γ射线照射及博来霉素所致肺纤维化的病理学研究
作者：白蕴红 王德文 崔雪梅 宋良文 夏国伟 张振声
单位：100850 北京放射医学研究所
关键词：
中华放射医学与防护杂志/990418
肺纤维化是临床上一个棘手的疾病。无论急性核辐射事故、放疗、化疗及某些病毒感染等最终都可造成肺纤维化。尽管许多学者对单纯照射或单纯博来霉素所致肺纤维化进行了大量研究[1，2]，但对两者同时应用所致肺纤维化的研究并不多见。因此，作者在对两者单独使用及同时应用所致肺纤维化观察比较的基础上，又应用图像分析仪进行了定量研究，为探索一个与实际临床相近的肺纤维化模型提供实验依据。
一、材料和方法
1.实验动物及分组：健康雄性Wistar大鼠70只，随机分为正常对照组(C)15只；照射组(I)15只；博来霉素组(B)20只；照射+博来霉素组(I+B)20只。
, 百拇医药
2.照射方式和条件：60Co γ射线全胸照射，照射野面积分别为 4.5 cm×4.0 cm，自行设计装置(10 cm铅砖)屏蔽大鼠其余部分。I组吸收剂量为 30 Gy(单次)；I+B组吸收剂量为 15 Gy(单次)，灌入博来霉素24小时后照射，吸收剂量率为 3.40 Gy/min。
3.给药方式：给予博来霉素的大鼠经戊巴比妥钠麻醉后仰卧于固定台上，暴露喉部，在额镜直视下，趁大鼠吸气瞬间将与 1 ml注射器相连的钝头针插入气管内，灌入博来霉素后立即竖起大鼠摇动，使其分布均匀，博来霉素灌入量为(体重g/100 g)×0.2 ml。
4.取材及光镜观察：各组经相应处理后7、14、21、28及56天活杀开胸取肺脏，每个时间点活杀至少3只。一部分肺组织放入10%中性福尔马林溶液固定，做常规H.E染色光镜观察，并做天狼猩红胶原染色[3]，偏振光显微镜观察。
5.图像分析：用Quantimet 970型图像分析仪测组织切片中肺泡壁厚度。在偏光显微镜下将观察到的胶原拍成彩色底片，以此做图像分析。
, 百拇医药
6.统计学处理：采用t检验。
二、结果
1.动物存活情况及大体观察：I+B组于第7、14天及17天各自然死亡1只，解剖观察分别见肺充血、出血，肺化脓性病灶；I组于第17、22天各死亡1只，同样亦见上述病变，其中22天死亡者还见有化脓性心包炎，各活杀时间点除C组外，见点灶状出血，在第56天时，可见I+B组明显肺叶萎缩，质地较硬，余未见明显改变。
2.光镜观察：C组为较正常的肺组织结构。I组第7、14、21、28及56天均有不同程度肺充血、出血，透明膜出现，肺泡壁多见由血浆蛋白渗出所致增厚。56天见细胞增生，即肺内细胞数目增多(巨噬细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、浆细胞等)。偏光镜下Ⅰ型胶原为红黄色荧光粗纤维，Ⅲ型胶原为绿色细纤维。28天起即明显Ⅰ型胶原增多，不同于C组所见的肺泡膈偶见微量的Ⅰ、Ⅲ型胶原，细小支气管和细小动脉外膜含少量的Ⅰ、Ⅲ型胶原。56天时有局灶肺纤维化变化。
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B组第7、14天亦见肺充血、出血等渗出性变化，21、28、56天均见细胞增生，肺泡壁增厚，肺内胶原较对照组有所增多。56天亦见有局灶性肺纤维化，以小支气管、支气管周围明显。
I+B组第7、14天仍以肺充血、出血为主，肺泡壁轻度增厚，21、28天即见细胞增生，胶原纤维增多，28天可见较早纤维细胞局部增多，56天见纤维化区域以小血管、支气管、肺泡壁处明显，且往往累及1～2个肺叶，其范围和程度较I组和B组要明显，肺泡壁增厚(图1，2)。同时也可看到其他肺叶的代偿性局部肺气肿。各组不同时间点主要病变程度比较见表1。
表1 各组受照射后不同时间大鼠肺病变程度比较
组别
渗出(照后时间，天)
增生(天)
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纤维化(天)
C………
I
7、14、21、28、56
28、56
个别56
(+++)
(+→++)
(+)
B
7、14、21
21、28
56,局灶
, 百拇医药
(++)
(++)
(++)
I+B
7、14、21
21、28
28、56
(+++)
(+++)
(++，+++)
单个肺叶
注：…示未见该病变；+示轻度病变；++示中度病变；+++示重度病变
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图1 I+B组56天见肺泡腔消失(HE 250×)
