云锡矿工肺癌组织cDNA文库的构建
作者：杨梅英 叶常青 姚树祥 刘雷华 张俊
单位：杨梅英、叶常青、刘雷华：100850，北京放射医学研究所；姚树祥、张俊：个旧锡业公司劳动防护研究所
关键词：
中华放射医学与防护杂志990215 肺癌是世界上最常见的肿瘤之一，其死亡率占癌症死亡率的25%[1]。电离辐射是诱发肺癌的主要物理因素之一。由氡及其短寿命子体所释放的α粒子诱发的肺癌占辐射诱发肺癌的50%。氡及其短寿命子体所致肺癌首先在矿工中得以证实[2]。云南锡业公司矿工是国内矿工肺癌发生率高的一组病例[3]。用分子水平深入研究此组病例有助于阐明氡诱发肺癌发病的分子机理，可以推动氡致肺癌的防、诊、治措施的建立，为此我们构建了云锡矿工肺癌组织cDNA文库。
一、材料和方法
, 百拇医药
1.肺癌组织：云锡矿工肺癌2例，经临床确诊为职业性肺癌，经外科切除的癌组织，样品在无菌条件下置液氮中速冻保存，干冰运输。
2.试剂和试剂盒：总RNA提取系统、poly(A)+RNA分离系统购自Promega公司。cDNA合成系统、cDNA克隆系统购自Clontech公司。噬菌体λTriplExTM克隆位点附近双向引物在北京生物工程公司合成。其上游引物为：5′CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTG3′，下游引物为：5′ATTATGCTGAGTGATATCCCGCTT3′。PCR试剂及DNA扩增仪为Perkin Elmer Cetus公司产品。
3.总RNA提取及mRNA的纯化：取液氮中保存的肺癌组织约1克，直接用硫氰酸胍法提取总RNA。总RNA溶于无RNase的去离子水中，65℃加热10分钟，加入生物素标记的oligo(dT)探针及可结合生物素的球形磁珠(SA-PMPS)，用磁力架收集poly(A)+mRNA-oligo(dT)-生物素-亲和素-磁珠，洗涤后，mRNA溶于无RNase去离子水中。所得mRNA用于合成cDNA。
, 百拇医药
4.cDNA的合成：按Clontech公司试剂盒说明书进行。采用oligo(dT)(dN)15作为引物，在MMLV(H-)反转录酶作用下，以mRNA为模板合成cDNA第一链。然后在第一链反应物中加入第二链混合酶和T4DNA聚合酶合成钝性第二链。在T4DNA连接酶的作用下，将含有磷酸化EcoRI的接头与第二链连接。经Size fractionation 柱除去小于500 bp的cDNA片段，双链cDNA片段与去磷酸化的λTriplEx臂连接，体外包装，转化宿主菌XL1-Blue，在转化过程中加入IPTG和X-Gal以区分重组(白色)与非重组(蓝色)噬菌斑。铺LB平板测定重组率和滴度。
5.PCR法鉴定cDNA文库：从cDNA文库中随机挑取10个白斑和2个蓝斑扩增，提取DNA作为模板，加入50 μl PCR反应混合物中，加入0.1 μg的PCR上下游引物，PCR反应条件为：94℃30秒，58℃1.5分钟，72℃2分钟，40循环→72℃5分钟→4℃。反应结束后延伸5分钟。0.8%琼脂糖电泳鉴定PCR产物。
, http://www.100md.com
二、结果
1.总RNA制备和poly(A)+RNA分离：1克肺癌组织可得总RNA 800 μg左右，OD 260/OD 280>2.0，甲醛变性凝胶电泳显示有28 s和18 s两条清晰带，表明RNA无降解，无DNA污染。
2.cDNA的克隆：cDNA片段与去磷酸λTriplEx EcoRI臂按不同比例连接后，进行体外包装，感染XL1-Blue，测定滴度和重组率。本文库的滴度为6.3×106，重组率>95%。
3.PCR法鉴定重组子：从文库中随机挑10个白斑，2个蓝斑，PCR法扩增其插入片段。扩增产物经0.8%琼脂糖电泳显示，所有白色噬菌斑均能扩增出特异DNA片段，而蓝色噬菌斑仅见引物带(见图1)。
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图1 PCR法筛选肺癌组织cDNA文库
1为PCR Marker;2-6分别为PCR产物
