高-低氧全肺照射对小鼠肺纤维化的影响
作者：崔晓利 徐波 王争 沈瑜 殷蔚伯
单位：崔晓利：300060 天津，天津医科大学附属肿瘤医院放疗科；徐波、王争、沈瑜、殷蔚伯：中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院放疗科
关键词：高-低氧放疗；肺纤维化；转化生长因子TGF-β1；RT-PCR
中华放射医学与防护杂志990213 摘要 目的 以小鼠肺组织中TGF-β1含量变化为指标，观测高-低氧(HO+LO)照射对肺晚期损伤的生物学效应。方法 雄性C57BL小鼠，13 Gy全肺一次照射，照射同时分别吸入空气、高氧(95%O2+5%CO2)或高-低氧(10%O2+5%CO2+85%N2)，照射后不同时间取肺组织HE染色、Masson染色、V.G.染色观察肺纤维化形成。RT-PCR方法测定肺组织内TGF-β1的表达。结果 照射后8个月肺组织局部灶性纤维化形成。高氧组肺纤维化面积大于空气组及HO+LO组，两者相比，差异具有显著性；HO+LO组纤维化面积虽略高于空气组，但差异无显著性。照射后36小时，TGF-β1表达下降，照射后2个月，TGF-β1表达升高，至照射后8个月，略呈下降趋势，但仍高于正常对照。结论 低氧的加入降低单纯高氧导致的正常组织损伤，HO+LO照射不增加肺的晚期损伤，TGF-β1的表达在肺纤维化形成过程中起重要作用。
, 百拇医药
Effect of irradiation in high and low oxygen on mouse lung fibrosis
CUI Xiaoli,XU Bo,WANG Zheng,et al.
Tianjin Cancer Hospital,Tianjin 300060,China
Abstract Objective To study the effect of irradiation in high and low oxygen (HO+LO) on the development of mouse lung fibrosis. Methods C57BL mice were divided into three groups of irradiation:in air,HO(95%O2+5%CO2),and HO+LO(10%O2+5%CO2+85%N2). Using the lungs of C57BL mice,the histological changes were observed up to 8 months after whole thorax irradiation. Expression of TGF-β1 mRNA was evaluated by RT-PCR. Results The area of fibrosis was 2213 scale/lung (in air),2310 scale /lung(in HO+LO) and 6460 scale/lung(in HO),respectively. The expression of TGF-β1 decreased at 36 hours after whole thoracic irradiation,and increased after 2 months,then showed a modest elevation after 8 months when lung fibrosis appeared. Conclusion This study suggests in that irradiation that HO+LO can reduce the lung damage due to irradiation HO. TGF-β1 may play a role in the development of chronic fibrosis.
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Key words Irradiation in HO+LO Lung fibrosis TGF-β1 RT-PCR
如何利用氧效应，在提高肿瘤控制率的同时不增加正常组织损伤是人们长期致力于研究的问题。高-低氧(HO+LO)放疗是今年我室与首都儿童研究所提出的具有放射增敏与防护双重效应的新方法。为进一步研究其放射防护机制，为临床应用提供充分的实验依据，本实验观察了高-低氧照射对小鼠肺晚期损伤的生物学效应。
材料和方法
近交系C57BL小鼠，雄性，18～22 g体重，中国医学科学院肿瘤医院动物中心提供，8只一笼，饲料、饮水不限。实验气体：高氧气体(95%O2+5%CO2)、低氧气体(10%O2+5%CO2+85%N2)由北京氧气厂配置，流量5 L/min。分组：①小鼠照射时吸入正常空气。②小鼠先吸HO 5分钟，改吸LO的同时开始照射，在3分钟内完成。③小鼠吸HO 5分钟后开始照射，保持HO条件至照射完毕。
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小鼠清醒状态固定于本室设计的固定板上，体表置2 cm厚蜡块，全肺单次照射，吸收剂量为13 Gy。Philips SL 7510直线加速器8 MV X射线，剂量率为490 cGy/min。于照射后36小时、20天、2月、7月、8月、9月引颈活杀照射组及相同鼠龄对照组小鼠，左肺置于10%中性甲醛溶液中固定24小时，常规脱水、浸蜡、包埋、切片分别行HE染色、Masson染色、V.G.染色观察肺纤维化形成。右肺置于液氮中保存。