图2 I+B组56天肺内成纤维细胞及纤维细胞
增多，胶原条索出现(HE 500×)
3.图像分析
(1)肺泡壁厚度定量结果：由表2可以看出I+B组其肺泡壁增厚的程度重于I组和B组，其中第56天的时间点最为显著，I+B组与C组比较，差异有非常显著性(P<0.01)。
表2 各组动物受照射后肺泡壁增厚定量测定结果(
±s)
组别
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肺泡壁厚度(μm)
7天
28天
56天
C……
10.57±0.43
I
10.14±1.88
14.96±2.62
14.64±0.68**
B
11.58±1.12
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12.96±2.10
14.82±2.65
I+B
12.06±1.16
17.29±1.28**
18.12±1.16**#
注：与C组比较：**P<0.01；与I组比较：*P<0.05；与I组比较：#P<0.05，下同
(2)肺胶原定量结果：对各组于7、28、56天胶原(Ⅰ型胶原)的相对含量(Ⅰ型胶原面积/视野单位面积，即IA值)定量测定结果见表3。由表3可以看出：I组、B组及I+B组Ⅰ型胶原含量从第7天起即有增多趋势，以I+B组最为明显；I组、B组和I+B组比较第28天时Ⅰ型胶原明显增多，经统计学处理差异有显著性(P<0.05)，56天时仍较为明显。
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表3 各组动物受照射后肺胶原相对含量测量结果(±s)
组别
胶原相对含量(IA值)
7天
28天
56天
C……
3.21±1.20
I
5.94±0.48
6.39±2.30
, 百拇医药
12.37±1.24**
B
3.77±0.94
7.64±0.48*
12.02±4.14*
I+B
9.85±3.76*
14.13±3.08**#&
18.86±3.65**#
注：与B组比较：&P<0.05
三、讨论
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关于肺纤维化的防治一直尚无有效措施。随着对发病机理研究的深入，促使研究抑制某些生长因子产生生物学效应的药物成为一种趋势[4]。然而无论哪种药物经过合适的动物模型，特别是与临床放疗、化疗同时应用相近的动物模型的评价将是非常重要的。
以往作者曾探讨过放射性间质性肺炎的动物模型，发现 30 Gy单次照射可以形成典型的放射性间质性肺炎病变。然其纤维化形成时间较长，一般在6个月左右，多为局灶性。文献也有大量的关于单纯使用博来霉素所致肺纤维化的报道[2]，而将照射和博来霉素同时应用的报道并不多见。本研究发现，同时应用照射和博来霉素使肺纤维化出现的时间和程度均较单独照射或博来霉素提早和加重，2个月可见到完整肺叶的实变。定量研究亦表现为照射+博来霉素组肺内胶原相对含量增多，肺泡壁增厚程度显著。结果表明，照射和博来霉素同时应用所致肺纤维化模型基本是可行的。
参考文献
, 百拇医药
1 Aldenborg F,Nilsson K,Jarlshammar B,et al.Mast cell and biogenic amines in radiation-induced pulmonary fibrosis.Am J Respir Cell Mol Biol,1993,8:112-117.
2 Schrier DJ,Phan SH,McGarry MB,et al.The effects of nude mutation bleomycin-induced pulmonary fibrosis:biochemical evaluation.Am Rev Respir Dis,1983,127:614-617.
3 陈宁蒙，陈丹，王彤海，等.苦味酸和偏光法对实验性矽肺胶原纤维的研究.中华病理学杂志，1993，22：53.
4 Piguet PU,Rosen H,Vesin C,et al.Effective treatment of the pulmonary fibrosis elicited in mice by bleomycin or silica with anti-CD-11 antibodies.Am Rev Respir Dis,1993,147:435-441.
