氚水照射对发育中的中枢神经系统影响——低水平氚剂量阈值研究
作者：周湘艳 王冰 高卫民 吕慧敏
单位：100088 北京，卫生部工业卫生实验所(周湘艳、高卫民、吕慧敏)；日本科技厅放射线医学综合研究所(王冰)
关键词：氚水；大鼠；小鼠；中枢神经系统；海马；Ca2+电流；阈值
中华放射医学与防护杂志/990414 【摘要】 目的 研究大、小鼠出生前受氚水照射对发育中的中枢神经系统影响的剂量阈值。方法 选用孕龄12.5天和13.0天的C57BL/6J小鼠和Wistar大鼠，每克体重注入氚水活度(×104 Bq)分别为0.00、24.09、48.18和144.54，观察仔代生长发育、神经行为、脑细胞学、脑神经肽含量、海马神经元和Ca2+电流幅度改变等56项生物学指标与对照组比较出现显著差异的最低剂量。结果 以大鼠和小鼠为实验对象，观察的56项生物学指标中，氚的致畸阈值:80.4%的指标分布在0.030～0.092 Gy范围内，有少数指标(19.6%)分布在0.093～0.300 Gy范围内。结论 通过上述研究结果证明低水平氚照射对发育中的中枢神经系统影响存在剂量阈值。
, 百拇医药
Threshold dose to developing central nerve system of rats and mice from prenatal exposure to tritiated water
ZHOU Xiangyan, WANG Bing, GAO Weimin,et al.
Laboratory of Industrial Hygiene,Ministry of Health,Beijing 100088,China.
【Abstract】 Objectives To study the threshold dose to the developing central nerve system of rats and mice from prenatal exposure to tritiated water. Methods Pregnant adult C57BL/6J strain mice and Wistar strain rats were irradiated with beta-rays from HTO by a single intraperitoneal injection on the 12.5th and 13th days of gestation.The activities of HTO were 24.09，48.18 and 144.54 (×104Bq/g bw),respectively.Fifty-six parameters including postnatal growth,neurobehavior,pathology of brain,neuropeptide contents,changes of hippocampal neurons,Ca2+ conductance of hippocampal neurons etc were used to test the teratogenic threshold dose (the lowest dose was different from that of the control). Results Of the observed 56 parameters of rats and mice 80.4% indicated that the threshold doses for prenatal HTO exposure ranged from 0.030 Gy to 0.092 Gy,and the other 19.6% showed the threshold doses from 0.093 to 0.300 Gy. Conclusions There exists threshold dose from the low level tritiated water irradiation of the developing central nerve system.
, 百拇医药
【Key words】 Tritiated water Rats Mice Central nerve system Hippocampus Ca2+ conductance Threshold dose
正在发育中的人脑对辐射特别敏感，尤其是出生前照射对发育中的中枢神经系统影响已成为ICRP和UNSCEAR非常关注的重要研究内容，其中之一是关于胎儿发育的特殊阶段辐射效应是否存在线性剂量-响应关系或者是否有阈剂量的问题[1,2]。这一问题关系到人在出生前受照射后辐射对脑损伤的定量危险估计，这对辐射防护具有实际重要意义。然而，作为这种估计只根据人类现在的资料是有限的或不完全的。能够采用合理的动物模型进行实验研究提供出生前照射对脑发育影响的有关剂量-响应关系以及分子和细胞机理的资料是非常重要的。本文作者研究了大、小鼠出生前受氚水照射对发育中脑及神经行为等致畸影响的整体、组织、细胞和Ca2+电流等56项生物学指标剂量-响应关系及低水平氚照射的剂量阈值。