三、讨论
哺乳动物细胞含有10 000～30 000种不同的mRNA。按丰度可分为低丰度、中丰度和高丰度3种，其中低丰度mRNA占总mRNA 30% 左右，每一细胞拥有的拷贝<14，要克隆低丰度mRNA，可按Clarke和Carbon公式对文库大小进行估计：N=ln(1-P)/ln(1-1/n)(P为克隆到特定cDNA的概率，n为一种稀有mRNA在总mRNA中所占的比例，N=所需克隆数)，若要求以99%概率得到一低丰度的克隆，所需的文库克隆数为1.7×105[4]。我们所建文库已达到这一标准，因此用此文库筛选目的基因是适当的。
在cDNA文库的构建中，合成全长的cDNA双链在基因的分离、鉴定和表达过程中是十分重要的。在本实验，对所采用的合成cDNA的方法做了部分改进。首先采用由Clontech公司提供的一种新的合成第一链所需的缓冲液。其次，反转录酶采用基因工程生产的MMLV反转录酶，使酶促反应的最适温度提高到42℃，此酶不含有RNAH-活性，优于AMV反转录酶。另外在合成cDNA第一链时所用寡核苷酸引物末端引入A、G、C，使引物锚定在poly A 尾的起始位置，这样消除了反转录很长的poly A 尾，增加cDNA合成的有效性[5]。
, 百拇医药
在构建cDNA文库时，由于噬菌体的体外包装效率超过质粒对细菌的转化，具有很强的感染力，多数人都选择它们作为载体，以构建更能反应各种低丰度mRNA的高效价文库。本实验采用了一种罕见的载体λTriplEx，此载体含有三种阅读框架，在阅读框架中含有两个翻译起始位点和一个滑动位点，翻译起始位点包括核糖体结合位点和ATG起始密码。滑动位点位于第二起始位点和多克隆位点之间，在转录过程中引起RNA聚合酶跳读核苷酸致使在翻译过程中核糖体移动阅读框架，当核糖体开始翻译插入片段时，大约1/3均在三个阅读框架之中，从而增加了寻找所需克隆的可能性。
我们应用最新的cDNA合成方法，构建了云锡矿工肺癌组织的cDNA文库，为我们今后发现与致癌相关的新基因，研究其生理功能及在致癌过程中的作用奠定了一定的基础。
本课题受国家自然科学基金资助(项目号：39600043)
参考文献
, http://www.100md.com
1 Doolittle DJ, Furlong JW, Butterworth BE, et al. Assessment of chemically induced DNA repair in primary culture human epithelial cell. Toxico Appl Pharmacol, 1985, 79:28-38.
2 Hussain SP, Kennedy CH, Amstad P, et al. Radon and lung carcinogenesis:mutabi-lity of p53 codons 249 and 250 to 238Pu alpha-particles in human bronchial cell. Carcinogenesis, 1997, 18:121-125.
3 Yao Shuxiang, Lubin JH, Qiao YL, et al. Exposure to radon progeny, tobacco and lung in a case-control study in Southern China. Radiat Res, 1994, 138:326-336.
, 百拇医药
4 Clarke L, Carbon J.A colony bank containing synthetic E.coli. hybrid plasmids representative of the entire E.coli genome. Cell, 1976, 9:91-99.
5 Borson ND, Salo WL. A lock-docking oligo(dT) primer for 5' and 3' RACE PCR. PCR Method & Applications, 1992, 2:144-148.
