PCR快速筛选质粒cDNA文库方法的建立
作者：胡迎春 张开泰 吴德昌 李刚 项晓琼
单位：100850，北京放射医学研究所
关键词：PCR；文库筛选
中华放射医学与防护杂志/990506 【摘要】 目的 建立一种快速、有效地筛选质粒cDNA文库的方法—PCR法。方法 将质粒cDNA文库重组子进行矩阵排列，然后用特异引物进行PCR逐级筛选以获得目的克隆。结果 经两轮筛选(约1周的时间)获得4株阳性克隆。结论 PCR矩阵筛库法不仅适用于常规cDNA克隆的筛选，还适用于筛选较短的cDNA片段，比常规的筛库方法更为灵敏、特异、高效。
A rapid method for screening arrayed plasmid cDNA library by PCR
HU Yingchun, ZHANG Kaitai,WU Dechang,et al.
, http://www.100md.com
Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850,China
【Abstract】 Objective To develop a PCR-based method for rapid and effective screening of arrayed plasmid cDNA library. Methods The plasmid cDNA library was arrayed and screened by PCR with a particular set of primers. Results Four positive clones were obtained through about one week. Conclusion This method can be applied to screening not only normal cDNA clones,but also cDNA clones-containing small size fragments.This method offers significant advantages over traditional screening method in terms of sensitivity, specificity and efficiency.
, 百拇医药
【Key words】 Polymerase chain reaction cDNA library screening
分离编码特殊基因或mRNA序列的重组DNA克隆，常用的方法是筛选重组DNA文库。一个重组DNA文库是由大量的重组DNA克隆组成的，每一个重组DNA克隆都包含有一个不同的外源DNA片段[1]。对于那些低丰度克隆而言，尽管文库里有成千上万的克隆，但目的克隆可能只有少数的几个。因此，必须设计出一个灵敏，且特异性高的筛选目的克隆的方法。我们在通过差异显示方法克隆出大鼠基因片段ZA73的基础之上，拟采用PCR矩阵筛库的方法，从人睾丸质粒cDNA文库中筛选出ZA73的人同源全长基因克隆。
材料和方法
1.材料
人睾丸质粒cDNA文库，该文库滴度为109 cfu/ml，空载体分子量为4 379碱基对(bp)，插入片段平均长度为1 448 bp，由美国加州大学Howard Huges研究院吴虹博士馈赠；Taq DNA聚合酶购自Promega公司；质粒提取试剂盒购自QiAGen公司；限制性内切酶ECoRⅠ及Bam H Ⅰ购自Promega公司，PCR Marker购自华美生物工程公司；ECoR Ⅰ-Hind Ⅲ Marker购自Promega公司。
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2.PCR引物设计
引物设计由Internet网上Primer 3软件辅助完成。
内侧引物：5’-引物：5’-GCAGAAATGAAATCCCAGGT-3’
3’-引物：5’-TCAAGACCAAGTC-
CAGAAGACA-3’
外侧引物：5’-引物：5’-CCCTTCTATGCTGCT-
TCCA-3’
3’-引物：5’-GTGCAGTTCGCTAC-
TACTGAGG-3’
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内侧引物的扩增产物为182bp，外侧引物的扩增产物为330bp。
3.PCR体系
在100 μl的PCR体系中，含引物各0.2 μmol/L，10×PCR 小牛血清10 μl，2.4 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTP,2.5 U Taq酶。
PCR条件为：94℃ 1分钟，加2.5 U Taq酶，94℃，30秒→55℃，30秒→72℃，1分钟循环，30次→16℃，10分钟→4℃。反应完毕后，取20 μl进行2%琼脂糖凝胶电泳。
4.PCR矩阵筛选cDNA文库
(1)cDNA文库中目的基因的确定，从cDNA文库中取出4 μl细菌悬液，99℃加热5分钟，冰浴2分钟后做为模板，分别以两对引物进行PCR，2%琼脂糖凝胶电泳。
