DNA凝胶电泳和放射自显影研究153Sm诱发骨肉瘤细胞凋亡
作者：朱寿彭 肖东 韩晓枫
单位：215007 江苏，苏州医学院放射医学系
关键词：DNA凝胶电泳；微观放射自显影；153Sm-EDTMP；骨肉瘤细胞；凋亡
中华放射医学与防护杂志/990505 【摘要】 目的 研究受153Sm-EDTMP内照射治疗时诱发骨肉瘤细胞凋亡的DNA损伤特征，以及153Sm核素在瘤细胞中的行径特性。方法 观察了153Sm-EDTMP内照射不同时间，诱发骨肉瘤细胞凋亡的DNA凝胶电泳和微观放射自显影的示踪动态。结果 研究发现，在153Sm-EDTMP内照射作用下，骨肉瘤细胞的DNA呈现出在核小体间断裂的阶梯状条带形成的凋亡特征，放射性核素153Sm可迅速透过瘤细胞膜，也可被瘤细胞吞噬，呈亲膜性积聚和膜包裹着的凋亡小体呈现。结论 153Sm-EDTMP内照射治疗时，可诱发骨肉瘤细胞凋亡发生，其诱发凋亡的程度随153Sm内照射作用时间延长而增升。
, 百拇医药
DNA gel electrophoretic and microautoradiographic studies on apoptosis in bone tumor cells after exposure to 153Sm-EDTMP
ZHU Shoupeng,XIAO Dong,HAN Xiaofeng.
Suzhou Medical College,Suzhou 215007,China
【Abstract】 Objective To study the characteristics of injury in apoptotic bone tumor cells and behavior of radionuclide 153Sm in tumor cells. Methods DNA gel electrophoresis and microautoradiographic tracing of apoptotic bone tumor cells at different intervals after 153Sm-EDTMP internal irradiation. Results Bone tumor cells internally irradiated with 153Sm-EDTMP displayed characteristics of DNA ladder formation in apoptotic cells.153Sm could permeate through tumor cell membrane and be phagocytized by the tumor cells,showing membrane-seeking and membrane-bounded apoptotic bodies condensation. Conclusion Progression of apoptosis in bone tumor cells induced by 153Sm-EDTMP is dependent on the time elapse of 153Sm internal irradiation.
, 百拇医药
【Key words】 DNA gel electrophoresis Microautoradiography 153Sm-EDTMP Internal irradiation Bone tumor cells Apoptosis
由于放射性核素153Sm的辐射特性而适于在临床上用作内照射治疗剂[1]。目前153Sm-EDTMP(153Sm-乙二胺四甲撑膦酸)用于治疗扩散性骨转移瘤患者和解除疼痛是有效的[2，3]。但有关153Sm放射性核素对骨转移瘤治疗的生物医学特性机理，有待揭示。迄今国内外文献中均未见报道。我们曾运用电镜形态和DNA链断裂探讨了153Sm内照射诱发骨肉瘤细胞凋亡[4]，而在本研究中，设计用DNA凝胶电泳和微观放射自显影来观察153Sm-EDTMP内照射治疗时诱发骨肉瘤细胞的DNA损伤特点，以及该稀土族核素153Sm在瘤细胞中的行径特性，研究其诱发骨肉瘤细胞凋亡的过程。
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材料和方法
1.细胞培养及辐照细胞
实验用我院细胞免疫研究中心传代培养的骨肉瘤细胞株HOS-8603细胞， 用RPMI 1640(GIBCO)全培养液中维持培养。临实验时，将贴壁培养细胞放置到5%CO2培养器内作37℃培养。然后取对数生长期的骨肉瘤细胞，先用胰蛋白酶：EDTA(0.05∶0.02%)液消化，随即用Hanks液洗涤去除胰蛋白酶后，用全培养液调至实验所需细胞浓度2×106细胞/ml备用。
实验用153Sm-EDTMP为放射纯和化学纯的注射液。先取上述浓度的骨肉瘤细胞1 ml，放入无菌24孔培养板的培养孔内，然后在每一实验孔中另加入1 ml用RPMI 1640全培养液稀释的153Sm工作液3.7×102kBq/ml,而对照组每孔中则加入1 ml的RPMI 1640全培养液，随后将24孔培养板放到5%CO2培养器内37℃培养，经3、6、9、12和24小时分别收集各观察点的骨肉瘤细胞标本，用于进行细胞凋亡研究。
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2.DNA的提取和琼脂糖凝胶电泳