TGF-β1测定：组织中总RNA的提取(Trizol试剂盒)。将照射后36小时、2月、8月3个时间点的小鼠肺组织各100 mg研磨成粉末，置于匀浆器中，加1 mlTRIZOL裂解液匀浆。室温孵育5分钟，加0.2 ml氯仿，强烈震荡15秒，室温孵育2～3分钟，4℃离心12 000×g 15分钟，转水相于新管中，加异丙醇0.5 ml，室温孵育10分钟，4℃离心12 000×g 10分钟，RNA沉淀。去上清，75%乙醇冲洗×2次。真空抽干，溶于DEPC处理的水中。RNA定量及电泳鉴定提取的RNA。逆转录及PCR反应(Superscript one-step RT-PCR system试剂盒)。反应体系为反应混合液12.5 μl、模板RNA 1 μl、TGF-β1引物1 μl、β-actin引物 1 μl 、RT/Taq酶1 μl、水9 μl，共25 μl。反应程序为(Perkin-Elmer 9600 PCR仪)：45℃30分钟，94℃2分钟；1个循环，94℃15秒；57℃30秒；72℃30秒；30个循环，72℃30秒；30个循环，72℃7分钟。然后1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，紫外照相。应用Pharmacia LKB Ultroscan 扫描仪Gelscan XL(2.1)软件半定量分析扩增产物。
, 百拇医药
结果
1.小鼠全肺照射1月后，照射野内皮毛开始变白，至2月全部变白，持续至7月，开始长出黑毛。由皮毛变色的位置间接证明照射野正确。
2.镜下可见：照射后8个月出现局部灶性纤维化区域，Masson染色见绿色胶原纤维,V.G.染色见红色胶原纤维，证实肺纤维化形成。正常对照组未见异常。计算3个组肺纤维化面积(图1)可见高氧组纤维化面积明显高于空气组及HO+LO组，差异有显著性。HO+LO组纤维化面积略高于空气组，差异无显著性。
图1 C57BL小鼠全肺照射13 Gy8个月后肺纤维化面积
3.从肺组织中提取的RNA，应用RT-PCR方法分析照射后小鼠肺组织中TGF-β1 mRNA的表达，各标本均于279 bp处出现条带，亮度不一(图2)，说明照射后发生TGF-β1基因表达的改变。应用Pharmacia LKB Ultroscan扫描仪Gelscan XL(2.1)软件半定量分析扩增产物，实验资料转化见图3。可见照射后36小时TGF-β1表达低于正常对照，至照射后2个月，TGF-β1基因表达呈现升高趋势，照射后8个月，TGF-β1基因表达略呈下降，但仍高于正常对照，此时尤以空气组表达最低。
, 百拇医药
图2 小鼠全肺照射后肺组织中TGF-β1表达
RT-PCR扩增产物电泳
M:pBR322/Hinf I Marker; 1-13:RT-PCR产物
图3 C57BL小鼠全肺13 Gy照射后TGF-β1表达变化
讨论 原始的假设认为，肺纤维化的形成是由于肺实质细胞受损后由结缔组织替代的过程。随着分子生物学的进展，人们认识到单一靶细胞或靶组织受损的概念已无法解释照射后一系列的动态变化。实验表明，照射后几小时到几天大量生长因子合成、分泌并持续几个月之久，这些早期变化对晚期病理生理的改变具有深刻的影响。其中与肺纤维化关系密切的有TGF-β，PDGF，IL-1，TNF-α,IGF-1等[1]，细胞因子媒介的多细胞间的相互作用启动并维持着纤维化形成的过程。
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TGF-β1在细胞因子网络中占主导地位，它可趋化炎症细胞，成纤维细胞，促进细胞合成IL-1，TNF-1，PDGF，亦可诱导细胞产生更多TGF-β1，即自我诱导性地扩大生物学效应。同时调节细胞外基质(ECM)，一方面它能刺激ECM各种成分的合成增多，包括I、III型胶原，纤维连接素。另一方面，它可抑制蛋白水解酶的表达，抑制纤溶酶原，胶原酶原，基质酶原等酶原激活物产生，诱导蛋白水解酶抑制物的合成，从而减少ECM的降解[2]。在多种因素导致的肺纤维化中(包括BLM、CTX和放射)均发现TGF-β1含量增高[3-5]，放疗期间血浆中TGF-β1含量的变化可用于预测放射性肺损伤[6]，给予TGF-β1抗体可减轻BLM导致的肺纤维化[7]，可见TGF-β1含量的变化与肺纤维化有密切相关性。
C57BL小鼠具有纤维化易感性，文献报告吸收剂量为7～13 Gy，可引起广泛肺纤维化。本实验采用成熟的肺纤维化动物模型，在照射后一系列时间点观察肺纤维化形成过程，直至得到明确的组织学证据。此时计算纤维化面积，高氧组肺纤维化面积大于空气组及HO+LO组，差异具有显著性，HO+LO组纤维化面积略高于空气组，差异无显著性。提示低氧的加入降低单纯高氧导致的正常组织损伤，HO+LO照射不增加肺的晚期损伤。在组织学证据的基础上，应用RT-PCR方法半定量检测细胞因子TGF-β1 mRNA水平在肺纤维化形成过程中的表达。结果发现照射后一短暂时间内(36小时)TGF-β1表达低于正常对照，至照射后2个月，TGF-β1升高，均高于相同鼠龄的正常对照组。照射后 8个月，TGF-β1表达略呈下降趋势，但仍高于正常对照，尤以空气组表达最低。结合组织学改变此时空气组纤维化面积最小，提示细胞因子TGF-β1表达的高低与纤维化面积的大小呈正相关。但由于动物数少，无法作统计学处理，有待今后作进一步的研究。
