Genistein对小鼠小肠上皮细胞照射后再增殖和TGF－α、 EGF－R表达的影响
作者：姚伟强 Luka Milas
单位：姚伟强 200032 上海医科大学肿瘤医院；Luka Milas 美国MD Anderson癌症中心
关键词：小鼠；小肠；照射
中华放射医学与防护杂志/990416 【摘要】 目的 研究Genistein对小鼠小肠上皮细胞受照射后再增殖和TGF-α、EGF-R表达的影响。方法 实验鼠分两组：一组为对照组，单纯一次接受全身吸收剂量为5 Gy的照射；另一组为用药组，照射剂量与方法同对照组，在照射后不同时间注射Genistein。在照射后不同时间内杀死小鼠取出空肠，计数隐窝细胞数和分裂指数。并测定隐窝区和绒毛区TGF-α和EGF-R的表达。结果 与对照组比较，用药组小鼠小肠隐窝细胞的分裂指数和细胞数上升幅度较低，用药组TGF-α在隐窝区表达持续升高，而EGF-R在隐窝区的表达则较对照组低。结论 Genistein能明显抑制小鼠小肠上皮细胞受照射后的再增殖，这种影响可能是通过作用于EGF-R的表达起作用。
, http://www.100md.com
Genistein TGF-α EGF-REffects of genistein on repopulation of mouse jejunum crypts and expression of TGF-α and EGF-R following irradiation
YAO Weiqiang.
Cancer Hospital of Shanghai Medical University,Shanghai 200032,China.Luka Milas.MD Anderson Cancer Center,U.S.A.
【Abstract】 Objective To study the effects of genistein on the repopulation of mouse jejunum crypts and expression of TGF-α and EGF-R following irradiation. Methods C3Hf/kam mice were treated by radiotherapy plus genistein as the study group or treated by radiotherapy only as the control group.Using jejunum as material,the number of cryptal cells and mitotic index were measured at different time intervals after irradiation.At the same time the expression of TGF-α and EGF-R were also tested by immunohistochemical method. Results Comparied with the control group,the number of cryptal cells and mitotic index in the study group were decreased on days 3-4 after irradiation.The expression of TGF-α in crypts kept a high level while the expression of EGF-R in crypts decreased after irradiation in the study group. Conclusion The results indicate that genistein can suppress the repopulation of mouse jejunum crypts after irradiation while TGF-α and EGF-R play important roles in repopulation of mouse jejunum crypts after irradiation.
, 百拇医药
【Key words】 Mice Jejunum Irradiation Genistein TGF-α EGF-R
作者的初步研究发现，小鼠小肠上皮细胞受照射后第3天开始再增殖，在这种过程中，转移生长因子TGF-α及其受体EGF-R的表达可能起着“触发”作用。本文作者研究Genistein(从大豆中提取的一种黄酮类有效成分)对照射后小鼠小肠上皮细胞再增殖和TGF-α及受体EGF-R表达的影响，以进一步研究TGF-α及受体EGF-R在小鼠小肠上皮细胞再增殖中的作用。
