牛磺酸不是.OH自由基清除剂
作者：蒋建伟 严玉霞
单位：蒋建伟 严玉霞 广州，暨南大学医学院生化教研室 510632
关键词：
中华放射医学与防护杂志990318 牛磺酸在体内可由半胱氨酸氧化脱羧而成，是条件必需氨基酸，它在人体内含量较丰富，牛 磺酸在肝胆系统、中枢神经系统、循环系统、视网膜、呼吸系统、生殖系统等均有重要生 理功能[1-5]。牛磺酸还有一些其他功能，例如牛磺酸通过氨基与有害因子相互 作 用，抵抗细胞膜离子和水的转移，维持渗透压平衡，进而对细胞膜有保护作用[2] 。牛磺酸可与局部产生的次氯酸结合成氯胺，而减弱其对组织的氧化损伤[1，5]。 牛磺酸的磺酸根可通过代谢转变为活性硫酸根，后者在对非营养物质的生物转化作用中起重 要作用。这一些都不能说明牛磺酸本身具有还原性。国内有人提出牛磺酸能消除γ射线损伤 所产生的氧化自由基，拮抗氧化自由基的危害[6]。我们认为牛磺酸的主要功能基 团是磺酸基(-SO3H)，在体内，它是巯基(-SH)经两次氧化的产物(即半胱氨酸→亚磺丙氨 酸→牛磺酸)，此时S为+6价，它不具还原性，其氨基(-NH2)也无还原性。牛磺酸是不是自 由基清除剂，我们对此作了验证。
, 百拇医药
一、材料和方法
1.实验材料:牛磺酸由湖州生物化学厂生产(生化试剂)，及FLUKA公司出品。DTNB[5，5′- 二硫双-(2-硝基苯甲酸)]FLUKA公司出品，PUC19购自华美公司。GSH上海酵母厂生 产，生化试剂。其余均为国产分析纯试剂。
实验用昆明种小白鼠，雄性，18～20g，购自本校动物中心。健康新鲜人血，购自本院第 一附属医院血库。本实验中牛磺酸(Tau)配制浓度为0.16mol/L，并调pH至7.0左右。
照射条件：采用60Co γ射线照射，样品距源中心线60cm，高120cm，剂量率 为16.8 Gy.min-1，吸收剂量为100Gy。
2.方法
, 百拇医药
(1)H2O2诱发溶血作用：人血红细胞用生理盐水(NS)作1：100稀释，分组见表1。加样混 匀后加入1mol/L H2O2 0.8ml，37℃水浴1小时，离心取上清液在540 nm测吸光度 值(A值)。
(2)小鼠肝组织谷胱甘肽(GSH)测定[7]：选雄性昆明种小鼠16只，随机分为2组，即 牛磺酸组和对照组，每组8只。每日腹腔注射牛磺酸0.5ml，连续4天，对照组注射等量生 理盐水，常规饲料喂养，于第5天杀小鼠，取肝组织用冷生理盐水制成5%匀浆。取匀浆3ml ，加入10%三氯醋酸1 ml，混匀，离心，取上清0.5 ml，加入0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH8. 2)2 ml，DTNB显色剂0.3 ml，混匀15分钟后于412 nm测A值。
标准管取1 mmol/LGSH溶液1 ml，加双蒸水2ml，10%三氯醋酸1 ml，混匀，其余步骤同 上。最终求肝组织GSH含量，单位以μmol/g湿重表示。
, 百拇医药
(3)质粒PUC19 DNA链断裂的测定：取0.667μg/μl质粒2μl，加入一定量的无 菌 牛磺酸、TE缓冲液(pH7.4)，分组见表3。100 Gy照射，置4℃4小时后，用0.8%琼脂糖电泳( 70 V，3小时)，用凝胶图像扫描系统扫描电泳结果，求出每孔超螺旋、开环构象所占的百 分比。
(4)统计学处理：各项指标用平均数和标准差(
±s)表示，t检验统计两组 间差异的显著性。
表1 牛磺酸对H2O2诱发RBC溶血的影响 组别
RBC
(ml)
Tau
, http://www.100md.com
(ml)
NS
(ml)
A值
(±s)
NS
5
-
2.0
0.533±0.046
Tau1
5
, 百拇医药
0.5
1.5
0.642±0.016**
Tau2
5
1.0
1.0
0.685±0.007**
Tau3
5
2.0
0.0
, 百拇医药
0.721±0.014**
注：与NS组比较：**P<0.01;n=4
由表1可以看出，牛磺酸加剧了H2O2致RBC的溶血作用(P<0.01)，且存在剂量 效应关系。
2.小鼠肝组织GSH的测定：见表2。
表2 牛磺酸对小鼠肝组织GSH水平的影响(±s) 组别
A值
GSH(μmol/g湿重)
Tau
, 百拇医药
0.140±0.089
1.472±0.942
NS
0.162±0.080
1.706±0.847
注:n=8
