低剂量辐射减轻化疗对巨噬细胞功能抑制作用的实验研究
作者：张英 孙义敏 李修义 刘树铮
单位：130021 长春，白求恩医科大学卫生部放射生物学重点实验室
关键词：
中华放射医学与防护杂志/990419 有的研究证实，低剂量辐射(LDR)可明显增强荷瘤小鼠的免疫功能并提高化疗的抑瘤作用[1，2]，但在此过程中巨噬细胞(Mφ)功能的变化还不清楚。本实验以荷有Lewis肺癌的C57BL/6J小鼠作为实验动物模型，探讨LDR与化疗联合应用对荷瘤小鼠Mφ功能的影响。
一、材料和方法
1.实验动物：C57BL/6J纯系小鼠，雌雄各半，体重(20±2)g，购自白求恩医科大学实验动物部，隔离检疫一周后随机分组，每组6只。
, http://www.100md.com 2.照射条件：采用本室已报道的方法[3]，X射线全身照射，吸收剂量率 12.5 mGy/min，照射时间6分钟，总吸收剂量 75 mGy。
3.肿瘤动物模型的制备及实验动物分组：采用本室常规方法制备肿瘤动物模型[1]，肿瘤移植后10日，将荷瘤动物随机分为3组；①对照组；②单纯化疗组，即 3.0 mg/kg丝裂霉素C(MMC)腹腔注射；③联合治疗组，在 3.0 mg/kg MMC腹腔注射前6小时预先给予 75 mGy X射线全身照射。所有动物均在化疗后12小时处死测定M功能。
4.腹腔Mφ吞噬力的测定：采用酵母吞噬法[4]。取市售活性干酵母，经乙醚酒精浸泡脱脂，在 37 ℃，5% CO2 条件下与腹腔M混合培养15分钟，滴入 1 ml 0.04%藻红B染色2分钟后，计数 100 个M，计算吞噬率和吞噬指数。吞噬率=(吞噬酵母菌的M数/观察的Mφ数)×100%；吞噬指数=吞噬酵母菌总数/观察的M数。
, 百拇医药
5.腹腔Mφ的肿瘤静止效应的测定：将Lewis肺癌细胞 2×105/ml 与小鼠腹腔Mφ 1.2×106/ml 各 100 μl(效/靶比为6∶1)加入96孔培养板各孔，置 37 ℃，5% CO2 孵育48小时，在终止培养前4小时每孔加入3H-TdR 18.5 kBq/30 μl，多头细胞收集器收集各孔细胞，液闪计数仪测定3H-TdR掺入量，结果以计数/分钟表示，肿瘤静止效应=(单纯肿瘤细胞组-实验组)/单纯肿瘤细胞组×100%
6.腹腔Mφ内TNFα和IL-1 β mRNA转录水平的测定：采用原位杂交免疫组织化学方法。将Mφ贴片用4%多聚甲醛(pH 7.2)固定20分钟，然后用 0.05 mol/L PBS(pH 7.2)漂洗10分钟，再滴加蛋白酶K(25 mg/ml,Sigma)，在37 ℃条件下处理10分钟，然后用4%多聚甲醛(pH 7.2)固定5分钟，再用 0.05 mol/L PBS(pH 7.2)漂洗10分钟，滴加杂交液，覆盖蜡膜，温盒中43℃孵育24小时，杂交液组成：5×SSC，10% 硫酸葡聚糖，5×Denhart’s液，10% SDS，1%变性鱼精DNA，TNFα或IL-1β cDNA探针4 ng/μl(加拿大西安大略大学J Keropatnick教授惠赠，由本室用购自德国Bioehringer Mannheim公司的Dig-DNA Kit标记地高辛)。然后用5×SSC漂洗10分钟，再滴加碱性磷酸酶标记的地高辛抗体(1：1000稀释，稀释液组成：1% BSA，0.4% Triton X-100和0.05 mol/L PBS)，每片40 μl，置室温4小时后，用0.05 mol/L PBS漂洗15分钟，然后用TSM1和TSM2分别处理10分钟，再滴加NBT和BCIP显色液30 μl/片，室温过夜，0.05 mol/L PBS冲洗后室温干燥，甘油明胶封片，镜检。结果采用CMIA-007型多功能真彩色病理图像分析系统(北京洁翔医用电子设备厂)定量分析，每片在上、下、左、右、中，各取5个视野，测定M内阳性颗粒的数量和染色强度，结果以吸光度A值表示。
, 百拇医药