分别收集2×106细胞/ml的实验组和对照组细胞，200 r.5min-1离心洗涤后，细胞在Eppendorf离心管内悬浮于1 ml内含10 mmol Tris.HCl(pH8.0)、1 mmol EDTA,10 mmol NaCl,1% SDS的DNA抽提缓冲液中，再补充20 μg RNAase及100 μg蛋白酶K，用玻棒搅拌至粘稠状，置37℃温箱中12小时，待冷却至室温后，加入等容积饱和酚溶液，转动离心管混匀两相，12 000 r.min-1离心，吸出上层粘稠水相，移至另一Eppendorf离心管内，再加等体积饱和酚溶液抽提一次，然后用1∶1的氯仿酚溶液抽提后，将上层水相移入另一管内，加入0.3 mmol/L乙酸钠- 乙醇溶液沉淀DNA，加入二倍容积冰冻无水乙醇置冰格中30分钟，取出在4 ℃、12 000 r.min-1离心10分钟收取DNA，弃去无水乙醇后用70%乙醇混匀漂洗，开盖室温放置15分钟挥发乙醇，加入含1 mmol EDTA、10 mmol Tris.HCl(pH7.8)TE缓冲液，使DNA溶解，放置4℃冰箱保存备用。
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取10 μl提取的DNA样品(含1 μg DNA量)与0.25%溴酚蓝和40%蔗糖溶液混匀后，加入到琼脂糖凝胶样品槽内，在由1 mmol/L EDTA(pH8.0)和45 mmol/L Tris-硼酸缓冲液配制的内含0.5 μg/ml溴乙锭染料的1.5%琼脂糖凝胶中电泳[5]，电压稳定在50 V，电泳1.5小时后，取出标本，在紫外灯下观察具有细胞凋亡特征的DNA阶梯状条带。
3.微观放射自显影示踪
收集受153Sm不同内照射作用阶段的骨肉瘤细胞，离心洗涤去除游离的153Sm核素后，取20 μl细胞悬液置于载玻片的一侧边缘，制备细胞涂片，20℃干燥后，用无水甲醇固定，浸入5%火棉胶液中迅速取出，插入立式载玻片架中使之干燥。然后移入暗室，在40℃电热恒温涂敷装置上熔化N4型液体核乳胶，随即加入占10%液体核乳胶量的稳定剂6-硝基苯骈咪唑后，再用重蒸馏水作1∶1稀释[6]，用定量滴管抽取15 μl已稀释的液体核乳胶，置于各不同标本片的一端，取特制玻棒均匀滑动涂匀，置25℃恒温下阴干后，收片装入曝光盒中，在4℃干燥无氧环境下进行曝光15天，作显影、停显、定影和甘油饱和液浸泡处理。
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结果
1.153Sm诱发瘤细胞DNA损伤特征
对153Sm内照射作用不同阶段的骨肉瘤细胞DNA标本，进行琼脂糖凝胶电泳发现，在受153Sm内照射作用达9小时的骨肉瘤细胞DNA的损伤特征是可出现瘤细胞DNA核小体之间的随机性断裂，从而显示出在凝胶电泳时的阶梯状条带形成的凋亡特征。尤其是在153Sm内照射作用12小时和24小时(见图1)的瘤细胞DNA标本的阶梯状条带可显著呈现，而在153Sm内照射作用6小时以下DNA标本的阶梯状条带不明显。
图1 153Sm内照射不同阶段的骨肉瘤细胞DNA琼脂糖凝胶电泳
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2.153Sm在瘤细胞中的行径特性
微观放射自显影研究发现，核素153Sm的放射自显影径迹呈选择性浓集在骨肉瘤细胞周围，呈亲膜性积聚见图2中，随着观察时间的延长，可见到153Sm被瘤细胞所吞噬如图3中所示，并进而以吞噬小体的形式存在于瘤细胞中见图4。至于在受153Sm-EDTMP内照射诱发凋亡的骨肉瘤细胞中，可见到153Sm径迹沉积在膜包裹着的凋亡小体中，见图5。
图2 153Sm作用后6小时径迹呈亲膜性积聚；
图3 153Sm作用后9小时被骨肉瘤细胞吞噬；
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图4 153Sm作用后12小时以吞噬小体形式存在于瘤细胞内；
图5 153Sm作用后24小时径迹沉积在膜包裹着的凋亡小体中
图2～5 153Sm内照射作用不同时间后骨肉瘤细胞微观放射自显影像，改良HE复染， ×2000
讨论
考虑到细胞凋亡是一种程序化死亡过程，是细胞针对所处环境因素的特定改变所产生的应答，它与细胞生长一样，在机体中承担着重要的调控作用[7]。我们通过DNA琼脂糖凝胶电泳研究了受153Sm内照射诱发骨肉瘤细胞凋亡的DNA损伤特征，观察到瘤细胞凋亡先出现DNA较大分子量的链断裂[8]，继而导致限制性内切酶的活化，引起DNA在核小体间断裂，这是由于此酶能选择性的切断核小体间的连接DNA，使之成为不连续的多倍180～200bp大小的DNA片段[9]，从而可在琼脂糖凝胶电泳时出现凋亡特征的阶梯状条带形成。而从微观放射自显影研究153Sm在骨肉瘤细胞中的行径特性揭示，放射性核素153Sm可迅速透过瘤细胞膜，或被瘤细胞吞噬，呈亲膜性积聚和膜包裹着的凋亡小体呈现，导致骨肉瘤细胞凋亡发生，从而可为临床上应用153Sm-EDTMP内照射治疗骨肉瘤疾患提供依据。
, 百拇医药
本课题受国际原子能机构资助(9457/RBF)
参考文献
1 Billings E,Hosain F.Modification of an internal dosimetry program and application to new agents like 153Sm-EDTMP.Clin Nucl Med,1990,15:364-368.