GSH/GSSG是肝细胞内一组氧化还原体系。牛磺酸组GSH水平比生理盐水组低，差异无显 著性(P>0.05)。
3.质粒PUC19DNA链断裂的测定：质粒PUC19是双链环状DNA，2686bp，呈超 螺旋构象。在制备过程中，由于机械剪切作用，DNA会发生断裂而出现开环、线型构象。本实验质粒PUC19超螺旋构象占65.20%，开环型构象占34.80%。牛磺酸(Tau)能影响受 照质粒这两种构象的百分比组成，见表3，图1。
, 百拇医药
由表3，图1可以看出，质粒PUC19经100 Gy照射后，其超螺旋构象所占的百分比 下 降，牛磺酸组加剧了质粒PUC19的DNA断裂，且随着浓度的增加，DNA断裂程度也随之 加剧，PUC19超螺旋构象所占的百分比下降，与照射对照组比，差异有显著性或有非 常显著性(P<0.05或P<0.01)。
表3 牛磺酸对受照质粒PUC19构象的影响 组别
样本数
PUC19
(μl)
Tau
(μl)
TE
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(μl)
超螺旋构象
(%)
开环型构象
(%)
正常对照
1
2
-
50
65.20
34.80
照射对照
, http://www.100md.com
2
2
-
50
50.98±0.56
49.02±0 .56
Tau1
4
2
20
30
45.30±2.32*
, 百拇医药 54.70±2.32*
Tau2
4
2
30
20
41.35±0.57**
58.65±0.57 **
Tau3
4
2
40
, http://www.100md.com
10
37.69±1.47**
62.31±1.47 **
注：与照射对照组相比：*P<0.05；**P<0.01
图1 质粒PUC19DNA断裂的测定(示PUC19的两种构象超螺旋及开环;PU C192686bp)
三、讨论
H2O2可导致RBC的溶血作用，文献指出H2O2的毒性可通过.OH表达，.OH是已 知的 最强氧化剂[8]。牛磺酸组溶血程度明显升高，差异均有显著性(P<0.01 )，另 外，实验还证明，用300 Gy60Coγ射线或30 W UV灯(样品距灯10 cm)照射25 分钟，检 测1%新鲜人RBC悬液的溶血度，发现牛磺酸组之溶血度明显高于对照组(P<0.05)。辐 射导致RBC溶血，主要是.OH的作用。说明牛磺酸不能抑制.OH对RBC的溶血作用。
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DTNB显色反应可以用来测定组织或RBC中的GSH水平。事实上含巯基(-SH)的化合物如蛋白 质 、半胱氨酸、GSH等都能与DTNB反应产生黄色的2-硝基-5-巯基苯甲酸。但是，将蛋白质 用三氯醋酸沉淀，所测得的上清中巯基为非蛋白巯基。组织中含非蛋白巯量的主要物质为GS H，其他如半胱氨酸等亦含有非蛋白巯基，但含量极小。肝脏中GSH以分子计为半胱氨酸的50 多倍，所以，用DTNB显色测定的组织非蛋白巯基量被认为反应了组织GSH水平[7]。 本实验所测定的肝脏GSH含量与前文[7]相一致。牛磺酸组使肝组织GSH水平不但没 有增加，反而略有下降(P>0.05)，说明牛磺酸不能保护小鼠肝脏GSH免受自由基的破 坏，牛磺酸没有清除自由基的作用。
质粒是双链环状DNA，它具有超螺旋，开环、线型3种构象。近年来作为理想材料用于辐射 所 致DNA损伤及修复的研究。高剂量γ辐射对质粒PUC19的损伤主要表现为双链断裂，产 生较多的线型构象，而低剂量照射则出现单链断裂，产生开环型构象。表3及图1揭示100 Gy 照射后，发现开环型DNA增多，即表现为DNA单链断裂，而加入牛磺酸加剧了辐射导致的质 粒DNA单链断裂作用(P<0.05或P<0.01)。
, http://www.100md.com
质粒DNA辐射损伤效应，不像动物整体实验或离体细胞培养或RBC试验，没有细胞中各种有机 大分子，代谢中间产物及相关酶系的影响，更直接地反映了辐射反应体系中自由基对DNA的 损伤情况。DNA的辐射损伤主要是水的辐射产物*OH作用所致[9，10]，此实验说明 牛磺酸不是*OH自由基清除剂，相反，它加剧了*OH自由基对DNA的损伤。
参考文献
1 刘武.牛磺酸的生物学作用.生命的化学，1990，10(3)：12-14.