7.统计分析：文中显著性检验采用t检验。
二、结果
1.LDR与化疗联合应用对腹腔Mφ吞噬力和肿瘤静止效应的影响：表1内数据显示，MMC腹腔注射使Mφ吞噬力和肿瘤静止效应较荷瘤组显著下降(P<0.01)；在化疗前6小时预先给予 75 mGy X射线全身照射，同单纯化疗组相比，联合治疗组的Mφ吞噬力和肿瘤静止效应显著提高(P<0.01～0.05)。
表1 低剂量辐射与化疗联合应用对荷瘤小鼠腹腔Mφ功能的影响 (
±s)
组别
吞噬力
mRNA转录水平(A值)
, 百拇医药
肿瘤静止效应(%)
吞噬率(%)
吞噬指数
TNFα
IL-1β
正常对照组
65.61±5.14
4.07±0.23
0.059±0.025
0.057±0.004…
荷瘤组
44.02±4.721**
, 百拇医药
2.90±0.241**
0.204±0.0051**
0.216±0.0151**
52.9±8.1
单纯化疗组
20.53±3.812**
1.15±0.162**
0.061±0.0152**
0.056±0.0072**
29.1±9.82*
联合治疗组
, 百拇医药
27.81±3.313**
1.85±0.143**
0.082±0.0133**
0.093±0.0113**
57.6±12.13**
注：n=6;1与正常对照组比较；2与荷瘤组比较；3与单纯化疗组比较；*P<0.05,**P<0.01
2.LDR与化疗联合应用对腹腔Mφ内TNFα和IL-1β mRNA转录水平的影响：联合治疗组的M胞浆内充满转录活性增高的斑点状、线条状的蓝紫色阳性颗粒，以胞膜下最为明显；单纯化疗组仅可见稀疏的阳性颗粒。定量分析结果见表1，可见荷瘤组Mφ内有一定量的TNFα和IL-1β mRNA转录，高于正常对照组(P<0.01)，提示肿瘤移植使机体Mφ内TNFα和IL-1β的合成有代偿性增多；MMC化疗使二者的mRNA转录水平明显降低(P<0.01)，提示化疗对二者合成的抑制作用；联合治疗组M内二者的转录水平较单纯化疗组显著提高(P<0.01)，提示LDR可减轻大剂量化疗对机体M内TNFα和IL-1β合成的抑制作用。
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三、讨论
Mφ是体内最大的吞噬细胞，在机体抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用，除了可直接吞噬肿瘤细胞，提高肿瘤抗原激活特异性CTL，在特异性抗体介导下发挥ADCC作用外，还可分泌TNFα和IL-1β 等具有直接抑瘤和免疫调节作用的细胞因子[5]。IL-1β是细胞因子网络中的关键因子，对体内多种肿瘤细胞的生长均具有抑制作用，除可能具有直接作用外，还可促进抗体产生，增强NK、CTL、Mφ的杀伤活性，发挥免疫调节作用间接杀伤肿瘤细胞[6]。TNFα是Mφ分泌的另一种具有直接抑瘤和免疫调节作用的细胞因子，其主要生物学活性就是对肿瘤的细胞溶解(cytolysis)和细胞静止效应(cytostasis)，除此之外，TNFα还与多种免疫效应细胞的活性有关，包括促进NK、CTL、Mφ、LAK的细胞毒效应[7，8]。
本文结果表明，荷瘤小鼠接受MMC化疗后，Mφ的吞噬力，肿瘤静止效应，TNFα和IL-1β的mRNA转录水平明显下降，而化疗前6小时预先给予LDR全身照射使Mφ的功能明显高于单纯化疗组。由于Mφ的功能状态可影响其他免疫细胞的肿瘤杀伤作用，故其功能的抑制必然伴有机体整体免疫功能的削弱，而其功能的增强有利于机体其他免疫活性细胞功能的全面提高。因此，LDR减轻化疗对Mφ功能的抑制作用在其增强化疗疗效的过程中有重要意义。
, http://www.100md.com
参考文献
1 张英，李修义，刘树铮.低剂量X射线照射对化疗药物抑瘤作用的影响.中华放射医学与防护杂志，1997，17：112-114.