, 百拇医药
材料和方法
1.实验动物选用孕龄12.5天和13.0天的C57BL/6J小鼠和Wistar大鼠，由中国预防医学科学院微生物流行病研究所和北京医科大学动物部提供(动物合格证号：医动字第01-3059号和京动字第8910R016号)。
2.氚水活度和剂量估算由中国科学院上海原子核研究所提供浓度为3.7×108 Bq/ml的氚水，蒸馏水稀释后，Pharmacia WALLAC 1410型液闪标定后待用。妊娠12.5和13.0天的小鼠和大鼠，各分4个实验组，按每克体重分别注射氚水活度(×104 Bq)为0.00、24.09、48.18和144.54。依据氚内照射剂量公式：D=51.2×Q×E/M估算仔鼠出生后某一阶段的体内氚吸收剂量；但是，本研究考虑到胚胎、胎儿和出生后仔鼠体内水含量(100%)明显高于成年(62%)，年幼者生物半排期(Tb)比成年短，以及由于动物品种不同，大鼠(Tb为3.2天)和小鼠(Tb为1.6～2.0天)生物半排期存在明显差异等因素。因此，本实验估算的仔鼠体内总氚剂量(D总)应包括胎儿期(D胎)及出生后某一阶段仔鼠体内氚剂量(D仔)的总和，即D总=D胎+D仔[3-5]。
, 百拇医药
3.生物学指标与方法
(1)生长发育及神经行为：生长发育(体重)和生理标志(张耳、开眼和出牙)、新生反射和感觉功能(断崖回避、平面翻正、负趋地性、空中翻正、抓握反射、听觉惊愕、视觉定位、趋母性试验和痛觉反应潜伏期的测定)、运动协调功能和活动度(转体、足展开、前肢悬挂和连续通道活动)、行为测试试验(旷场试验和孔板探究试验)以及学习和记忆能力的测试试验(电击回避学习、电击回避记忆测试、食物迷宫测试、水迷宫测试、Y迷宫刺激单向回避反射实验和条件反射试验)参见文献[6-9]。
(2)脑发育及脑海马病理：脑发育(脑体比)、脑皮质厚度、脑细胞计数、大脑锥体细胞发育以及脑海马锥体细胞计数参见文献[10，11]。
(3)雄鼠脑神经肽含量的测定：生长抑素(SOM)和精氨酸加压素(AVP)测定参见文献[12]。
, http://www.100md.com
(4)神经元培养和电生理记录：①海马神经元培养：当日出生的Wistar仔鼠3只，取出完整的海马，制成含有单个细胞的混悬液，用种植液调整到5×105细胞/ml[13]。在预先涂有多聚赖氨酸的35 mm的培养皿中，每个培养皿均匀接种2 ml的细胞混悬液，每组培养10皿。将培养皿置于37℃，5% CO2，饱和湿度条件下生长。24小时后，每个培养皿用2 ml的饲养液全量换液1次。每周半量换液两次(饲养液)，培养第5天加入5-氟尿嘧啶(0.061 mmol/L)抑制神经胶质细胞生长。海马神经元体外培养第6、8、10和12天在放大300倍视野下[目镜(10)×物镜(30)]进行形态观察及细胞计数，每皿计数50个视野，每天2皿(计数不包括神经胶质细胞，神经元以胞体在视野内为标准)，计算平均每个视野的神经元数。各组海马神经元形态观察时间均为15天以上。②海马神经元电生理记录：在相差显微镜下找到生长良好的海马神经元细胞，采用膜片钳(patch clamp)技术，在AXOPATCH-1D膜片钳放大器上，用全细胞记录方式(whole-cell recording)测定海马神经元最大Ca2+电流，比较Ca2+电流幅度。实验中电极电阻为4～6 MΩ，用微电极拉制仪制备。用TTX(1 μmol/L)阻断钠电流。实验结果显示于Tektronix 5111A记忆示波器上。电压钳制信号的产生及膜电流的接收、贮存均在IBM-386兼容机中进行，控制程序为pClamp 5.5.1。各剂量组分别于培养后6、8、10和12天记录海马神经元Ca2+电流，每天2皿细胞，每皿测定2～3个细胞。
, http://www.100md.com
4.资料分析：用STATA和SAS软件对实验数据进行检验。采用t检验、方差分析及χ2检验进行数据处理。用WORD及EXCELL进行图表分析。
结果
完成本项研究分为3部分(表1，2)：第一部分实验(1992～1994年)共用C57BL/6J孕鼠63只，获仔鼠399只，进行22项生物学指标的剂量-响应关系及剂量阈值的研究。为了进一步验证有关生物学指标的剂量阈值，开展了第二部分实验(1995～1999年)，同样选用C57BL/6J孕鼠49只，获仔鼠234只，研究了18项生物学指标及剂量阈值的结果。第三部分实验(1995～1999年)目的为了验证在相同氚活度照射下，小鼠与大鼠生物学指标及剂量阈值是否存在差异。因此，采用Wistar孕鼠12只，获仔鼠86只，验证了16项生物学指标剂量-响应关系及剂量阈值。
表1 出生前受氚水照射动物不同生物学指标影响的剂量阈值
, http://www.100md.com
生物学指标
剂量阈值(Gy)
生物学指标
剂量阈值(Gy)
第一部分实验(1992～1994年)
痛觉反应潜伏期
0.036
体重
0.036
运动协调功能和活动度
生理标志
转体
, 百拇医药
0.036
张耳