(收稿：1998-09-11 修回:1998-12-15), 百拇医药
单位：杨梅英、叶常青、刘雷华：100850，北京放射医学研究所；姚树祥、张俊：个旧锡业公司劳动防护研究所
关键词：
中华放射医学与防护杂志990215 肺癌是世界上最常见的肿瘤之一，其死亡率占癌症死亡率的25%[1]。电离辐射是诱发肺癌的主要物理因素之一。由氡及其短寿命子体所释放的α粒子诱发的肺癌占辐射诱发肺癌的50%。氡及其短寿命子体所致肺癌首先在矿工中得以证实[2]。云南锡业公司矿工是国内矿工肺癌发生率高的一组病例[3]。用分子水平深入研究此组病例有助于阐明氡诱发肺癌发病的分子机理，可以推动氡致肺癌的防、诊、治措施的建立，为此我们构建了云锡矿工肺癌组织cDNA文库。
一、材料和方法
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1.肺癌组织：云锡矿工肺癌2例，经临床确诊为职业性肺癌，经外科切除的癌组织，样品在无菌条件下置液氮中速冻保存，干冰运输。
2.试剂和试剂盒：总RNA提取系统、poly(A)+RNA分离系统购自Promega公司。cDNA合成系统、cDNA克隆系统购自Clontech公司。噬菌体λTriplExTM克隆位点附近双向引物在北京生物工程公司合成。其上游引物为：5′CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTG3′，下游引物为：5′ATTATGCTGAGTGATATCCCGCTT3′。PCR试剂及DNA扩增仪为Perkin Elmer Cetus公司产品。
3.总RNA提取及mRNA的纯化：取液氮中保存的肺癌组织约1克，直接用硫氰酸胍法提取总RNA。总RNA溶于无RNase的去离子水中，65℃加热10分钟，加入生物素标记的oligo(dT)探针及可结合生物素的球形磁珠(SA-PMPS)，用磁力架收集poly(A)+mRNA-oligo(dT)-生物素-亲和素-磁珠，洗涤后，mRNA溶于无RNase去离子水中。所得mRNA用于合成cDNA。
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4.cDNA的合成：按Clontech公司试剂盒说明书进行。采用oligo(dT)(dN)15作为引物，在MMLV(H-)反转录酶作用下，以mRNA为模板合成cDNA第一链。然后在第一链反应物中加入第二链混合酶和T4DNA聚合酶合成钝性第二链。在T4DNA连接酶的作用下，将含有磷酸化EcoRI的接头与第二链连接。经Size fractionation 柱除去小于500 bp的cDNA片段，双链cDNA片段与去磷酸化的λTriplEx臂连接，体外包装，转化宿主菌XL1-Blue，在转化过程中加入IPTG和X-Gal以区分重组(白色)与非重组(蓝色)噬菌斑。铺LB平板测定重组率和滴度。
5.PCR法鉴定cDNA文库：从cDNA文库中随机挑取10个白斑和2个蓝斑扩增，提取DNA作为模板，加入50 μl PCR反应混合物中，加入0.1 μg的PCR上下游引物，PCR反应条件为：94℃30秒，58℃1.5分钟，72℃2分钟，40循环→72℃5分钟→4℃。反应结束后延伸5分钟。0.8%琼脂糖电泳鉴定PCR产物。
, http://www.100md.com
二、结果
1.总RNA制备和poly(A)+RNA分离：1克肺癌组织可得总RNA 800 μg左右，OD 260/OD 280>2.0，甲醛变性凝胶电泳显示有28 s和18 s两条清晰带，表明RNA无降解，无DNA污染。
2.cDNA的克隆：cDNA片段与去磷酸λTriplEx EcoRI臂按不同比例连接后，进行体外包装，感染XL1-Blue，测定滴度和重组率。本文库的滴度为6.3×106，重组率>95%。
3.PCR法鉴定重组子：从文库中随机挑10个白斑，2个蓝斑，PCR法扩增其插入片段。扩增产物经0.8%琼脂糖电泳显示，所有白色噬菌斑均能扩增出特异DNA片段，而蓝色噬菌斑仅见引物带(见图1)。
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图1 PCR法筛选肺癌组织cDNA文库
1为PCR Marker;2-6分别为PCR产物