2 张英，刘树铮.低剂量电离辐射对荷瘤小鼠某些免疫功能的影响.中国辐射卫生，1996，5：236-237.
3 刘树铮，刘伟宏，齐进，等.低剂量辐射增强免疫的细胞机制.中华放射医学与防护杂志，1992，12：299-305.
4 王为民，孙义敏，施中华，等.石棉尘对大鼠肺泡巨噬细胞体外毒性的研究.沈阳部队医药卫生，1995，8：227-232.
5 Higuchi M,Higashi N,Taki H,et al.Cytolytic mechanisms of activated macrophages'.J Immunol,1990,144:1425-1431.
, 百拇医药
6 李一，杨贵贞.免疫生物工程纲要与技术.杨贵贞主编，长春：吉林科学技术出版社，1991.10-13.
7 Sugarman BJ.Tumor necrosis factor and its antitumor effect.Science,1985,230:943-944.
8 Futamura Y,Matsumoto K.Characteristics of peripheral blood monocytes and bone marrow macrophages from rats treated with mytomycin C,5-FU or phenylhydrazine.J Toxicol Sci,1995,20:1-8.
(收稿:1998-12-03 修回:1999-02-05), http://www.100md.com
单位：130021 长春，白求恩医科大学卫生部放射生物学重点实验室
关键词：
中华放射医学与防护杂志/990419 有的研究证实，低剂量辐射(LDR)可明显增强荷瘤小鼠的免疫功能并提高化疗的抑瘤作用[1，2]，但在此过程中巨噬细胞(Mφ)功能的变化还不清楚。本实验以荷有Lewis肺癌的C57BL/6J小鼠作为实验动物模型，探讨LDR与化疗联合应用对荷瘤小鼠Mφ功能的影响。
一、材料和方法
1.实验动物：C57BL/6J纯系小鼠，雌雄各半，体重(20±2)g，购自白求恩医科大学实验动物部，隔离检疫一周后随机分组，每组6只。
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3.肿瘤动物模型的制备及实验动物分组：采用本室常规方法制备肿瘤动物模型[1]，肿瘤移植后10日，将荷瘤动物随机分为3组；①对照组；②单纯化疗组，即 3.0 mg/kg丝裂霉素C(MMC)腹腔注射；③联合治疗组，在 3.0 mg/kg MMC腹腔注射前6小时预先给予 75 mGy X射线全身照射。所有动物均在化疗后12小时处死测定M功能。
4.腹腔Mφ吞噬力的测定：采用酵母吞噬法[4]。取市售活性干酵母，经乙醚酒精浸泡脱脂，在 37 ℃，5% CO2 条件下与腹腔M混合培养15分钟，滴入 1 ml 0.04%藻红B染色2分钟后，计数 100 个M，计算吞噬率和吞噬指数。吞噬率=(吞噬酵母菌的M数/观察的Mφ数)×100%；吞噬指数=吞噬酵母菌总数/观察的M数。
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5.腹腔Mφ的肿瘤静止效应的测定：将Lewis肺癌细胞 2×105/ml 与小鼠腹腔Mφ 1.2×106/ml 各 100 μl(效/靶比为6∶1)加入96孔培养板各孔，置 37 ℃，5% CO2 孵育48小时，在终止培养前4小时每孔加入3H-TdR 18.5 kBq/30 μl，多头细胞收集器收集各孔细胞，液闪计数仪测定3H-TdR掺入量，结果以计数/分钟表示，肿瘤静止效应=(单纯肿瘤细胞组-实验组)/单纯肿瘤细胞组×100%