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(2)矩阵的排列：从cDNA文库中取出1 μl细菌悬液，以不同稀释度在含氨苄青霉素的LB平板上涂板，以确定该文库的滴度。从文库中取约含106重组子的细菌悬液，稀释于含氨苄青霉素的LB培养基中，使其终浓度约为120个重组子/100 μl培养基。在96孔细胞培养板(各板留出第12列和第H行，供次日排列矩阵用)的77个孔中各加入100 μl含有文库的培养基，共铺培养板108块。培养板标记后于30℃孵育过夜，次日按每行(列)从各孔分别取10 μl细菌悬液于对应列或行的空孔中形成矩阵，混合后分别从第12列和第H行各孔取10 μl细菌悬液于培养板的H12孔，这样文库在108块96孔板上被排列成108个小矩阵，其中每块板H12孔包含全板重组子(图1)。
图1 cDNA文库的矩阵排列
(3)目的克隆的筛选：从各板H12孔取3 μl细菌悬液，99℃加热5分钟，冰浴2分钟后作为模板，以外侧引物进行PCR，2%琼脂糖凝胶电泳检查。取出有特异扩增区带对应的培养板，分别从第12列和第H行的各孔取样重复进行PCR，列行阳性交叉即为阳性克隆所在孔(图2)。
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图2 阳性克隆孔的确定
○含有120个重组子
含有每行(列)的重组子
●含有全板重组子
阳性克隆所在孔
(4)目的基因单克隆的获得：从阳性克隆所在孔中取出3 μl细菌悬液，梯度稀释后在LB平皿上均匀涂板，30℃孵育过夜。次日，挑出单个菌落，按上述筛选的方法进行矩阵排列，重复进行PCR，最终获得含有目的基因的单克隆。
结果
1.cDNA文库中目的基因的确定
琼脂糖凝胶电泳显示，两对引物均有扩增区带出现，经与PCR Marker相对比，内侧引物扩增产物长约180 bp，外侧引物扩增产物长约330 bp，且无非特异条带出现(图3)。
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图3 cDNA文库中目的基因的确定
A：内侧引物扩增 B：外侧引物扩增
2.阳性克隆的获得
以PCR进行逐级筛选，在108块板中筛出第5板为阳性板，进而对此板第H行和第12列的各孔进行筛选，结果确定G行孔，2列孔为阳性。阳性行、列交叉G行的第2孔(G2)为阳性克隆所在孔。阳性克隆所在孔低密度涂板中，获得4株阳性单克隆：B9、B10、F9、F10(图4)。
图4 阳性克隆孔的确定
A-G：第12列各孔1-10：第H行各孔
3.阳性单克隆的确定
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用限制性内切酶ECoR Ⅰ及Bam H Ⅰ对阳性克隆F10的质粒分别进行单酶切及双酶切反应，酶切电泳图谱显示，ECoR Ⅰ 单酶切出现两条带，长度约为995 bp和5 100 bp，Bam HⅠ单酶出现一条带，长度约为6 000 bp，ECoR Ⅰ及Bam H Ⅰ双酶切出现3条带，长度约为830 bp、950 bp、4 300 bp。这说明，除了载体中存在一个ECoR Ⅰ的酶切位点之外，质粒内部还存在一个ECoR Ⅰ酶切位点(图5)。
图5 目的基因酶切鉴定图谱
A：PCR Marker B:F10质粒 C：ECoR Ⅰ单酶切 D：Bam H Ⅰ单酶切 E：ECoR Ⅰ及Bam H Ⅰ双酶切 F：ECoR Ⅰ-Hind Ⅲ Marker
讨论
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目前，大多数克隆‘计划的目的在于分离对应于稀有mRNA的cDNA，因此必须筛选数目巨大的重组克隆[2]。筛选文库与快速制定一个特异克隆中是否包含有所需核酸序列的进程有关。这种分析首先用于鉴定文库中的重组DNA克隆，然后纯化该克隆[1]。目前，常用筛选cDNA文库的方法有3种：①核酸杂交、转膜；②对特定抗原进行免疫学检测；③或者通过mRNA的杂交体选择与翻译，或者通过产生有生物学活性的分子进行同胞选择[2]。这些方法都有其共同的缺点，即费时、费力、又费钱。因此，寻找一种快速、有效的筛选cDNA文库的方法成为一个非常重要的课题[3]。
本实验建立了一种快速筛选质粒cDNA文库的方法—PCR矩阵筛库法，我们把这一方法运用到筛选人睾丸质粒cDNA文库中。我们以差示片段ZA73设计引物，将文库如图1所示进行矩阵排列，经两轮筛选(约1周的时间)，成功地获得4株阳性克隆。实验结果表明，PCR法比传统的筛库方法更为灵敏、特异、高效。
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1.灵敏：以PCR为基础来筛选cDNA文库的方法比依赖杂交筛库的方法更为灵敏[4]，它将大cDNA文库按照一种矩阵排列的方法分成若干个小的cDNA文库，然后在这些库中检查目的基因，当鉴定出阳性库后再不断将其分成越来越小的库，每次重复检查直至分离到目的cDNA克隆。由于每个小库的复杂度降低，因而提高了筛库的灵敏性，实验证明，PCR法比常规的筛库方法更能筛选出低丰度表达的克隆。