2 Nielsen OS,Munro AJ,Tannok IF.Bone metastases pathophysiology and management policy.J Clin Oncol,1991,9:509-524.
3 Coyle N,Adelhardt J,Foley KM,et al.Character of terminal illness in the advanced cancer patient. J Pain Sympt Manage,1990,5:83.
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4 朱寿彭，肖东，韩晓枫.电镜形态和DNA链断裂研究153Sm内照射诱发骨肉瘤细胞凋亡.中华放射医学与防护杂志，1998，18：89-91.
5 卢圣栋.现代分子生物学实验技术，北京：高等教育出版社，1993.50-57.
6 朱寿彭.放射自显影示踪学，北京：原子能出版社，1995.120-142.
7 朱寿彭.辐射诱发细胞凋亡与基因调控.国际学术动态，1996，(3)：65-68.
8 Zhu Shoupeng,Xiao Dong,Han Xiaofeng.Apoptosis in bone tumor cells induced by 153Sm-EDTMP.Nucl Sci Tech,1997,8:163-167
9 Brown DG,Sun XM,Cohen GM.Dexamethasone induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation.J Biol Chem,1993,268:3037-3039.
(收稿:1998-05-15 修回：1998-10-20), http://www.100md.com
单位：215007 江苏，苏州医学院放射医学系
关键词：DNA凝胶电泳；微观放射自显影；153Sm-EDTMP；骨肉瘤细胞；凋亡
中华放射医学与防护杂志/990505 【摘要】 目的 研究受153Sm-EDTMP内照射治疗时诱发骨肉瘤细胞凋亡的DNA损伤特征，以及153Sm核素在瘤细胞中的行径特性。方法 观察了153Sm-EDTMP内照射不同时间，诱发骨肉瘤细胞凋亡的DNA凝胶电泳和微观放射自显影的示踪动态。结果 研究发现，在153Sm-EDTMP内照射作用下，骨肉瘤细胞的DNA呈现出在核小体间断裂的阶梯状条带形成的凋亡特征，放射性核素153Sm可迅速透过瘤细胞膜，也可被瘤细胞吞噬，呈亲膜性积聚和膜包裹着的凋亡小体呈现。结论 153Sm-EDTMP内照射治疗时，可诱发骨肉瘤细胞凋亡发生，其诱发凋亡的程度随153Sm内照射作用时间延长而增升。
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DNA gel electrophoretic and microautoradiographic studies on apoptosis in bone tumor cells after exposure to 153Sm-EDTMP
ZHU Shoupeng,XIAO Dong,HAN Xiaofeng.
Suzhou Medical College,Suzhou 215007,China
【Abstract】 Objective To study the characteristics of injury in apoptotic bone tumor cells and behavior of radionuclide 153Sm in tumor cells. Methods DNA gel electrophoresis and microautoradiographic tracing of apoptotic bone tumor cells at different intervals after 153Sm-EDTMP internal irradiation. Results Bone tumor cells internally irradiated with 153Sm-EDTMP displayed characteristics of DNA ladder formation in apoptotic cells.153Sm could permeate through tumor cell membrane and be phagocytized by the tumor cells,showing membrane-seeking and membrane-bounded apoptotic bodies condensation. Conclusion Progression of apoptosis in bone tumor cells induced by 153Sm-EDTMP is dependent on the time elapse of 153Sm internal irradiation.