6.腹腔Mφ内TNFα和IL-1 β mRNA转录水平的测定：采用原位杂交免疫组织化学方法。将Mφ贴片用4%多聚甲醛(pH 7.2)固定20分钟，然后用 0.05 mol/L PBS(pH 7.2)漂洗10分钟，再滴加蛋白酶K(25 mg/ml,Sigma)，在37 ℃条件下处理10分钟，然后用4%多聚甲醛(pH 7.2)固定5分钟，再用 0.05 mol/L PBS(pH 7.2)漂洗10分钟，滴加杂交液，覆盖蜡膜，温盒中43℃孵育24小时，杂交液组成：5×SSC，10% 硫酸葡聚糖，5×Denhart’s液，10% SDS，1%变性鱼精DNA，TNFα或IL-1β cDNA探针4 ng/μl(加拿大西安大略大学J Keropatnick教授惠赠，由本室用购自德国Bioehringer Mannheim公司的Dig-DNA Kit标记地高辛)。然后用5×SSC漂洗10分钟，再滴加碱性磷酸酶标记的地高辛抗体(1：1000稀释，稀释液组成：1% BSA，0.4% Triton X-100和0.05 mol/L PBS)，每片40 μl，置室温4小时后，用0.05 mol/L PBS漂洗15分钟，然后用TSM1和TSM2分别处理10分钟，再滴加NBT和BCIP显色液30 μl/片，室温过夜，0.05 mol/L PBS冲洗后室温干燥，甘油明胶封片，镜检。结果采用CMIA-007型多功能真彩色病理图像分析系统(北京洁翔医用电子设备厂)定量分析，每片在上、下、左、右、中，各取5个视野，测定M内阳性颗粒的数量和染色强度，结果以吸光度A值表示。
, 百拇医药
7.统计分析：文中显著性检验采用t检验。
二、结果
1.LDR与化疗联合应用对腹腔Mφ吞噬力和肿瘤静止效应的影响：表1内数据显示，MMC腹腔注射使Mφ吞噬力和肿瘤静止效应较荷瘤组显著下降(P<0.01)；在化疗前6小时预先给予 75 mGy X射线全身照射，同单纯化疗组相比，联合治疗组的Mφ吞噬力和肿瘤静止效应显著提高(P<0.01～0.05)。
表1 低剂量辐射与化疗联合应用对荷瘤小鼠腹腔Mφ功能的影响 (
±s)组别
吞噬力
mRNA转录水平(A值)
, 百拇医药
肿瘤静止效应(%)
吞噬率(%)
吞噬指数
TNFα
IL-1β
正常对照组
65.61±5.14
4.07±0.23
0.059±0.025
0.057±0.004…
荷瘤组
44.02±4.721**
, 百拇医药
2.90±0.241**
0.204±0.0051**
0.216±0.0151**
52.9±8.1
单纯化疗组
20.53±3.812**
1.15±0.162**
0.061±0.0152**
0.056±0.0072**
29.1±9.82*
联合治疗组
, 百拇医药
27.81±3.313**
1.85±0.143**
0.082±0.0133**
0.093±0.0113**
57.6±12.13**
注：n=6;1与正常对照组比较；2与荷瘤组比较；3与单纯化疗组比较；*P<0.05,**P<0.01
2.LDR与化疗联合应用对腹腔Mφ内TNFα和IL-1β mRNA转录水平的影响：联合治疗组的M胞浆内充满转录活性增高的斑点状、线条状的蓝紫色阳性颗粒，以胞膜下最为明显；单纯化疗组仅可见稀疏的阳性颗粒。定量分析结果见表1，可见荷瘤组Mφ内有一定量的TNFα和IL-1β mRNA转录，高于正常对照组(P<0.01)，提示肿瘤移植使机体Mφ内TNFα和IL-1β的合成有代偿性增多；MMC化疗使二者的mRNA转录水平明显降低(P<0.01)，提示化疗对二者合成的抑制作用；联合治疗组M内二者的转录水平较单纯化疗组显著提高(P<0.01)，提示LDR可减轻大剂量化疗对机体M内TNFα和IL-1β合成的抑制作用。