0.036
足展开
0.036
开眼
0.072
连续通道活动
0.072
出牙
0.036
学习记忆
新生反射
, 百拇医药
Y迷宫刺激单向回避反射
0.036
平面翻正
0.072
条件反射达标率
0.072
抓握反射
0.036
脑发育和脑病理
感觉功能
脑体比
视觉定位
0.072
, http://www.100md.com
雌性
0.072
趋母性试验
0.036
雄性
0.216
行为测试
脑病理
旷场试验
0.072
海马锥体细胞数(21天龄)
孔板探究试验
0.036
, http://www.100md.com
CA1
0.036
学习记忆
CA2
0.216
电击回避学习
0.072
CA3
0.036
电击回避记忆
0.072
CA4
0.216
, 百拇医药
食物迷宫
0.036
水迷宫
0.036
第三部分实验(1995～1999年)
脑发育和脑病理
生理标志
全脑重
0.072
张耳
0.268
脑病理
开眼
, 百拇医药
0.274
脑皮质厚度
出牙
0.092
大脑
0.216
新生反射
小脑
0.216
平面翻正
0.091
脑细胞数
负趋地性
, 百拇医药
0.091
大脑
0.036
感觉功能
小脑
0.036
听觉惊愕
0.092
大脑锥体细胞树突
0.036
运动协调功能和活动度
脑神经肽含量
前肢悬挂
, 百拇医药
0.274
生长抑素(SOM)
0.072
连续通道活度
0.046
精氨酸加压素(AVP)
0.216
学习记忆功能
Y迷宫刺激回避反射
0.046
第二部分实验(1995～1999年)
条件反射达标率
, http://www.100md.com
0.092
体重
0.035
脑发育和脑病理
生理标志
脑重(52天龄)
0.274
张耳
0.036
海马锥体细胞计数
开眼
0.072
CA1
, http://www.100md.com
0.046
新生反射
CA3
0.092
断崖回避
0.072
体外培养海马神经元
空中翻正
0.072
生长发育不良
0.085
感觉功能
细胞计数
, 百拇医药
0.085
听觉惊愕
0.036
电生理记录(Ca2+电流)
0.254
注：第一、二部分实验所用实验动物为C57BL/6J小鼠；第三部分实验用Wistar大鼠;剂量阈值为与对照组相比差异出现显著性的最低剂量
表2 低水平氚水剂量阈值分布
剂量阈值 (Gy)
生物学指标数(个)
百分比(%)
第一部分实验
, 百拇医药
0.030～0.050
11
50.0
0.051～0.092
8
36.4
0.093～0.300
3
13.6
合计
22
100.0
第二部分实验
, 百拇医药
0.030～0.050
9
50.0
0.051～0.092
6
33.3
0.093～0.300
3
16.7
合计
18
100.0
第三部分实验
, http://www.100md.com
0.030～0.050
3
18.8
0.051～0.092
8
50.0
0.093～0.300
5
31.2
合计
16
100.0
从上述的研究结果概述4点初步的印象：①发育中脑的不同部位辐射敏感性差异相当大，其氚剂量阈值也不同，如：表1中Wistar仔鼠脑海马锥体细胞数CA1区间剂量为0.046 Gy，CA3区为0.092 Gy。②不同种类的哺乳动物虽然在同一剂量范围内照射，剂量阈值分布也不同，如：表2中C57BL/6J仔鼠50%的生物学指标的剂量阈值在0.03～0.05 Gy,Wistar大鼠仅有18.8%的剂量阈值分布在0.03～0.05 Gy。③结合作者以前的研究结果[4，6-12]证明了神经行为的改变不是独立存在的，与脑细胞学、脑神经肽含量及Ca2+电流改变等有密切关系。④56项生物学指标获得的剂量阈值分布为：41.1%的生物学指标分布在0.030～0.05 Gy范围内，39.3%分布在0.051～0.092 Gy范围内，也就是说80.4%检测生物学指标的剂量阈值分布在0.092 Gy以下，仅有19.6%的指标是在0.093～0.300 Gy(表3)。
, http://www.100md.com
表3 出生前氚水照射对大、小鼠发育中中枢神经系统影响的56项生物学指标剂量阈值的分布
氚阈剂量(Gy)
生物学指标数(个)
分布(%)
0.030～0.050
23
41.1
0.051～0.092
22
39.3
0.093～0.300
, http://www.100md.com
11
19.6
讨论
人类出生前受照射后脑辐射损伤的危险度定量估计值所依据的人类资料主要来自日本广岛和长崎原子弹爆炸时宫内受照射幸存者的调查。资料显示：妊娠8～15周胎儿脑发育比受精后8周内及妊娠16～25周对辐射更为敏感。ICRP和UNSCEAR认为妊娠16～25周受照射的损伤效应是存在剂量阈值的，其阈值为0.64～0.70 Gy，其95% CI下界为0.21 Gy；而妊娠8～15周受照射的脑发育虽然对辐射相当敏感，但是否存在阈值，还不能凭已有的流行病学资料及实验资料解决。