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【Key words】 DNA gel electrophoresis Microautoradiography 153Sm-EDTMP Internal irradiation Bone tumor cells Apoptosis
由于放射性核素153Sm的辐射特性而适于在临床上用作内照射治疗剂[1]。目前153Sm-EDTMP(153Sm-乙二胺四甲撑膦酸)用于治疗扩散性骨转移瘤患者和解除疼痛是有效的[2，3]。但有关153Sm放射性核素对骨转移瘤治疗的生物医学特性机理，有待揭示。迄今国内外文献中均未见报道。我们曾运用电镜形态和DNA链断裂探讨了153Sm内照射诱发骨肉瘤细胞凋亡[4]，而在本研究中，设计用DNA凝胶电泳和微观放射自显影来观察153Sm-EDTMP内照射治疗时诱发骨肉瘤细胞的DNA损伤特点，以及该稀土族核素153Sm在瘤细胞中的行径特性，研究其诱发骨肉瘤细胞凋亡的过程。
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材料和方法
1.细胞培养及辐照细胞
实验用我院细胞免疫研究中心传代培养的骨肉瘤细胞株HOS-8603细胞， 用RPMI 1640(GIBCO)全培养液中维持培养。临实验时，将贴壁培养细胞放置到5%CO2培养器内作37℃培养。然后取对数生长期的骨肉瘤细胞，先用胰蛋白酶：EDTA(0.05∶0.02%)液消化，随即用Hanks液洗涤去除胰蛋白酶后，用全培养液调至实验所需细胞浓度2×106细胞/ml备用。
实验用153Sm-EDTMP为放射纯和化学纯的注射液。先取上述浓度的骨肉瘤细胞1 ml，放入无菌24孔培养板的培养孔内，然后在每一实验孔中另加入1 ml用RPMI 1640全培养液稀释的153Sm工作液3.7×102kBq/ml,而对照组每孔中则加入1 ml的RPMI 1640全培养液，随后将24孔培养板放到5%CO2培养器内37℃培养，经3、6、9、12和24小时分别收集各观察点的骨肉瘤细胞标本，用于进行细胞凋亡研究。
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2.DNA的提取和琼脂糖凝胶电泳
分别收集2×106细胞/ml的实验组和对照组细胞，200 r.5min-1离心洗涤后，细胞在Eppendorf离心管内悬浮于1 ml内含10 mmol Tris.HCl(pH8.0)、1 mmol EDTA,10 mmol NaCl,1% SDS的DNA抽提缓冲液中，再补充20 μg RNAase及100 μg蛋白酶K，用玻棒搅拌至粘稠状，置37℃温箱中12小时，待冷却至室温后，加入等容积饱和酚溶液，转动离心管混匀两相，12 000 r.min-1离心，吸出上层粘稠水相，移至另一Eppendorf离心管内，再加等体积饱和酚溶液抽提一次，然后用1∶1的氯仿酚溶液抽提后，将上层水相移入另一管内，加入0.3 mmol/L乙酸钠- 乙醇溶液沉淀DNA，加入二倍容积冰冻无水乙醇置冰格中30分钟，取出在4 ℃、12 000 r.min-1离心10分钟收取DNA，弃去无水乙醇后用70%乙醇混匀漂洗，开盖室温放置15分钟挥发乙醇，加入含1 mmol EDTA、10 mmol Tris.HCl(pH7.8)TE缓冲液，使DNA溶解，放置4℃冰箱保存备用。
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取10 μl提取的DNA样品(含1 μg DNA量)与0.25%溴酚蓝和40%蔗糖溶液混匀后，加入到琼脂糖凝胶样品槽内，在由1 mmol/L EDTA(pH8.0)和45 mmol/L Tris-硼酸缓冲液配制的内含0.5 μg/ml溴乙锭染料的1.5%琼脂糖凝胶中电泳[5]，电压稳定在50 V，电泳1.5小时后，取出标本，在紫外灯下观察具有细胞凋亡特征的DNA阶梯状条带。
3.微观放射自显影示踪
收集受153Sm不同内照射作用阶段的骨肉瘤细胞，离心洗涤去除游离的153Sm核素后，取20 μl细胞悬液置于载玻片的一侧边缘，制备细胞涂片，20℃干燥后，用无水甲醇固定，浸入5%火棉胶液中迅速取出，插入立式载玻片架中使之干燥。然后移入暗室，在40℃电热恒温涂敷装置上熔化N4型液体核乳胶，随即加入占10%液体核乳胶量的稳定剂6-硝基苯骈咪唑后，再用重蒸馏水作1∶1稀释[6]，用定量滴管抽取15 μl已稀释的液体核乳胶，置于各不同标本片的一端，取特制玻棒均匀滑动涂匀，置25℃恒温下阴干后，收片装入曝光盒中，在4℃干燥无氧环境下进行曝光15天，作显影、停显、定影和甘油饱和液浸泡处理。
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结果
1.153Sm诱发瘤细胞DNA损伤特征