, 百拇医药
本课题受卫生部基金资助
参考文献
1 Rodemann HP. Cellular basis of radiation-induced fibrosis. Radiother Oncol,1995,35:83-90.
2 宾亮华.生长因子与肺纤维化.国外医学生理病理科学与临床分册，1997，17：19-21.
3 Phan SH,Kunkel SL. Lung cytokine production in Bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Exp Lung Res,1992,18:29-43.
4 Khalil N,Bereznay M,Sporn M.Macrophage production of TGF-β1 and fibroblast collagen synthesis in chronic pulmonary in flammation. J Exp Med,1989,170:727-737.
, 百拇医药
5 Hoyt DG,Lazo JS. Early increase in pulmonary mRNA encording procollagens and TGF-β in mice sensitive to precede cyclophospamide-induced pulmonary fibrosis. J Pharmacol Exp Ther,1989,249:38-43.
6 Anscher MS,Murase T,Prescott DM. Changes in plasma TGF-β levels during pulmonary radiotherapy as a predictor of the risk of developing radiation pnumonitis. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 1994,30:671-676.
7 Giri SN,Hyde DM,Hollinger MA. Effect of antibody to TGF-β on bleomycin induced accumulation of lung collagen in mice. Thorax,1993,48:959-966.
(收稿：1998-07-14 修回:1998-10-26), 百拇医药
单位：崔晓利：300060 天津，天津医科大学附属肿瘤医院放疗科；徐波、王争、沈瑜、殷蔚伯：中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院放疗科
关键词：高-低氧放疗；肺纤维化；转化生长因子TGF-β1；RT-PCR
中华放射医学与防护杂志990213 摘要 目的 以小鼠肺组织中TGF-β1含量变化为指标，观测高-低氧(HO+LO)照射对肺晚期损伤的生物学效应。方法 雄性C57BL小鼠，13 Gy全肺一次照射，照射同时分别吸入空气、高氧(95%O2+5%CO2)或高-低氧(10%O2+5%CO2+85%N2)，照射后不同时间取肺组织HE染色、Masson染色、V.G.染色观察肺纤维化形成。RT-PCR方法测定肺组织内TGF-β1的表达。结果 照射后8个月肺组织局部灶性纤维化形成。高氧组肺纤维化面积大于空气组及HO+LO组，两者相比，差异具有显著性；HO+LO组纤维化面积虽略高于空气组，但差异无显著性。照射后36小时，TGF-β1表达下降，照射后2个月，TGF-β1表达升高，至照射后8个月，略呈下降趋势，但仍高于正常对照。结论 低氧的加入降低单纯高氧导致的正常组织损伤，HO+LO照射不增加肺的晚期损伤，TGF-β1的表达在肺纤维化形成过程中起重要作用。
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Effect of irradiation in high and low oxygen on mouse lung fibrosis
CUI Xiaoli,XU Bo,WANG Zheng,et al.
Tianjin Cancer Hospital,Tianjin 300060,China
Abstract Objective To study the effect of irradiation in high and low oxygen (HO+LO) on the development of mouse lung fibrosis. Methods C57BL mice were divided into three groups of irradiation:in air,HO(95%O2+5%CO2),and HO+LO(10%O2+5%CO2+85%N2). Using the lungs of C57BL mice,the histological changes were observed up to 8 months after whole thorax irradiation. Expression of TGF-β1 mRNA was evaluated by RT-PCR. Results The area of fibrosis was 2213 scale/lung (in air),2310 scale /lung(in HO+LO) and 6460 scale/lung(in HO),respectively. The expression of TGF-β1 decreased at 36 hours after whole thoracic irradiation,and increased after 2 months,then showed a modest elevation after 8 months when lung fibrosis appeared. Conclusion This study suggests in that irradiation that HO+LO can reduce the lung damage due to irradiation HO. TGF-β1 may play a role in the development of chronic fibrosis.