三、讨论
哺乳动物细胞含有10 000～30 000种不同的mRNA。按丰度可分为低丰度、中丰度和高丰度3种，其中低丰度mRNA占总mRNA 30% 左右，每一细胞拥有的拷贝<14，要克隆低丰度mRNA，可按Clarke和Carbon公式对文库大小进行估计：N=ln(1-P)/ln(1-1/n)(P为克隆到特定cDNA的概率，n为一种稀有mRNA在总mRNA中所占的比例，N=所需克隆数)，若要求以99%概率得到一低丰度的克隆，所需的文库克隆数为1.7×105[4]。我们所建文库已达到这一标准，因此用此文库筛选目的基因是适当的。
在cDNA文库的构建中，合成全长的cDNA双链在基因的分离、鉴定和表达过程中是十分重要的。在本实验，对所采用的合成cDNA的方法做了部分改进。首先采用由Clontech公司提供的一种新的合成第一链所需的缓冲液。其次，反转录酶采用基因工程生产的MMLV反转录酶，使酶促反应的最适温度提高到42℃，此酶不含有RNAH-活性，优于AMV反转录酶。另外在合成cDNA第一链时所用寡核苷酸引物末端引入A、G、C，使引物锚定在poly A 尾的起始位置，这样消除了反转录很长的poly A 尾，增加cDNA合成的有效性[5]。
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在构建cDNA文库时，由于噬菌体的体外包装效率超过质粒对细菌的转化，具有很强的感染力，多数人都选择它们作为载体，以构建更能反应各种低丰度mRNA的高效价文库。本实验采用了一种罕见的载体λTriplEx，此载体含有三种阅读框架，在阅读框架中含有两个翻译起始位点和一个滑动位点，翻译起始位点包括核糖体结合位点和ATG起始密码。滑动位点位于第二起始位点和多克隆位点之间，在转录过程中引起RNA聚合酶跳读核苷酸致使在翻译过程中核糖体移动阅读框架，当核糖体开始翻译插入片段时，大约1/3均在三个阅读框架之中，从而增加了寻找所需克隆的可能性。
我们应用最新的cDNA合成方法，构建了云锡矿工肺癌组织的cDNA文库，为我们今后发现与致癌相关的新基因，研究其生理功能及在致癌过程中的作用奠定了一定的基础。
本课题受国家自然科学基金资助(项目号：39600043)
参考文献
, http://www.100md.com
1 Doolittle DJ, Furlong JW, Butterworth BE, et al. Assessment of chemically induced DNA repair in primary culture human epithelial cell. Toxico Appl Pharmacol, 1985, 79:28-38.
2 Hussain SP, Kennedy CH, Amstad P, et al. Radon and lung carcinogenesis:mutabi-lity of p53 codons 249 and 250 to 238Pu alpha-particles in human bronchial cell. Carcinogenesis, 1997, 18:121-125.
3 Yao Shuxiang, Lubin JH, Qiao YL, et al. Exposure to radon progeny, tobacco and lung in a case-control study in Southern China. Radiat Res, 1994, 138:326-336.
, 百拇医药
4 Clarke L, Carbon J.A colony bank containing synthetic E.coli. hybrid plasmids representative of the entire E.coli genome. Cell, 1976, 9:91-99.
5 Borson ND, Salo WL. A lock-docking oligo(dT) primer for 5' and 3' RACE PCR. PCR Method & Applications, 1992, 2:144-148.
(收稿：1998-09-11 修回:1998-12-15), 百拇医药