随着研究的深入，国内外许多研究者对此给以极大关注并陆续报道了许多宝贵的实验资料。就外照射资料而言，Jensh等[14，15]用0.2 Gy及以上剂量X射线照射Wistar大鼠，通过神经行为等生物学指标观察，认为所采用的参数在0.2或0.2 Gy以上时都有阈值。Muller等关于辐射致畸阈值的研究结果提示，单细胞尚未发现阈值的存在，而对32到64细胞阶段的胚胎则存在1 Gy的阈剂量[16]。
, http://www.100md.com
近10年来，作者选用C57BL/6J小鼠及Wistar大鼠两种哺乳类动物在相等活度的低水平氚水照射下，从整体、组织、细胞及Ca2+电流等56项生物学指标的剂量-响应关系及与对照组相比出现显著性差异的最低剂量。从本实验获得的阈剂量主要在0.030～0.092 Gy，较多数实验报道为低。这可能由于不同的实验动物对辐射所具有的敏感性存在差异；加之本实验以氚水为辐射源，根据以往研究的结果，氚在低剂量下具有较大的RBE值的缘故。鉴于中枢神经系统调控机体的特殊性，其本身结构的复杂性及不同测试指标存在着辐射敏感性差异，有关出生前氚水照射对发育中的中枢神经系统影响及其阈剂量研究对定量估计辐射危险度意义重大，利用多种实验动物模型，加强氚致脑细胞分子学及基因水平研究，将为探讨损伤机理及积累低水平氚剂量阈值提供理想的研究手段。
本课题受国家自然科学基金(项目号：39170274)和卫生部医学研究基金(项目号：94-1-096及96-2-050)资助
参考文献
, http://www.100md.com
1 国际放射防护委员会.电离辐射的危险度.杜铭海译.闫效珊校.北京：原子能出版社，1994. 201-210.
2 联合国原子辐射效应科学委员会(UNSCEAR).电离辐射源与效应.UNSCEAR 1993年向联合国大会提交的报告和科学附件，北京：原子能出版社，1993.841-843.
3 张伟，吕慧敏，周湘艳.低水平氚水内照射的剂量估算.中华放射医学与防护杂志，1997，17：255-257.
4 高卫民，周湘艳.出生前氚水照射对仔代大鼠生长发育及神经行为的影响.中华放射医学与防护杂志，1998，18：381-385.
5 杨志远，郭月凤.出生前氚水照射致大鼠脑细胞缺失的剂量反应关系研究.辐射防护，1990，10：255-258.
6 王冰，周湘艳.小剂量氚水宫内辐射对出生后仔鼠行为、学习及记忆能力的影响.辐射研究与辐射工艺学报，1993，11：184-188.
, http://www.100md.com
7 Bing Wang,Xiang-Yan Zhou.Effects of prenatal exposure to low-dose β radiation from tritiated water on the neurobehavior of mice.J Radiat Res,1995,36:103-111.
8 高卫民，周湘艳.出生前氚水照射对仔代小鼠生长发育及神经行为的影响.辐射防护，1998，18：280-289.
9 高卫民，周湘艳.出生前氚水照射对仔鼠海马神经元电生理及神经行为的影响.辐射防护，1997，17：363-372.
10 王冰，周湘艳.低剂量氚宫内照射对仔鼠脑神经元发育的影响.中华放射医学与防护杂志，1994，14：79-82.
11 高卫民，周湘艳.出生前氚水照射对仔代小鼠学习记忆行为的影响及机制探讨.中国毒理学通讯，1998，1：5-8.
, http://www.100md.com
12 王冰，周湘艳，王玉起，等.小剂量氚水宫内照射对出生后仔鼠脑组织生长抑素、精氨酸加压素含量的影响.中华放射医学与防护杂志，1993，13：311-314.
13 何湘平，刘青松，刘传缋.适于电生理学研究的新生大鼠中枢神经元培养.中国应用生理学杂志，1994，10：179-182.
14 Jensh RP,Brent RL.Effects of 0.6 Gy prenatal irradiation on postnatal neurophysiologic development in the Wistar rat.Proc Soc Exp Biol Med,1986,181:611-619.
15 Jensh RP,Brent RL.The effect of low-level prenatal irradiation on postnatal development in the Wistar rat.Proc Soc Exp Biol Med,1987,184:256-263.
16 Muller WU,Streffer C,Pampfer S.The question of threshold doses for radiation damage:malformations induced by radiation exposure of unicellular or multicellular preimplantation stages of the mouse.Radiat Environ Biophys,1994,33:63.