2.特异：PCR法的特异性是由其引物的特异性所决定的，引物的特异性越高，就越有利于文库的筛选。我们可以利用计算机进行引物的待测分析，这样有助于避免存在具有明显成袢(loop)等二级结构的序列。另外，也要防止出现引物的自身互补，尤其在3’末端不应存在有互补发夹结构[5]。本实验中，我们采用Internet网上的Primer 3软件辅助设计出两对引物，用这两对引物来鉴定文库中是否含有目的克隆，结果如图3所示，两对引物均有扩增条带出现，且未见非特异条带，表明引物具有较高的特异性。
, 百拇医药
3.高效：因为PCR方法本身具有较高的灵敏性和特异性，筛库时可根据扩增产物的大小，特异性地加以判定，清楚明了。同时，用PCR法筛库可以随时验证实验结果，在PCR的过程中，每一个步骤都加上阳性对照更有利于及时找出实验出现问题的原因，完全避免了工作的盲目性，从而大大提高了工作效率。本实验从对文库进行扩增到筛选出候选全长克隆仅用了一周的时间。虽然PCR法的文库矩阵排列较为繁琐，但排列完毕的文库还可反复用于多种基因克隆的筛选，实际操作也仅需一周的时间即可完成。
目前，用于寻找新基因的方法有差异显示、SAGE等，这些方法找出的新基因片段都较短，用传统的筛库方法很难钓到其全长基因，而本实验建立的PCR法就完全能够以这些较短片段为探针，快速、有效地从质粒cDNA文库中筛选出全长克隆。
本课题受国家自然科学基金资助(项目号：39600124)
参考文献
, 百拇医药
1 Ausubel FM,Brent R,Kingston RE,et al.Current protocols in molecular biology.New York:John Wiley & Sons,1997,6:3-5.
2 Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning,a laboratory manual.2th ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,428-431.
3 Munroe DJ,Loebbert R,Bric E,et al.Systematic screening of an arrayed cDNA library by PCR.Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:2209-2213.
4 Green ED,Olson MV.Systematic screening of yeast artificial-chromosome libraries by use of the polymerase chain reaction.Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:1213-1217.
5 鄂征.组织培养和分子细胞学技术.北京：北京出版社，1995.376-377.
(收稿:1998-10-08 修回：1999-02-25), http://www.100md.com
单位：100850，北京放射医学研究所
关键词：PCR；文库筛选
中华放射医学与防护杂志/990506 【摘要】 目的 建立一种快速、有效地筛选质粒cDNA文库的方法—PCR法。方法 将质粒cDNA文库重组子进行矩阵排列，然后用特异引物进行PCR逐级筛选以获得目的克隆。结果 经两轮筛选(约1周的时间)获得4株阳性克隆。结论 PCR矩阵筛库法不仅适用于常规cDNA克隆的筛选，还适用于筛选较短的cDNA片段，比常规的筛库方法更为灵敏、特异、高效。
A rapid method for screening arrayed plasmid cDNA library by PCR
HU Yingchun, ZHANG Kaitai,WU Dechang,et al.
, http://www.100md.com
Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850,China
【Abstract】 Objective To develop a PCR-based method for rapid and effective screening of arrayed plasmid cDNA library. Methods The plasmid cDNA library was arrayed and screened by PCR with a particular set of primers. Results Four positive clones were obtained through about one week. Conclusion This method can be applied to screening not only normal cDNA clones,but also cDNA clones-containing small size fragments.This method offers significant advantages over traditional screening method in terms of sensitivity, specificity and efficiency.