(收稿:1998-12-12 修回:1999-02-18), 百拇医药
单位：100850 北京放射医学研究所
关键词：
中华放射医学与防护杂志/990418
肺纤维化是临床上一个棘手的疾病。无论急性核辐射事故、放疗、化疗及某些病毒感染等最终都可造成肺纤维化。尽管许多学者对单纯照射或单纯博来霉素所致肺纤维化进行了大量研究[1，2]，但对两者同时应用所致肺纤维化的研究并不多见。因此，作者在对两者单独使用及同时应用所致肺纤维化观察比较的基础上，又应用图像分析仪进行了定量研究，为探索一个与实际临床相近的肺纤维化模型提供实验依据。
一、材料和方法
1.实验动物及分组：健康雄性Wistar大鼠70只，随机分为正常对照组(C)15只；照射组(I)15只；博来霉素组(B)20只；照射+博来霉素组(I+B)20只。
, 百拇医药
2.照射方式和条件：60Co γ射线全胸照射，照射野面积分别为 4.5 cm×4.0 cm，自行设计装置(10 cm铅砖)屏蔽大鼠其余部分。I组吸收剂量为 30 Gy(单次)；I+B组吸收剂量为 15 Gy(单次)，灌入博来霉素24小时后照射，吸收剂量率为 3.40 Gy/min。
3.给药方式：给予博来霉素的大鼠经戊巴比妥钠麻醉后仰卧于固定台上，暴露喉部，在额镜直视下，趁大鼠吸气瞬间将与 1 ml注射器相连的钝头针插入气管内，灌入博来霉素后立即竖起大鼠摇动，使其分布均匀，博来霉素灌入量为(体重g/100 g)×0.2 ml。
4.取材及光镜观察：各组经相应处理后7、14、21、28及56天活杀开胸取肺脏，每个时间点活杀至少3只。一部分肺组织放入10%中性福尔马林溶液固定，做常规H.E染色光镜观察，并做天狼猩红胶原染色[3]，偏振光显微镜观察。
5.图像分析：用Quantimet 970型图像分析仪测组织切片中肺泡壁厚度。在偏光显微镜下将观察到的胶原拍成彩色底片，以此做图像分析。
, 百拇医药
6.统计学处理：采用t检验。
二、结果
1.动物存活情况及大体观察：I+B组于第7、14天及17天各自然死亡1只，解剖观察分别见肺充血、出血，肺化脓性病灶；I组于第17、22天各死亡1只，同样亦见上述病变，其中22天死亡者还见有化脓性心包炎，各活杀时间点除C组外，见点灶状出血，在第56天时，可见I+B组明显肺叶萎缩，质地较硬，余未见明显改变。
2.光镜观察：C组为较正常的肺组织结构。I组第7、14、21、28及56天均有不同程度肺充血、出血，透明膜出现，肺泡壁多见由血浆蛋白渗出所致增厚。56天见细胞增生，即肺内细胞数目增多(巨噬细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、浆细胞等)。偏光镜下Ⅰ型胶原为红黄色荧光粗纤维，Ⅲ型胶原为绿色细纤维。28天起即明显Ⅰ型胶原增多，不同于C组所见的肺泡膈偶见微量的Ⅰ、Ⅲ型胶原，细小支气管和细小动脉外膜含少量的Ⅰ、Ⅲ型胶原。56天时有局灶肺纤维化变化。
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B组第7、14天亦见肺充血、出血等渗出性变化，21、28、56天均见细胞增生，肺泡壁增厚，肺内胶原较对照组有所增多。56天亦见有局灶性肺纤维化，以小支气管、支气管周围明显。
I+B组第7、14天仍以肺充血、出血为主，肺泡壁轻度增厚，21、28天即见细胞增生，胶原纤维增多，28天可见较早纤维细胞局部增多，56天见纤维化区域以小血管、支气管、肺泡壁处明显，且往往累及1～2个肺叶，其范围和程度较I组和B组要明显，肺泡壁增厚(图1，2)。同时也可看到其他肺叶的代偿性局部肺气肿。各组不同时间点主要病变程度比较见表1。
表1 各组受照射后不同时间大鼠肺病变程度比较
组别
渗出(照后时间，天)
增生(天)
, 百拇医药
纤维化(天)
C………
I
7、14、21、28、56
28、56
个别56
(+++)
(+→++)
(+)
B
7、14、21
21、28
56,局灶
, 百拇医药
(++)
(++)
(++)
I+B
7、14、21
21、28
28、56
(+++)
(+++)
(++，+++)
单个肺叶
注：…示未见该病变；+示轻度病变；++示中度病变；+++示重度病变
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图1 I+B组56天见肺泡腔消失(HE 250×)
图2 I+B组56天肺内成纤维细胞及纤维细胞
增多，胶原条索出现(HE 500×)
3.图像分析