(收稿:1999-03-22 修回:1999-05-04), http://www.100md.com
单位：100088 北京，卫生部工业卫生实验所(周湘艳、高卫民、吕慧敏)；日本科技厅放射线医学综合研究所(王冰)
关键词：氚水；大鼠；小鼠；中枢神经系统；海马；Ca2+电流；阈值
中华放射医学与防护杂志/990414 【摘要】 目的 研究大、小鼠出生前受氚水照射对发育中的中枢神经系统影响的剂量阈值。方法 选用孕龄12.5天和13.0天的C57BL/6J小鼠和Wistar大鼠，每克体重注入氚水活度(×104 Bq)分别为0.00、24.09、48.18和144.54，观察仔代生长发育、神经行为、脑细胞学、脑神经肽含量、海马神经元和Ca2+电流幅度改变等56项生物学指标与对照组比较出现显著差异的最低剂量。结果 以大鼠和小鼠为实验对象，观察的56项生物学指标中，氚的致畸阈值:80.4%的指标分布在0.030～0.092 Gy范围内，有少数指标(19.6%)分布在0.093～0.300 Gy范围内。结论 通过上述研究结果证明低水平氚照射对发育中的中枢神经系统影响存在剂量阈值。
, 百拇医药
Threshold dose to developing central nerve system of rats and mice from prenatal exposure to tritiated water
ZHOU Xiangyan, WANG Bing, GAO Weimin,et al.
Laboratory of Industrial Hygiene,Ministry of Health,Beijing 100088,China.
【Abstract】 Objectives To study the threshold dose to the developing central nerve system of rats and mice from prenatal exposure to tritiated water. Methods Pregnant adult C57BL/6J strain mice and Wistar strain rats were irradiated with beta-rays from HTO by a single intraperitoneal injection on the 12.5th and 13th days of gestation.The activities of HTO were 24.09，48.18 and 144.54 (×104Bq/g bw),respectively.Fifty-six parameters including postnatal growth,neurobehavior,pathology of brain,neuropeptide contents,changes of hippocampal neurons,Ca2+ conductance of hippocampal neurons etc were used to test the teratogenic threshold dose (the lowest dose was different from that of the control). Results Of the observed 56 parameters of rats and mice 80.4% indicated that the threshold doses for prenatal HTO exposure ranged from 0.030 Gy to 0.092 Gy,and the other 19.6% showed the threshold doses from 0.093 to 0.300 Gy. Conclusions There exists threshold dose from the low level tritiated water irradiation of the developing central nerve system.
, 百拇医药
【Key words】 Tritiated water Rats Mice Central nerve system Hippocampus Ca2+ conductance Threshold dose
正在发育中的人脑对辐射特别敏感，尤其是出生前照射对发育中的中枢神经系统影响已成为ICRP和UNSCEAR非常关注的重要研究内容，其中之一是关于胎儿发育的特殊阶段辐射效应是否存在线性剂量-响应关系或者是否有阈剂量的问题[1,2]。这一问题关系到人在出生前受照射后辐射对脑损伤的定量危险估计，这对辐射防护具有实际重要意义。然而，作为这种估计只根据人类现在的资料是有限的或不完全的。能够采用合理的动物模型进行实验研究提供出生前照射对脑发育影响的有关剂量-响应关系以及分子和细胞机理的资料是非常重要的。本文作者研究了大、小鼠出生前受氚水照射对发育中脑及神经行为等致畸影响的整体、组织、细胞和Ca2+电流等56项生物学指标剂量-响应关系及低水平氚照射的剂量阈值。