材料和方法
实验采用16周龄的雄性C3Hf/kam纯系小鼠。分为单纯照射组(对照组)和放射加Genistein(用药组)。放射源为250 kV的X射线，吸收剂量率为1.6 Gy/min。全身一次性照射，吸收剂量为5 Gy。照射时小鼠不麻醉，置于特制的有机玻璃盒内。用药组照射同对照组，照射后即刻给药，以后每12小时给药，直至第4天杀死动物。给药剂量为50mg/kg，腹腔注射。照射后不同时间拉颈处死小鼠，取出空肠，常规固定。部分切片H.E染色后，高倍镜下计数每个隐窝的隐窝细胞数及分裂细胞，计数前者时取每50个隐窝的平均细胞数；计数后者时共计数500个隐窝细胞，然后换算成百分比。TGF-α及其受体EGF-R的表达测定均用ABC染色法。羊抗鼠的抗TGF-α和抗EGF-R的多克隆抗体及其他配套试剂均购自西格玛公司的测试药盒。测定步骤详见文献[1]。
, 百拇医药
免疫组化的定量测定：将已染色的玻片置于显微摄像机下，摄取后储存于计算机内，然后以特别编制的程序分别对绒毛区及隐窝区的染色进行定量处理，从而分别得到上述因子在绒毛区和隐窝区的定量表达，结果相对值的定义为该蛋白质表达的含量。该套分析程序由MD Anderson癌症中心生物统计室自行研制，详见文献[2]。统计方法采用t检验法。
结果
对照组照射后3～4天隐窝细胞数及分裂指数均达到高峰，分别由照射前的32 个/隐窝上升到42 个/隐窝；3.5%上升到6.5%～6.8%。而用药组照射后3～4天隐窝细胞数仅为32～35个/隐窝，分裂指数也仅为4%左右，较照射前略有上升，但上升幅度远不及对照组。
对照组照射后1天TGF-α和EGF-R在隐窝区表达即达到高峰，但随后迅速下降，至第3～4天已降至基础水平。用药组照射后TGF-α在隐窝区的表达持续高于照射前；反之，EGF-R在隐窝区的表达一直处于照射前的基础水平，未见到明显的升高(图1，2)。照射前后TGF-α和EGF-R在绒毛区的表达二组差异均无显著性。
, 百拇医药
图1 5 Gy照射后小鼠小肠隐窝区TGF-α的表达
图2 5 Gy照射后小鼠小肠隐窝区EGF-R的表达
讨论
Genistein是近年来从大豆中提取的一种黄酮类有效成分，已有的实验表明它能高度特异地抑制酪氨酸蛋白激酶的作用，并有不同程度的抑制实验性肿瘤生长和抗突变致畸作用[3]。本实验结果显示，用Genistein处理后，小鼠小肠上皮细胞受照射后隐窝细胞数、分裂指数的上升受到明显抑制，提示小肠上皮细胞受到照射后的再增殖被抑制。但用药组TGF-α表达在隐窝区持续升高，而EGF-R在隐窝区表达一直处在照射前基础水平，已知TGF-α通过与EGF-R结合，激活后者的酪氨酸蛋白激酶，引起EGF-R自身的磷酸化，再激活下游一系列信号引起细胞的增殖和分裂[4]。推测经Genistein处理后，EGF-R表达下降，酪氨酸激酶被“封闭”，导致TGF-α无法与EGF-R有效结合并激活其磷酸化。因此TGF-α相对表达升高，即使如此，TGF-α与EGF-R的偶合作用已无法实现，使细胞接受不到有关增殖分裂的信号，这可能是Genistein抑制照射后小鼠上皮细胞再增殖的一个重要机理。这也支持TGF-α及其受体EGF-R是调控小鼠小肠上皮细胞照射后再增殖过程的重要因素这一观点。
, 百拇医药
用药组TGF-α、EGF-R在绒毛区的表达与对照组差异无显著性，这可能提示调控小肠上皮细胞再增殖的区域主要位于隐窝区而非绒毛区。同时与隐窝区和绒毛区对放射的敏感性不同有关，前者要大于后者，故隐窝区的放射效应及其相应的生化改变要来得更明显。
本课题受美国纪念Mammadi Soubavar特别研究员基金资助(项目号：P-1-739)
参考文献
1 Ruifrok ACC,Mason KA,Lozano G,et al.Spatial and temporal patterns of expresssion of epidermal growth factor,transforming growth factor alpha and transforming growth factor beta 1-3 and their receptors in mouse jejunum after radiation treatment.Radiat Res,1997,147:1-7.
2 Wei H,Bowen R,Cai Q.A preliminary result of antioxidant and antipromotional effects of the soybean isoflavone Genistein.Br J Hosp Med,1993,49:124-130.
3 惠宏襄，金明，赵小宁.转化生长因子α.国外医学分子生物学分册，1994，16：254-259.
