase in the rates of apoptosis and dicentric chromosomes in surviving V79 cells after X-irradiation.Int J Radiat Biol,1996,70:705.
6 张辛茹，刘及.不同剂量全身照射的造血基质祖细胞对造血组织放射损伤修复的影响.白求恩医科大学学报，1989，13：388.
7 高汉林，谢蜀生，杨四旬，等.胸腺基质细胞促进骨髓移植小鼠免疫功能重建.中华免疫学杂志，1995，16：81.
8 陈欢，郭乃榄，郑缓，等.应用胎肝与胎胸腺输注预防移植物抗宿主病。中华血液学杂志，1996，17：73.
(收稿：1997-09-1 修回：1997-10-27), 百拇医药