对153Sm内照射作用不同阶段的骨肉瘤细胞DNA标本，进行琼脂糖凝胶电泳发现，在受153Sm内照射作用达9小时的骨肉瘤细胞DNA的损伤特征是可出现瘤细胞DNA核小体之间的随机性断裂，从而显示出在凝胶电泳时的阶梯状条带形成的凋亡特征。尤其是在153Sm内照射作用12小时和24小时(见图1)的瘤细胞DNA标本的阶梯状条带可显著呈现，而在153Sm内照射作用6小时以下DNA标本的阶梯状条带不明显。
图1 153Sm内照射不同阶段的骨肉瘤细胞DNA琼脂糖凝胶电泳
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2.153Sm在瘤细胞中的行径特性
微观放射自显影研究发现，核素153Sm的放射自显影径迹呈选择性浓集在骨肉瘤细胞周围，呈亲膜性积聚见图2中，随着观察时间的延长，可见到153Sm被瘤细胞所吞噬如图3中所示，并进而以吞噬小体的形式存在于瘤细胞中见图4。至于在受153Sm-EDTMP内照射诱发凋亡的骨肉瘤细胞中，可见到153Sm径迹沉积在膜包裹着的凋亡小体中，见图5。
图2 153Sm作用后6小时径迹呈亲膜性积聚；
图3 153Sm作用后9小时被骨肉瘤细胞吞噬；
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图4 153Sm作用后12小时以吞噬小体形式存在于瘤细胞内；
图5 153Sm作用后24小时径迹沉积在膜包裹着的凋亡小体中
图2～5 153Sm内照射作用不同时间后骨肉瘤细胞微观放射自显影像，改良HE复染， ×2000
讨论
考虑到细胞凋亡是一种程序化死亡过程，是细胞针对所处环境因素的特定改变所产生的应答，它与细胞生长一样，在机体中承担着重要的调控作用[7]。我们通过DNA琼脂糖凝胶电泳研究了受153Sm内照射诱发骨肉瘤细胞凋亡的DNA损伤特征，观察到瘤细胞凋亡先出现DNA较大分子量的链断裂[8]，继而导致限制性内切酶的活化，引起DNA在核小体间断裂，这是由于此酶能选择性的切断核小体间的连接DNA，使之成为不连续的多倍180～200bp大小的DNA片段[9]，从而可在琼脂糖凝胶电泳时出现凋亡特征的阶梯状条带形成。而从微观放射自显影研究153Sm在骨肉瘤细胞中的行径特性揭示，放射性核素153Sm可迅速透过瘤细胞膜，或被瘤细胞吞噬，呈亲膜性积聚和膜包裹着的凋亡小体呈现，导致骨肉瘤细胞凋亡发生，从而可为临床上应用153Sm-EDTMP内照射治疗骨肉瘤疾患提供依据。
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本课题受国际原子能机构资助(9457/RBF)
参考文献
1 Billings E,Hosain F.Modification of an internal dosimetry program and application to new agents like 153Sm-EDTMP.Clin Nucl Med,1990,15:364-368.
2 Nielsen OS,Munro AJ,Tannok IF.Bone metastases pathophysiology and management policy.J Clin Oncol,1991,9:509-524.
3 Coyle N,Adelhardt J,Foley KM,et al.Character of terminal illness in the advanced cancer patient. J Pain Sympt Manage,1990,5:83.
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4 朱寿彭，肖东，韩晓枫.电镜形态和DNA链断裂研究153Sm内照射诱发骨肉瘤细胞凋亡.中华放射医学与防护杂志，1998，18：89-91.
5 卢圣栋.现代分子生物学实验技术，北京：高等教育出版社，1993.50-57.
6 朱寿彭.放射自显影示踪学，北京：原子能出版社，1995.120-142.
7 朱寿彭.辐射诱发细胞凋亡与基因调控.国际学术动态，1996，(3)：65-68.
8 Zhu Shoupeng,Xiao Dong,Han Xiaofeng.Apoptosis in bone tumor cells induced by 153Sm-EDTMP.Nucl Sci Tech,1997,8:163-167
9 Brown DG,Sun XM,Cohen GM.Dexamethasone induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation.J Biol Chem,1993,268:3037-3039.
(收稿:1998-05-15 修回：1998-10-20), http://www.100md.com