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Key words Irradiation in HO+LO Lung fibrosis TGF-β1 RT-PCR
如何利用氧效应，在提高肿瘤控制率的同时不增加正常组织损伤是人们长期致力于研究的问题。高-低氧(HO+LO)放疗是今年我室与首都儿童研究所提出的具有放射增敏与防护双重效应的新方法。为进一步研究其放射防护机制，为临床应用提供充分的实验依据，本实验观察了高-低氧照射对小鼠肺晚期损伤的生物学效应。
材料和方法
近交系C57BL小鼠，雄性，18～22 g体重，中国医学科学院肿瘤医院动物中心提供，8只一笼，饲料、饮水不限。实验气体：高氧气体(95%O2+5%CO2)、低氧气体(10%O2+5%CO2+85%N2)由北京氧气厂配置，流量5 L/min。分组：①小鼠照射时吸入正常空气。②小鼠先吸HO 5分钟，改吸LO的同时开始照射，在3分钟内完成。③小鼠吸HO 5分钟后开始照射，保持HO条件至照射完毕。
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小鼠清醒状态固定于本室设计的固定板上，体表置2 cm厚蜡块，全肺单次照射，吸收剂量为13 Gy。Philips SL 7510直线加速器8 MV X射线，剂量率为490 cGy/min。于照射后36小时、20天、2月、7月、8月、9月引颈活杀照射组及相同鼠龄对照组小鼠，左肺置于10%中性甲醛溶液中固定24小时，常规脱水、浸蜡、包埋、切片分别行HE染色、Masson染色、V.G.染色观察肺纤维化形成。右肺置于液氮中保存。
TGF-β1测定：组织中总RNA的提取(Trizol试剂盒)。将照射后36小时、2月、8月3个时间点的小鼠肺组织各100 mg研磨成粉末，置于匀浆器中，加1 mlTRIZOL裂解液匀浆。室温孵育5分钟，加0.2 ml氯仿，强烈震荡15秒，室温孵育2～3分钟，4℃离心12 000×g 15分钟，转水相于新管中，加异丙醇0.5 ml，室温孵育10分钟，4℃离心12 000×g 10分钟，RNA沉淀。去上清，75%乙醇冲洗×2次。真空抽干，溶于DEPC处理的水中。RNA定量及电泳鉴定提取的RNA。逆转录及PCR反应(Superscript one-step RT-PCR system试剂盒)。反应体系为反应混合液12.5 μl、模板RNA 1 μl、TGF-β1引物1 μl、β-actin引物 1 μl 、RT/Taq酶1 μl、水9 μl，共25 μl。反应程序为(Perkin-Elmer 9600 PCR仪)：45℃30分钟，94℃2分钟；1个循环，94℃15秒；57℃30秒；72℃30秒；30个循环，72℃30秒；30个循环，72℃7分钟。然后1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，紫外照相。应用Pharmacia LKB Ultroscan 扫描仪Gelscan XL(2.1)软件半定量分析扩增产物。
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结果
1.小鼠全肺照射1月后，照射野内皮毛开始变白，至2月全部变白，持续至7月，开始长出黑毛。由皮毛变色的位置间接证明照射野正确。
2.镜下可见：照射后8个月出现局部灶性纤维化区域，Masson染色见绿色胶原纤维,V.G.染色见红色胶原纤维，证实肺纤维化形成。正常对照组未见异常。计算3个组肺纤维化面积(图1)可见高氧组纤维化面积明显高于空气组及HO+LO组，差异有显著性。HO+LO组纤维化面积略高于空气组，差异无显著性。
图1 C57BL小鼠全肺照射13 Gy8个月后肺纤维化面积
3.从肺组织中提取的RNA，应用RT-PCR方法分析照射后小鼠肺组织中TGF-β1 mRNA的表达，各标本均于279 bp处出现条带，亮度不一(图2)，说明照射后发生TGF-β1基因表达的改变。应用Pharmacia LKB Ultroscan扫描仪Gelscan XL(2.1)软件半定量分析扩增产物，实验资料转化见图3。可见照射后36小时TGF-β1表达低于正常对照，至照射后2个月，TGF-β1基因表达呈现升高趋势，照射后8个月，TGF-β1基因表达略呈下降，但仍高于正常对照，此时尤以空气组表达最低。
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图2 小鼠全肺照射后肺组织中TGF-β1表达
RT-PCR扩增产物电泳
M:pBR322/Hinf I Marker; 1-13:RT-PCR产物
图3 C57BL小鼠全肺13 Gy照射后TGF-β1表达变化