, 百拇医药
材料和方法
1.实验动物选用孕龄12.5天和13.0天的C57BL/6J小鼠和Wistar大鼠，由中国预防医学科学院微生物流行病研究所和北京医科大学动物部提供(动物合格证号：医动字第01-3059号和京动字第8910R016号)。
2.氚水活度和剂量估算由中国科学院上海原子核研究所提供浓度为3.7×108 Bq/ml的氚水，蒸馏水稀释后，Pharmacia WALLAC 1410型液闪标定后待用。妊娠12.5和13.0天的小鼠和大鼠，各分4个实验组，按每克体重分别注射氚水活度(×104 Bq)为0.00、24.09、48.18和144.54。依据氚内照射剂量公式：D=51.2×Q×E/M估算仔鼠出生后某一阶段的体内氚吸收剂量；但是，本研究考虑到胚胎、胎儿和出生后仔鼠体内水含量(100%)明显高于成年(62%)，年幼者生物半排期(Tb)比成年短，以及由于动物品种不同，大鼠(Tb为3.2天)和小鼠(Tb为1.6～2.0天)生物半排期存在明显差异等因素。因此，本实验估算的仔鼠体内总氚剂量(D总)应包括胎儿期(D胎)及出生后某一阶段仔鼠体内氚剂量(D仔)的总和，即D总=D胎+D仔[3-5]。
, 百拇医药
3.生物学指标与方法
(1)生长发育及神经行为：生长发育(体重)和生理标志(张耳、开眼和出牙)、新生反射和感觉功能(断崖回避、平面翻正、负趋地性、空中翻正、抓握反射、听觉惊愕、视觉定位、趋母性试验和痛觉反应潜伏期的测定)、运动协调功能和活动度(转体、足展开、前肢悬挂和连续通道活动)、行为测试试验(旷场试验和孔板探究试验)以及学习和记忆能力的测试试验(电击回避学习、电击回避记忆测试、食物迷宫测试、水迷宫测试、Y迷宫刺激单向回避反射实验和条件反射试验)参见文献[6-9]。
(2)脑发育及脑海马病理：脑发育(脑体比)、脑皮质厚度、脑细胞计数、大脑锥体细胞发育以及脑海马锥体细胞计数参见文献[10，11]。
(3)雄鼠脑神经肽含量的测定：生长抑素(SOM)和精氨酸加压素(AVP)测定参见文献[12]。
, http://www.100md.com
(4)神经元培养和电生理记录：①海马神经元培养：当日出生的Wistar仔鼠3只，取出完整的海马，制成含有单个细胞的混悬液，用种植液调整到5×105细胞/ml[13]。在预先涂有多聚赖氨酸的35 mm的培养皿中，每个培养皿均匀接种2 ml的细胞混悬液，每组培养10皿。将培养皿置于37℃，5% CO2，饱和湿度条件下生长。24小时后，每个培养皿用2 ml的饲养液全量换液1次。每周半量换液两次(饲养液)，培养第5天加入5-氟尿嘧啶(0.061 mmol/L)抑制神经胶质细胞生长。海马神经元体外培养第6、8、10和12天在放大300倍视野下[目镜(10)×物镜(30)]进行形态观察及细胞计数，每皿计数50个视野，每天2皿(计数不包括神经胶质细胞，神经元以胞体在视野内为标准)，计算平均每个视野的神经元数。各组海马神经元形态观察时间均为15天以上。②海马神经元电生理记录：在相差显微镜下找到生长良好的海马神经元细胞，采用膜片钳(patch clamp)技术，在AXOPATCH-1D膜片钳放大器上，用全细胞记录方式(whole-cell recording)测定海马神经元最大Ca2+电流，比较Ca2+电流幅度。实验中电极电阻为4～6 MΩ，用微电极拉制仪制备。用TTX(1 μmol/L)阻断钠电流。实验结果显示于Tektronix 5111A记忆示波器上。电压钳制信号的产生及膜电流的接收、贮存均在IBM-386兼容机中进行，控制程序为pClamp 5.5.1。各剂量组分别于培养后6、8、10和12天记录海马神经元Ca2+电流，每天2皿细胞，每皿测定2～3个细胞。
, http://www.100md.com
4.资料分析：用STATA和SAS软件对实验数据进行检验。采用t检验、方差分析及χ2检验进行数据处理。用WORD及EXCELL进行图表分析。
结果
完成本项研究分为3部分(表1，2)：第一部分实验(1992～1994年)共用C57BL/6J孕鼠63只，获仔鼠399只，进行22项生物学指标的剂量-响应关系及剂量阈值的研究。为了进一步验证有关生物学指标的剂量阈值，开展了第二部分实验(1995～1999年)，同样选用C57BL/6J孕鼠49只，获仔鼠234只，研究了18项生物学指标及剂量阈值的结果。第三部分实验(1995～1999年)目的为了验证在相同氚活度照射下，小鼠与大鼠生物学指标及剂量阈值是否存在差异。因此，采用Wistar孕鼠12只，获仔鼠86只，验证了16项生物学指标剂量-响应关系及剂量阈值。
表1 出生前受氚水照射动物不同生物学指标影响的剂量阈值
, http://www.100md.com
生物学指标
剂量阈值(Gy)
生物学指标
剂量阈值(Gy)
第一部分实验(1992～1994年)
痛觉反应潜伏期
0.036
体重
0.036
运动协调功能和活动度
生理标志
转体
, 百拇医药
0.036
张耳
0.036
足展开
0.036
开眼
0.072