(1)肺泡壁厚度定量结果：由表2可以看出I+B组其肺泡壁增厚的程度重于I组和B组，其中第56天的时间点最为显著，I+B组与C组比较，差异有非常显著性(P<0.01)。
表2 各组动物受照射后肺泡壁增厚定量测定结果(
±s)组别
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肺泡壁厚度(μm)
7天
28天
56天
C……
10.57±0.43
I
10.14±1.88
14.96±2.62
14.64±0.68**
B
11.58±1.12
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12.96±2.10
14.82±2.65
I+B
12.06±1.16
17.29±1.28**
18.12±1.16**#
注：与C组比较：**P<0.01；与I组比较：*P<0.05；与I组比较：#P<0.05，下同
(2)肺胶原定量结果：对各组于7、28、56天胶原(Ⅰ型胶原)的相对含量(Ⅰ型胶原面积/视野单位面积，即IA值)定量测定结果见表3。由表3可以看出：I组、B组及I+B组Ⅰ型胶原含量从第7天起即有增多趋势，以I+B组最为明显；I组、B组和I+B组比较第28天时Ⅰ型胶原明显增多，经统计学处理差异有显著性(P<0.05)，56天时仍较为明显。
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表3 各组动物受照射后肺胶原相对含量测量结果(
±s)组别
胶原相对含量(IA值)
7天
28天
56天
C……
3.21±1.20
I
5.94±0.48
6.39±2.30
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12.37±1.24**
B
3.77±0.94
7.64±0.48*
12.02±4.14*
I+B
9.85±3.76*
14.13±3.08**#&
18.86±3.65**#
注：与B组比较：&P<0.05
三、讨论
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关于肺纤维化的防治一直尚无有效措施。随着对发病机理研究的深入，促使研究抑制某些生长因子产生生物学效应的药物成为一种趋势[4]。然而无论哪种药物经过合适的动物模型，特别是与临床放疗、化疗同时应用相近的动物模型的评价将是非常重要的。
以往作者曾探讨过放射性间质性肺炎的动物模型，发现 30 Gy单次照射可以形成典型的放射性间质性肺炎病变。然其纤维化形成时间较长，一般在6个月左右，多为局灶性。文献也有大量的关于单纯使用博来霉素所致肺纤维化的报道[2]，而将照射和博来霉素同时应用的报道并不多见。本研究发现，同时应用照射和博来霉素使肺纤维化出现的时间和程度均较单独照射或博来霉素提早和加重，2个月可见到完整肺叶的实变。定量研究亦表现为照射+博来霉素组肺内胶原相对含量增多，肺泡壁增厚程度显著。结果表明，照射和博来霉素同时应用所致肺纤维化模型基本是可行的。
参考文献
, 百拇医药
1 Aldenborg F,Nilsson K,Jarlshammar B,et al.Mast cell and biogenic amines in radiation-induced pulmonary fibrosis.Am J Respir Cell Mol Biol,1993,8:112-117.
2 Schrier DJ,Phan SH,McGarry MB,et al.The effects of nude mutation bleomycin-induced pulmonary fibrosis:biochemical evaluation.Am Rev Respir Dis,1983,127:614-617.
3 陈宁蒙，陈丹，王彤海，等.苦味酸和偏光法对实验性矽肺胶原纤维的研究.中华病理学杂志，1993，22：53.
4 Piguet PU,Rosen H,Vesin C,et al.Effective treatment of the pulmonary fibrosis elicited in mice by bleomycin or silica with anti-CD-11 antibodies.Am Rev Respir Dis,1993,147:435-441.
(收稿:1998-12-12 修回:1999-02-18), 百拇医药