讨论 原始的假设认为，肺纤维化的形成是由于肺实质细胞受损后由结缔组织替代的过程。随着分子生物学的进展，人们认识到单一靶细胞或靶组织受损的概念已无法解释照射后一系列的动态变化。实验表明，照射后几小时到几天大量生长因子合成、分泌并持续几个月之久，这些早期变化对晚期病理生理的改变具有深刻的影响。其中与肺纤维化关系密切的有TGF-β，PDGF，IL-1，TNF-α,IGF-1等[1]，细胞因子媒介的多细胞间的相互作用启动并维持着纤维化形成的过程。
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TGF-β1在细胞因子网络中占主导地位，它可趋化炎症细胞，成纤维细胞，促进细胞合成IL-1，TNF-1，PDGF，亦可诱导细胞产生更多TGF-β1，即自我诱导性地扩大生物学效应。同时调节细胞外基质(ECM)，一方面它能刺激ECM各种成分的合成增多，包括I、III型胶原，纤维连接素。另一方面，它可抑制蛋白水解酶的表达，抑制纤溶酶原，胶原酶原，基质酶原等酶原激活物产生，诱导蛋白水解酶抑制物的合成，从而减少ECM的降解[2]。在多种因素导致的肺纤维化中(包括BLM、CTX和放射)均发现TGF-β1含量增高[3-5]，放疗期间血浆中TGF-β1含量的变化可用于预测放射性肺损伤[6]，给予TGF-β1抗体可减轻BLM导致的肺纤维化[7]，可见TGF-β1含量的变化与肺纤维化有密切相关性。
C57BL小鼠具有纤维化易感性，文献报告吸收剂量为7～13 Gy，可引起广泛肺纤维化。本实验采用成熟的肺纤维化动物模型，在照射后一系列时间点观察肺纤维化形成过程，直至得到明确的组织学证据。此时计算纤维化面积，高氧组肺纤维化面积大于空气组及HO+LO组，差异具有显著性，HO+LO组纤维化面积略高于空气组，差异无显著性。提示低氧的加入降低单纯高氧导致的正常组织损伤，HO+LO照射不增加肺的晚期损伤。在组织学证据的基础上，应用RT-PCR方法半定量检测细胞因子TGF-β1 mRNA水平在肺纤维化形成过程中的表达。结果发现照射后一短暂时间内(36小时)TGF-β1表达低于正常对照，至照射后2个月，TGF-β1升高，均高于相同鼠龄的正常对照组。照射后 8个月，TGF-β1表达略呈下降趋势，但仍高于正常对照，尤以空气组表达最低。结合组织学改变此时空气组纤维化面积最小，提示细胞因子TGF-β1表达的高低与纤维化面积的大小呈正相关。但由于动物数少，无法作统计学处理，有待今后作进一步的研究。
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本课题受卫生部基金资助
参考文献
1 Rodemann HP. Cellular basis of radiation-induced fibrosis. Radiother Oncol,1995,35:83-90.
2 宾亮华.生长因子与肺纤维化.国外医学生理病理科学与临床分册，1997，17：19-21.
3 Phan SH,Kunkel SL. Lung cytokine production in Bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Exp Lung Res,1992,18:29-43.
4 Khalil N,Bereznay M,Sporn M.Macrophage production of TGF-β1 and fibroblast collagen synthesis in chronic pulmonary in flammation. J Exp Med,1989,170:727-737.
, 百拇医药
5 Hoyt DG,Lazo JS. Early increase in pulmonary mRNA encording procollagens and TGF-β in mice sensitive to precede cyclophospamide-induced pulmonary fibrosis. J Pharmacol Exp Ther,1989,249:38-43.
6 Anscher MS,Murase T,Prescott DM. Changes in plasma TGF-β levels during pulmonary radiotherapy as a predictor of the risk of developing radiation pnumonitis. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 1994,30:671-676.
7 Giri SN,Hyde DM,Hollinger MA. Effect of antibody to TGF-β on bleomycin induced accumulation of lung collagen in mice. Thorax,1993,48:959-966.
(收稿：1998-07-14 修回:1998-10-26), 百拇医药