连续通道活动
0.072
出牙
0.036
学习记忆
新生反射
, 百拇医药
Y迷宫刺激单向回避反射
0.036
平面翻正
0.072
条件反射达标率
0.072
抓握反射
0.036
脑发育和脑病理
感觉功能
脑体比
视觉定位
0.072
, http://www.100md.com
雌性
0.072
趋母性试验
0.036
雄性
0.216
行为测试
脑病理
旷场试验
0.072
海马锥体细胞数(21天龄)
孔板探究试验
0.036
, http://www.100md.com
CA1
0.036
学习记忆
CA2
0.216
电击回避学习
0.072
CA3
0.036
电击回避记忆
0.072
CA4
0.216
, 百拇医药
食物迷宫
0.036
水迷宫
0.036
第三部分实验(1995～1999年)
脑发育和脑病理
生理标志
全脑重
0.072
张耳
0.268
脑病理
开眼
, 百拇医药
0.274
脑皮质厚度
出牙
0.092
大脑
0.216
新生反射
小脑
0.216
平面翻正
0.091
脑细胞数
负趋地性
, 百拇医药
0.091
大脑
0.036
感觉功能
小脑
0.036
听觉惊愕
0.092
大脑锥体细胞树突
0.036
运动协调功能和活动度
脑神经肽含量
前肢悬挂
, 百拇医药
0.274
生长抑素(SOM)
0.072
连续通道活度
0.046
精氨酸加压素(AVP)
0.216
学习记忆功能
Y迷宫刺激回避反射
0.046
第二部分实验(1995～1999年)
条件反射达标率
, http://www.100md.com
0.092
体重
0.035
脑发育和脑病理
生理标志
脑重(52天龄)
0.274
张耳
0.036
海马锥体细胞计数
开眼
0.072
CA1
, http://www.100md.com
0.046
新生反射
CA3
0.092
断崖回避
0.072
体外培养海马神经元
空中翻正
0.072
生长发育不良
0.085
感觉功能
细胞计数
, 百拇医药
0.085
听觉惊愕
0.036
电生理记录(Ca2+电流)
0.254
注：第一、二部分实验所用实验动物为C57BL/6J小鼠；第三部分实验用Wistar大鼠;剂量阈值为与对照组相比差异出现显著性的最低剂量
表2 低水平氚水剂量阈值分布
剂量阈值 (Gy)
生物学指标数(个)
百分比(%)
第一部分实验
, 百拇医药
0.030～0.050
11
50.0
0.051～0.092
8
36.4
0.093～0.300
3
13.6
合计
22
100.0
第二部分实验
, 百拇医药
0.030～0.050
9
50.0
0.051～0.092
6
33.3
0.093～0.300
3
16.7
合计
18
100.0
第三部分实验
, http://www.100md.com
0.030～0.050
3
18.8
0.051～0.092
8
50.0
0.093～0.300
5
31.2
合计
16
100.0
从上述的研究结果概述4点初步的印象：①发育中脑的不同部位辐射敏感性差异相当大，其氚剂量阈值也不同，如：表1中Wistar仔鼠脑海马锥体细胞数CA1区间剂量为0.046 Gy，CA3区为0.092 Gy。②不同种类的哺乳动物虽然在同一剂量范围内照射，剂量阈值分布也不同，如：表2中C57BL/6J仔鼠50%的生物学指标的剂量阈值在0.03～0.05 Gy,Wistar大鼠仅有18.8%的剂量阈值分布在0.03～0.05 Gy。③结合作者以前的研究结果[4，6-12]证明了神经行为的改变不是独立存在的，与脑细胞学、脑神经肽含量及Ca2+电流改变等有密切关系。④56项生物学指标获得的剂量阈值分布为：41.1%的生物学指标分布在0.030～0.05 Gy范围内，39.3%分布在0.051～0.092 Gy范围内，也就是说80.4%检测生物学指标的剂量阈值分布在0.092 Gy以下，仅有19.6%的指标是在0.093～0.300 Gy(表3)。
, http://www.100md.com
表3 出生前氚水照射对大、小鼠发育中中枢神经系统影响的56项生物学指标剂量阈值的分布
氚阈剂量(Gy)
生物学指标数(个)
分布(%)
0.030～0.050
23
41.1
0.051～0.092
22
39.3
0.093～0.300
, http://www.100md.com
11
19.6
讨论
人类出生前受照射后脑辐射损伤的危险度定量估计值所依据的人类资料主要来自日本广岛和长崎原子弹爆炸时宫内受照射幸存者的调查。资料显示：妊娠8～15周胎儿脑发育比受精后8周内及妊娠16～25周对辐射更为敏感。ICRP和UNSCEAR认为妊娠16～25周受照射的损伤效应是存在剂量阈值的，其阈值为0.64～0.70 Gy，其95% CI下界为0.21 Gy；而妊娠8～15周受照射的脑发育虽然对辐射相当敏感，但是否存在阈值，还不能凭已有的流行病学资料及实验资料解决。