2 韩晓滨.人体条件性必需营养素--牛磺酸.国外医学卫生学分册,1987，3：129 -132.
3 陈玉珍.牛磺酸的生理功能及其应用.解放军预防医学杂志，1994，12：329-33 2.
4 Gerald EG.Taurine as a conditionally essential nutrient in man.J Am Col l Nutr,1986,5:121-125.
, http://www.100md.com
5 Huxtable RJ.Physiological actions of taurine.Physiol Rev,1992,72:101-1 44.
6 窦学术，杨军，唐朝枢.牛磺酸对小鼠电离辐射损伤的防护探讨.中国辐射卫生 ，1995，4：58-59.
7 张平，孟宪钧.分光光度法测定大鼠不同组织还原型谷胱甘肽含量.中华实验外 科杂志，1989，6：141-142.
8 李培峰，李文彬.自由基与抗衰老研究.见：方允中等主编.自由基生命科学进 展.第2集.北京：原子能出版社，1994.7-11.
9 周丽君，魏康，周平坤，等.茶多酚对电离辐射所致质粒pBR322DNA链断裂 的防护 效应.见：方允中等主编.自由基生命科学进展.第4集.北京：原子能出版社，1996.66 -68.
10 周丽君，方允中，章扬培，等.质粒pBR322的的γ辐射损伤效应.辐射研究与辐射工艺 学报，1993，11：28-30.
(收稿:1998-07-31 修回1998-10-16), 百拇医药
单位：蒋建伟 严玉霞 广州，暨南大学医学院生化教研室 510632
关键词：
中华放射医学与防护杂志990318 牛磺酸在体内可由半胱氨酸氧化脱羧而成，是条件必需氨基酸，它在人体内含量较丰富，牛 磺酸在肝胆系统、中枢神经系统、循环系统、视网膜、呼吸系统、生殖系统等均有重要生 理功能[1-5]。牛磺酸还有一些其他功能，例如牛磺酸通过氨基与有害因子相互 作 用，抵抗细胞膜离子和水的转移，维持渗透压平衡，进而对细胞膜有保护作用[2] 。牛磺酸可与局部产生的次氯酸结合成氯胺，而减弱其对组织的氧化损伤[1，5]。 牛磺酸的磺酸根可通过代谢转变为活性硫酸根，后者在对非营养物质的生物转化作用中起重 要作用。这一些都不能说明牛磺酸本身具有还原性。国内有人提出牛磺酸能消除γ射线损伤 所产生的氧化自由基，拮抗氧化自由基的危害[6]。我们认为牛磺酸的主要功能基 团是磺酸基(-SO3H)，在体内，它是巯基(-SH)经两次氧化的产物(即半胱氨酸→亚磺丙氨 酸→牛磺酸)，此时S为+6价，它不具还原性，其氨基(-NH2)也无还原性。牛磺酸是不是自 由基清除剂，我们对此作了验证。
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一、材料和方法
1.实验材料:牛磺酸由湖州生物化学厂生产(生化试剂)，及FLUKA公司出品。DTNB[5，5′- 二硫双-(2-硝基苯甲酸)]FLUKA公司出品，PUC19购自华美公司。GSH上海酵母厂生 产，生化试剂。其余均为国产分析纯试剂。
实验用昆明种小白鼠，雄性，18～20g，购自本校动物中心。健康新鲜人血，购自本院第 一附属医院血库。本实验中牛磺酸(Tau)配制浓度为0.16mol/L，并调pH至7.0左右。
照射条件：采用60Co γ射线照射，样品距源中心线60cm，高120cm，剂量率 为16.8 Gy.min-1，吸收剂量为100Gy。
2.方法
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(1)H2O2诱发溶血作用：人血红细胞用生理盐水(NS)作1：100稀释，分组见表1。加样混 匀后加入1mol/L H2O2 0.8ml，37℃水浴1小时，离心取上清液在540 nm测吸光度 值(A值)。
(2)小鼠肝组织谷胱甘肽(GSH)测定[7]：选雄性昆明种小鼠16只，随机分为2组，即 牛磺酸组和对照组，每组8只。每日腹腔注射牛磺酸0.5ml，连续4天，对照组注射等量生 理盐水，常规饲料喂养，于第5天杀小鼠，取肝组织用冷生理盐水制成5%匀浆。取匀浆3ml ，加入10%三氯醋酸1 ml，混匀，离心，取上清0.5 ml，加入0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH8. 2)2 ml，DTNB显色剂0.3 ml，混匀15分钟后于412 nm测A值。