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【Key words】 Polymerase chain reaction cDNA library screening
分离编码特殊基因或mRNA序列的重组DNA克隆，常用的方法是筛选重组DNA文库。一个重组DNA文库是由大量的重组DNA克隆组成的，每一个重组DNA克隆都包含有一个不同的外源DNA片段[1]。对于那些低丰度克隆而言，尽管文库里有成千上万的克隆，但目的克隆可能只有少数的几个。因此，必须设计出一个灵敏，且特异性高的筛选目的克隆的方法。我们在通过差异显示方法克隆出大鼠基因片段ZA73的基础之上，拟采用PCR矩阵筛库的方法，从人睾丸质粒cDNA文库中筛选出ZA73的人同源全长基因克隆。
材料和方法
1.材料
人睾丸质粒cDNA文库，该文库滴度为109 cfu/ml，空载体分子量为4 379碱基对(bp)，插入片段平均长度为1 448 bp，由美国加州大学Howard Huges研究院吴虹博士馈赠；Taq DNA聚合酶购自Promega公司；质粒提取试剂盒购自QiAGen公司；限制性内切酶ECoRⅠ及Bam H Ⅰ购自Promega公司，PCR Marker购自华美生物工程公司；ECoR Ⅰ-Hind Ⅲ Marker购自Promega公司。
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2.PCR引物设计
引物设计由Internet网上Primer 3软件辅助完成。
内侧引物：5’-引物：5’-GCAGAAATGAAATCCCAGGT-3’
3’-引物：5’-TCAAGACCAAGTC-
CAGAAGACA-3’
外侧引物：5’-引物：5’-CCCTTCTATGCTGCT-
TCCA-3’
3’-引物：5’-GTGCAGTTCGCTAC-
TACTGAGG-3’
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内侧引物的扩增产物为182bp，外侧引物的扩增产物为330bp。
3.PCR体系
在100 μl的PCR体系中，含引物各0.2 μmol/L，10×PCR 小牛血清10 μl，2.4 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTP,2.5 U Taq酶。
PCR条件为：94℃ 1分钟，加2.5 U Taq酶，94℃，30秒→55℃，30秒→72℃，1分钟循环，30次→16℃，10分钟→4℃。反应完毕后，取20 μl进行2%琼脂糖凝胶电泳。
4.PCR矩阵筛选cDNA文库
(1)cDNA文库中目的基因的确定，从cDNA文库中取出4 μl细菌悬液，99℃加热5分钟，冰浴2分钟后做为模板，分别以两对引物进行PCR，2%琼脂糖凝胶电泳。
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(2)矩阵的排列：从cDNA文库中取出1 μl细菌悬液，以不同稀释度在含氨苄青霉素的LB平板上涂板，以确定该文库的滴度。从文库中取约含106重组子的细菌悬液，稀释于含氨苄青霉素的LB培养基中，使其终浓度约为120个重组子/100 μl培养基。在96孔细胞培养板(各板留出第12列和第H行，供次日排列矩阵用)的77个孔中各加入100 μl含有文库的培养基，共铺培养板108块。培养板标记后于30℃孵育过夜，次日按每行(列)从各孔分别取10 μl细菌悬液于对应列或行的空孔中形成矩阵，混合后分别从第12列和第H行各孔取10 μl细菌悬液于培养板的H12孔，这样文库在108块96孔板上被排列成108个小矩阵，其中每块板H12孔包含全板重组子(图1)。
图1 cDNA文库的矩阵排列
(3)目的克隆的筛选：从各板H12孔取3 μl细菌悬液，99℃加热5分钟，冰浴2分钟后作为模板，以外侧引物进行PCR，2%琼脂糖凝胶电泳检查。取出有特异扩增区带对应的培养板，分别从第12列和第H行的各孔取样重复进行PCR，列行阳性交叉即为阳性克隆所在孔(图2)。
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图2 阳性克隆孔的确定
○含有120个重组子
含有每行(列)的重组子●含有全板重组子
阳性克隆所在孔(4)目的基因单克隆的获得：从阳性克隆所在孔中取出3 μl细菌悬液，梯度稀释后在LB平皿上均匀涂板，30℃孵育过夜。次日，挑出单个菌落，按上述筛选的方法进行矩阵排列，重复进行PCR，最终获得含有目的基因的单克隆。
结果
1.cDNA文库中目的基因的确定
琼脂糖凝胶电泳显示，两对引物均有扩增区带出现，经与PCR Marker相对比，内侧引物扩增产物长约180 bp，外侧引物扩增产物长约330 bp，且无非特异条带出现(图3)。
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图3 cDNA文库中目的基因的确定
A：内侧引物扩增 B：外侧引物扩增
2.阳性克隆的获得
以PCR进行逐级筛选，在108块板中筛出第5板为阳性板，进而对此板第H行和第12列的各孔进行筛选，结果确定G行孔，2列孔为阳性。阳性行、列交叉G行的第2孔(G2)为阳性克隆所在孔。阳性克隆所在孔低密度涂板中，获得4株阳性单克隆：B9、B10、F9、F10(图4)。
图4 阳性克隆孔的确定
A-G：第12列各孔1-10：第H行各孔
3.阳性单克隆的确定