(收稿:1998-10-13 修回:1999-01-23), 百拇医药
单位：姚伟强 200032 上海医科大学肿瘤医院；Luka Milas 美国MD Anderson癌症中心
关键词：小鼠；小肠；照射
中华放射医学与防护杂志/990416 【摘要】 目的 研究Genistein对小鼠小肠上皮细胞受照射后再增殖和TGF-α、EGF-R表达的影响。方法 实验鼠分两组：一组为对照组，单纯一次接受全身吸收剂量为5 Gy的照射；另一组为用药组，照射剂量与方法同对照组，在照射后不同时间注射Genistein。在照射后不同时间内杀死小鼠取出空肠，计数隐窝细胞数和分裂指数。并测定隐窝区和绒毛区TGF-α和EGF-R的表达。结果 与对照组比较，用药组小鼠小肠隐窝细胞的分裂指数和细胞数上升幅度较低，用药组TGF-α在隐窝区表达持续升高，而EGF-R在隐窝区的表达则较对照组低。结论 Genistein能明显抑制小鼠小肠上皮细胞受照射后的再增殖，这种影响可能是通过作用于EGF-R的表达起作用。
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Genistein TGF-α EGF-REffects of genistein on repopulation of mouse jejunum crypts and expression of TGF-α and EGF-R following irradiation
YAO Weiqiang.
Cancer Hospital of Shanghai Medical University,Shanghai 200032,China.Luka Milas.MD Anderson Cancer Center,U.S.A.
【Abstract】 Objective To study the effects of genistein on the repopulation of mouse jejunum crypts and expression of TGF-α and EGF-R following irradiation. Methods C3Hf/kam mice were treated by radiotherapy plus genistein as the study group or treated by radiotherapy only as the control group.Using jejunum as material,the number of cryptal cells and mitotic index were measured at different time intervals after irradiation.At the same time the expression of TGF-α and EGF-R were also tested by immunohistochemical method. Results Comparied with the control group,the number of cryptal cells and mitotic index in the study group were decreased on days 3-4 after irradiation.The expression of TGF-α in crypts kept a high level while the expression of EGF-R in crypts decreased after irradiation in the study group. Conclusion The results indicate that genistein can suppress the repopulation of mouse jejunum crypts after irradiation while TGF-α and EGF-R play important roles in repopulation of mouse jejunum crypts after irradiation.
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【Key words】 Mice Jejunum Irradiation Genistein TGF-α EGF-R
作者的初步研究发现，小鼠小肠上皮细胞受照射后第3天开始再增殖，在这种过程中，转移生长因子TGF-α及其受体EGF-R的表达可能起着“触发”作用。本文作者研究Genistein(从大豆中提取的一种黄酮类有效成分)对照射后小鼠小肠上皮细胞再增殖和TGF-α及受体EGF-R表达的影响，以进一步研究TGF-α及受体EGF-R在小鼠小肠上皮细胞再增殖中的作用。
材料和方法