标准管取1 mmol/LGSH溶液1 ml，加双蒸水2ml，10%三氯醋酸1 ml，混匀，其余步骤同 上。最终求肝组织GSH含量，单位以μmol/g湿重表示。
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(3)质粒PUC19 DNA链断裂的测定：取0.667μg/μl质粒2μl，加入一定量的无 菌 牛磺酸、TE缓冲液(pH7.4)，分组见表3。100 Gy照射，置4℃4小时后，用0.8%琼脂糖电泳( 70 V，3小时)，用凝胶图像扫描系统扫描电泳结果，求出每孔超螺旋、开环构象所占的百 分比。
(4)统计学处理：各项指标用平均数和标准差(
±s)表示，t检验统计两组 间差异的显著性。表1 牛磺酸对H2O2诱发RBC溶血的影响 组别
RBC
(ml)
Tau
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(ml)
NS
(ml)
A值
(
±s)NS
5
-
2.0
0.533±0.046
Tau1
5
, 百拇医药
0.5
1.5
0.642±0.016**
Tau2
5
1.0
1.0
0.685±0.007**
Tau3
5
2.0
0.0
, 百拇医药
0.721±0.014**
注：与NS组比较：**P<0.01;n=4
由表1可以看出，牛磺酸加剧了H2O2致RBC的溶血作用(P<0.01)，且存在剂量 效应关系。
2.小鼠肝组织GSH的测定：见表2。
表2 牛磺酸对小鼠肝组织GSH水平的影响(
±s) 组别A值
GSH(μmol/g湿重)
Tau
, 百拇医药
0.140±0.089
1.472±0.942
NS
0.162±0.080
1.706±0.847
注:n=8
GSH/GSSG是肝细胞内一组氧化还原体系。牛磺酸组GSH水平比生理盐水组低，差异无显 著性(P>0.05)。
3.质粒PUC19DNA链断裂的测定：质粒PUC19是双链环状DNA，2686bp，呈超 螺旋构象。在制备过程中，由于机械剪切作用，DNA会发生断裂而出现开环、线型构象。本实验质粒PUC19超螺旋构象占65.20%，开环型构象占34.80%。牛磺酸(Tau)能影响受 照质粒这两种构象的百分比组成，见表3，图1。
, 百拇医药
由表3，图1可以看出，质粒PUC19经100 Gy照射后，其超螺旋构象所占的百分比 下 降，牛磺酸组加剧了质粒PUC19的DNA断裂，且随着浓度的增加，DNA断裂程度也随之 加剧，PUC19超螺旋构象所占的百分比下降，与照射对照组比，差异有显著性或有非 常显著性(P<0.05或P<0.01)。
表3 牛磺酸对受照质粒PUC19构象的影响 组别
样本数
PUC19
(μl)
Tau
(μl)
TE
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(μl)
超螺旋构象
(%)
开环型构象
(%)
正常对照
1
2
-
50
65.20
34.80
照射对照
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2
2
-
50
50.98±0.56
49.02±0 .56
Tau1
4
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20
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45.30±2.32*
, 百拇医药 54.70±2.32*
Tau2
4
2
30
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41.35±0.57**
58.65±0.57 **
Tau3
4
2
40
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10
37.69±1.47**
62.31±1.47 **