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用限制性内切酶ECoR Ⅰ及Bam H Ⅰ对阳性克隆F10的质粒分别进行单酶切及双酶切反应，酶切电泳图谱显示，ECoR Ⅰ 单酶切出现两条带，长度约为995 bp和5 100 bp，Bam HⅠ单酶出现一条带，长度约为6 000 bp，ECoR Ⅰ及Bam H Ⅰ双酶切出现3条带，长度约为830 bp、950 bp、4 300 bp。这说明，除了载体中存在一个ECoR Ⅰ的酶切位点之外，质粒内部还存在一个ECoR Ⅰ酶切位点(图5)。
图5 目的基因酶切鉴定图谱
A：PCR Marker B:F10质粒 C：ECoR Ⅰ单酶切 D：Bam H Ⅰ单酶切 E：ECoR Ⅰ及Bam H Ⅰ双酶切 F：ECoR Ⅰ-Hind Ⅲ Marker
讨论
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目前，大多数克隆‘计划的目的在于分离对应于稀有mRNA的cDNA，因此必须筛选数目巨大的重组克隆[2]。筛选文库与快速制定一个特异克隆中是否包含有所需核酸序列的进程有关。这种分析首先用于鉴定文库中的重组DNA克隆，然后纯化该克隆[1]。目前，常用筛选cDNA文库的方法有3种：①核酸杂交、转膜；②对特定抗原进行免疫学检测；③或者通过mRNA的杂交体选择与翻译，或者通过产生有生物学活性的分子进行同胞选择[2]。这些方法都有其共同的缺点，即费时、费力、又费钱。因此，寻找一种快速、有效的筛选cDNA文库的方法成为一个非常重要的课题[3]。
本实验建立了一种快速筛选质粒cDNA文库的方法—PCR矩阵筛库法，我们把这一方法运用到筛选人睾丸质粒cDNA文库中。我们以差示片段ZA73设计引物，将文库如图1所示进行矩阵排列，经两轮筛选(约1周的时间)，成功地获得4株阳性克隆。实验结果表明，PCR法比传统的筛库方法更为灵敏、特异、高效。
, http://www.100md.com
1.灵敏：以PCR为基础来筛选cDNA文库的方法比依赖杂交筛库的方法更为灵敏[4]，它将大cDNA文库按照一种矩阵排列的方法分成若干个小的cDNA文库，然后在这些库中检查目的基因，当鉴定出阳性库后再不断将其分成越来越小的库，每次重复检查直至分离到目的cDNA克隆。由于每个小库的复杂度降低，因而提高了筛库的灵敏性，实验证明，PCR法比常规的筛库方法更能筛选出低丰度表达的克隆。
2.特异：PCR法的特异性是由其引物的特异性所决定的，引物的特异性越高，就越有利于文库的筛选。我们可以利用计算机进行引物的待测分析，这样有助于避免存在具有明显成袢(loop)等二级结构的序列。另外，也要防止出现引物的自身互补，尤其在3’末端不应存在有互补发夹结构[5]。本实验中，我们采用Internet网上的Primer 3软件辅助设计出两对引物，用这两对引物来鉴定文库中是否含有目的克隆，结果如图3所示，两对引物均有扩增条带出现，且未见非特异条带，表明引物具有较高的特异性。
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3.高效：因为PCR方法本身具有较高的灵敏性和特异性，筛库时可根据扩增产物的大小，特异性地加以判定，清楚明了。同时，用PCR法筛库可以随时验证实验结果，在PCR的过程中，每一个步骤都加上阳性对照更有利于及时找出实验出现问题的原因，完全避免了工作的盲目性，从而大大提高了工作效率。本实验从对文库进行扩增到筛选出候选全长克隆仅用了一周的时间。虽然PCR法的文库矩阵排列较为繁琐，但排列完毕的文库还可反复用于多种基因克隆的筛选，实际操作也仅需一周的时间即可完成。
目前，用于寻找新基因的方法有差异显示、SAGE等，这些方法找出的新基因片段都较短，用传统的筛库方法很难钓到其全长基因，而本实验建立的PCR法就完全能够以这些较短片段为探针，快速、有效地从质粒cDNA文库中筛选出全长克隆。
本课题受国家自然科学基金资助(项目号：39600124)
参考文献
, 百拇医药
1 Ausubel FM,Brent R,Kingston RE,et al.Current protocols in molecular biology.New York:John Wiley & Sons,1997,6:3-5.
2 Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning,a laboratory manual.2th ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,428-431.
3 Munroe DJ,Loebbert R,Bric E,et al.Systematic screening of an arrayed cDNA library by PCR.Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:2209-2213.
4 Green ED,Olson MV.Systematic screening of yeast artificial-chromosome libraries by use of the polymerase chain reaction.Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:1213-1217.
5 鄂征.组织培养和分子细胞学技术.北京：北京出版社，1995.376-377.
(收稿:1998-10-08 修回：1999-02-25), http://www.100md.com