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三、讨论
Mφ是体内最大的吞噬细胞，在机体抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用，除了可直接吞噬肿瘤细胞，提高肿瘤抗原激活特异性CTL，在特异性抗体介导下发挥ADCC作用外，还可分泌TNFα和IL-1β 等具有直接抑瘤和免疫调节作用的细胞因子[5]。IL-1β是细胞因子网络中的关键因子，对体内多种肿瘤细胞的生长均具有抑制作用，除可能具有直接作用外，还可促进抗体产生，增强NK、CTL、Mφ的杀伤活性，发挥免疫调节作用间接杀伤肿瘤细胞[6]。TNFα是Mφ分泌的另一种具有直接抑瘤和免疫调节作用的细胞因子，其主要生物学活性就是对肿瘤的细胞溶解(cytolysis)和细胞静止效应(cytostasis)，除此之外，TNFα还与多种免疫效应细胞的活性有关，包括促进NK、CTL、Mφ、LAK的细胞毒效应[7，8]。
本文结果表明，荷瘤小鼠接受MMC化疗后，Mφ的吞噬力，肿瘤静止效应，TNFα和IL-1β的mRNA转录水平明显下降，而化疗前6小时预先给予LDR全身照射使Mφ的功能明显高于单纯化疗组。由于Mφ的功能状态可影响其他免疫细胞的肿瘤杀伤作用，故其功能的抑制必然伴有机体整体免疫功能的削弱，而其功能的增强有利于机体其他免疫活性细胞功能的全面提高。因此，LDR减轻化疗对Mφ功能的抑制作用在其增强化疗疗效的过程中有重要意义。
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参考文献
1 张英，李修义，刘树铮.低剂量X射线照射对化疗药物抑瘤作用的影响.中华放射医学与防护杂志，1997，17：112-114.
2 张英，刘树铮.低剂量电离辐射对荷瘤小鼠某些免疫功能的影响.中国辐射卫生，1996，5：236-237.
3 刘树铮，刘伟宏，齐进，等.低剂量辐射增强免疫的细胞机制.中华放射医学与防护杂志，1992，12：299-305.
4 王为民，孙义敏，施中华，等.石棉尘对大鼠肺泡巨噬细胞体外毒性的研究.沈阳部队医药卫生，1995，8：227-232.
5 Higuchi M,Higashi N,Taki H,et al.Cytolytic mechanisms of activated macrophages'.J Immunol,1990,144:1425-1431.
, 百拇医药
6 李一，杨贵贞.免疫生物工程纲要与技术.杨贵贞主编，长春：吉林科学技术出版社，1991.10-13.
7 Sugarman BJ.Tumor necrosis factor and its antitumor effect.Science,1985,230:943-944.
8 Futamura Y,Matsumoto K.Characteristics of peripheral blood monocytes and bone marrow macrophages from rats treated with mytomycin C,5-FU or phenylhydrazine.J Toxicol Sci,1995,20:1-8.
(收稿:1998-12-03 修回:1999-02-05), http://www.100md.com