注：与照射对照组相比：*P<0.05；**P<0.01
图1 质粒PUC19DNA断裂的测定(示PUC19的两种构象超螺旋及开环;PU C192686bp)
三、讨论
H2O2可导致RBC的溶血作用，文献指出H2O2的毒性可通过.OH表达，.OH是已 知的 最强氧化剂[8]。牛磺酸组溶血程度明显升高，差异均有显著性(P<0.01 )，另 外，实验还证明，用300 Gy60Coγ射线或30 W UV灯(样品距灯10 cm)照射25 分钟，检 测1%新鲜人RBC悬液的溶血度，发现牛磺酸组之溶血度明显高于对照组(P<0.05)。辐 射导致RBC溶血，主要是.OH的作用。说明牛磺酸不能抑制.OH对RBC的溶血作用。
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DTNB显色反应可以用来测定组织或RBC中的GSH水平。事实上含巯基(-SH)的化合物如蛋白 质 、半胱氨酸、GSH等都能与DTNB反应产生黄色的2-硝基-5-巯基苯甲酸。但是，将蛋白质 用三氯醋酸沉淀，所测得的上清中巯基为非蛋白巯基。组织中含非蛋白巯量的主要物质为GS H，其他如半胱氨酸等亦含有非蛋白巯基，但含量极小。肝脏中GSH以分子计为半胱氨酸的50 多倍，所以，用DTNB显色测定的组织非蛋白巯基量被认为反应了组织GSH水平[7]。 本实验所测定的肝脏GSH含量与前文[7]相一致。牛磺酸组使肝组织GSH水平不但没 有增加，反而略有下降(P>0.05)，说明牛磺酸不能保护小鼠肝脏GSH免受自由基的破 坏，牛磺酸没有清除自由基的作用。
质粒是双链环状DNA，它具有超螺旋，开环、线型3种构象。近年来作为理想材料用于辐射 所 致DNA损伤及修复的研究。高剂量γ辐射对质粒PUC19的损伤主要表现为双链断裂，产 生较多的线型构象，而低剂量照射则出现单链断裂，产生开环型构象。表3及图1揭示100 Gy 照射后，发现开环型DNA增多，即表现为DNA单链断裂，而加入牛磺酸加剧了辐射导致的质 粒DNA单链断裂作用(P<0.05或P<0.01)。
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质粒DNA辐射损伤效应，不像动物整体实验或离体细胞培养或RBC试验，没有细胞中各种有机 大分子，代谢中间产物及相关酶系的影响，更直接地反映了辐射反应体系中自由基对DNA的 损伤情况。DNA的辐射损伤主要是水的辐射产物*OH作用所致[9，10]，此实验说明 牛磺酸不是*OH自由基清除剂，相反，它加剧了*OH自由基对DNA的损伤。
参考文献
1 刘武.牛磺酸的生物学作用.生命的化学，1990，10(3)：12-14.
2 韩晓滨.人体条件性必需营养素--牛磺酸.国外医学卫生学分册,1987，3：129 -132.
3 陈玉珍.牛磺酸的生理功能及其应用.解放军预防医学杂志，1994，12：329-33 2.
4 Gerald EG.Taurine as a conditionally essential nutrient in man.J Am Col l Nutr,1986,5:121-125.
, http://www.100md.com
5 Huxtable RJ.Physiological actions of taurine.Physiol Rev,1992,72:101-1 44.
6 窦学术，杨军，唐朝枢.牛磺酸对小鼠电离辐射损伤的防护探讨.中国辐射卫生 ，1995，4：58-59.
7 张平，孟宪钧.分光光度法测定大鼠不同组织还原型谷胱甘肽含量.中华实验外 科杂志，1989，6：141-142.
8 李培峰，李文彬.自由基与抗衰老研究.见：方允中等主编.自由基生命科学进 展.第2集.北京：原子能出版社，1994.7-11.
9 周丽君，魏康，周平坤，等.茶多酚对电离辐射所致质粒pBR322DNA链断裂 的防护 效应.见：方允中等主编.自由基生命科学进展.第4集.北京：原子能出版社，1996.66 -68.
10 周丽君，方允中，章扬培，等.质粒pBR322的的γ辐射损伤效应.辐射研究与辐射工艺 学报，1993，11：28-30.
(收稿:1998-07-31 修回1998-10-16), 百拇医药