随着研究的深入，国内外许多研究者对此给以极大关注并陆续报道了许多宝贵的实验资料。就外照射资料而言，Jensh等[14，15]用0.2 Gy及以上剂量X射线照射Wistar大鼠，通过神经行为等生物学指标观察，认为所采用的参数在0.2或0.2 Gy以上时都有阈值。Muller等关于辐射致畸阈值的研究结果提示，单细胞尚未发现阈值的存在，而对32到64细胞阶段的胚胎则存在1 Gy的阈剂量[16]。
, http://www.100md.com
近10年来，作者选用C57BL/6J小鼠及Wistar大鼠两种哺乳类动物在相等活度的低水平氚水照射下，从整体、组织、细胞及Ca2+电流等56项生物学指标的剂量-响应关系及与对照组相比出现显著性差异的最低剂量。从本实验获得的阈剂量主要在0.030～0.092 Gy，较多数实验报道为低。这可能由于不同的实验动物对辐射所具有的敏感性存在差异；加之本实验以氚水为辐射源，根据以往研究的结果，氚在低剂量下具有较大的RBE值的缘故。鉴于中枢神经系统调控机体的特殊性，其本身结构的复杂性及不同测试指标存在着辐射敏感性差异，有关出生前氚水照射对发育中的中枢神经系统影响及其阈剂量研究对定量估计辐射危险度意义重大，利用多种实验动物模型，加强氚致脑细胞分子学及基因水平研究，将为探讨损伤机理及积累低水平氚剂量阈值提供理想的研究手段。
本课题受国家自然科学基金(项目号：39170274)和卫生部医学研究基金(项目号：94-1-096及96-2-050)资助
参考文献
, http://www.100md.com
1 国际放射防护委员会.电离辐射的危险度.杜铭海译.闫效珊校.北京：原子能出版社，1994. 201-210.
2 联合国原子辐射效应科学委员会(UNSCEAR).电离辐射源与效应.UNSCEAR 1993年向联合国大会提交的报告和科学附件，北京：原子能出版社，1993.841-843.
3 张伟，吕慧敏，周湘艳.低水平氚水内照射的剂量估算.中华放射医学与防护杂志，1997，17：255-257.
4 高卫民，周湘艳.出生前氚水照射对仔代大鼠生长发育及神经行为的影响.中华放射医学与防护杂志，1998，18：381-385.
5 杨志远，郭月凤.出生前氚水照射致大鼠脑细胞缺失的剂量反应关系研究.辐射防护，1990，10：255-258.
6 王冰，周湘艳.小剂量氚水宫内辐射对出生后仔鼠行为、学习及记忆能力的影响.辐射研究与辐射工艺学报，1993，11：184-188.
, http://www.100md.com
7 Bing Wang,Xiang-Yan Zhou.Effects of prenatal exposure to low-dose β radiation from tritiated water on the neurobehavior of mice.J Radiat Res,1995,36:103-111.
8 高卫民，周湘艳.出生前氚水照射对仔代小鼠生长发育及神经行为的影响.辐射防护，1998，18：280-289.
9 高卫民，周湘艳.出生前氚水照射对仔鼠海马神经元电生理及神经行为的影响.辐射防护，1997，17：363-372.
10 王冰，周湘艳.低剂量氚宫内照射对仔鼠脑神经元发育的影响.中华放射医学与防护杂志，1994，14：79-82.
11 高卫民，周湘艳.出生前氚水照射对仔代小鼠学习记忆行为的影响及机制探讨.中国毒理学通讯，1998，1：5-8.
, http://www.100md.com
12 王冰，周湘艳，王玉起，等.小剂量氚水宫内照射对出生后仔鼠脑组织生长抑素、精氨酸加压素含量的影响.中华放射医学与防护杂志，1993，13：311-314.
13 何湘平，刘青松，刘传缋.适于电生理学研究的新生大鼠中枢神经元培养.中国应用生理学杂志，1994，10：179-182.
14 Jensh RP,Brent RL.Effects of 0.6 Gy prenatal irradiation on postnatal neurophysiologic development in the Wistar rat.Proc Soc Exp Biol Med,1986,181:611-619.
15 Jensh RP,Brent RL.The effect of low-level prenatal irradiation on postnatal development in the Wistar rat.Proc Soc Exp Biol Med,1987,184:256-263.
16 Muller WU,Streffer C,Pampfer S.The question of threshold doses for radiation damage:malformations induced by radiation exposure of unicellular or multicellular preimplantation stages of the mouse.Radiat Environ Biophys,1994,33:63.
(收稿:1999-03-22 修回:1999-05-04), http://www.100md.com