实验采用16周龄的雄性C3Hf/kam纯系小鼠。分为单纯照射组(对照组)和放射加Genistein(用药组)。放射源为250 kV的X射线，吸收剂量率为1.6 Gy/min。全身一次性照射，吸收剂量为5 Gy。照射时小鼠不麻醉，置于特制的有机玻璃盒内。用药组照射同对照组，照射后即刻给药，以后每12小时给药，直至第4天杀死动物。给药剂量为50mg/kg，腹腔注射。照射后不同时间拉颈处死小鼠，取出空肠，常规固定。部分切片H.E染色后，高倍镜下计数每个隐窝的隐窝细胞数及分裂细胞，计数前者时取每50个隐窝的平均细胞数；计数后者时共计数500个隐窝细胞，然后换算成百分比。TGF-α及其受体EGF-R的表达测定均用ABC染色法。羊抗鼠的抗TGF-α和抗EGF-R的多克隆抗体及其他配套试剂均购自西格玛公司的测试药盒。测定步骤详见文献[1]。
, 百拇医药
免疫组化的定量测定：将已染色的玻片置于显微摄像机下，摄取后储存于计算机内，然后以特别编制的程序分别对绒毛区及隐窝区的染色进行定量处理，从而分别得到上述因子在绒毛区和隐窝区的定量表达，结果相对值的定义为该蛋白质表达的含量。该套分析程序由MD Anderson癌症中心生物统计室自行研制，详见文献[2]。统计方法采用t检验法。
结果
对照组照射后3～4天隐窝细胞数及分裂指数均达到高峰，分别由照射前的32 个/隐窝上升到42 个/隐窝；3.5%上升到6.5%～6.8%。而用药组照射后3～4天隐窝细胞数仅为32～35个/隐窝，分裂指数也仅为4%左右，较照射前略有上升，但上升幅度远不及对照组。
对照组照射后1天TGF-α和EGF-R在隐窝区表达即达到高峰，但随后迅速下降，至第3～4天已降至基础水平。用药组照射后TGF-α在隐窝区的表达持续高于照射前；反之，EGF-R在隐窝区的表达一直处于照射前的基础水平，未见到明显的升高(图1，2)。照射前后TGF-α和EGF-R在绒毛区的表达二组差异均无显著性。
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图1 5 Gy照射后小鼠小肠隐窝区TGF-α的表达
图2 5 Gy照射后小鼠小肠隐窝区EGF-R的表达
讨论
Genistein是近年来从大豆中提取的一种黄酮类有效成分，已有的实验表明它能高度特异地抑制酪氨酸蛋白激酶的作用，并有不同程度的抑制实验性肿瘤生长和抗突变致畸作用[3]。本实验结果显示，用Genistein处理后，小鼠小肠上皮细胞受照射后隐窝细胞数、分裂指数的上升受到明显抑制，提示小肠上皮细胞受到照射后的再增殖被抑制。但用药组TGF-α表达在隐窝区持续升高，而EGF-R在隐窝区表达一直处在照射前基础水平，已知TGF-α通过与EGF-R结合，激活后者的酪氨酸蛋白激酶，引起EGF-R自身的磷酸化，再激活下游一系列信号引起细胞的增殖和分裂[4]。推测经Genistein处理后，EGF-R表达下降，酪氨酸激酶被“封闭”，导致TGF-α无法与EGF-R有效结合并激活其磷酸化。因此TGF-α相对表达升高，即使如此，TGF-α与EGF-R的偶合作用已无法实现，使细胞接受不到有关增殖分裂的信号，这可能是Genistein抑制照射后小鼠上皮细胞再增殖的一个重要机理。这也支持TGF-α及其受体EGF-R是调控小鼠小肠上皮细胞照射后再增殖过程的重要因素这一观点。
, 百拇医药
用药组TGF-α、EGF-R在绒毛区的表达与对照组差异无显著性，这可能提示调控小肠上皮细胞再增殖的区域主要位于隐窝区而非绒毛区。同时与隐窝区和绒毛区对放射的敏感性不同有关，前者要大于后者，故隐窝区的放射效应及其相应的生化改变要来得更明显。
本课题受美国纪念Mammadi Soubavar特别研究员基金资助(项目号：P-1-739)
参考文献
1 Ruifrok ACC,Mason KA,Lozano G,et al.Spatial and temporal patterns of expresssion of epidermal growth factor,transforming growth factor alpha and transforming growth factor beta 1-3 and their receptors in mouse jejunum after radiation treatment.Radiat Res,1997,147:1-7.
2 Wei H,Bowen R,Cai Q.A preliminary result of antioxidant and antipromotional effects of the soybean isoflavone Genistein.Br J Hosp Med,1993,49:124-130.
3 惠宏襄，金明，赵小宁.转化生长因子α.国外医学分子生物学分册，1994，16：254-259.
(收稿:1998-10-13 修回:1999-01-23), 百拇医药