Caspase-3基因在凋亡HL-60细胞及肿瘤细胞中的表达
作者：李小明 童新 宋天保 孙志贤
单位：李小明、宋天保 710061，西安医科大学组织胚胎学教研室；童新、孙志贤 北京放射医学研究所
关键词：γ射线；细胞凋亡；caspase-3；基因表达
中华放射医学与防护杂志/990502 【摘要】 目的 明确caspase-3基因在凋亡前后HL-60细胞及不同肿瘤细胞系中的表达特性。方法 用Northern杂交技术检测γ射线诱发的凋亡前后HL-60细胞和6种肿瘤细胞中caspase-3的mRNA。结果 caspase-3基因在白血病细胞株HL-60、CEM和K562细胞及视母细胞瘤细胞SH-SY5Y中表达高于宫颈癌细胞HeLa及乳腺癌细胞MCF7；在凋亡HL-60细胞表达高于未照射对照HL-60细胞。结论 caspase-3表达水平与细胞寿命、对辐射敏感性及细胞凋亡的发生有关。
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Expression of caspase-3 gene in apoptotic HL-60 cell and different human tumor cell lines
LI Xiaoming1，TONG Xin2,SONG Tianbao1,et al.
1.Dept.of Histology and Embryology,Xi'an Medical University,Xi′an 710061,China.
2.Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850,China
【Abstract】 Objective To research the expression of caspase-3 gene in the apoptotic and the control HL-60 cells and in the different human tumor cell lines. Methods Caspase-3 mRNA in the control and γ-radiation-induced apoptotic HL-60 cells,and in the 6 types of human tumor cell lines,was analysed by Northern blot. Results The caspase-3 gene transcript was more highly expressed in leukemia cells HL-60,CEM,K562 and neuroblastoma SH-SY5Y than in cervical adenocarcinoma HeLa and breast carcinoma MCF7,and more highly in the radiation-induced apoptotic HL-60 than in the control HL-60 cells. Conclusion The high level of expression of caspase-3 may aid the efforts to understand the tumor cell sensitivity to radiation,apoptosis and its inherent ability to survive.
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【Key words】 γ-radiation Apoptosis Caspase-3 Gene expression
不同因素诱发不同种类细胞凋亡的进程及其调控机制不尽相同[1]。人髓性白血病细胞株HL-60细胞是各种抗瘤药及辐射诱导凋亡敏感细胞[2]。为研究辐射诱发肿瘤细胞凋亡的蛋白酶解机制，建立了γ射线诱发HL-60和U937细胞凋亡体外模型；从该凋亡细胞中克隆出了caspase-3基因片段，证明caspase-3参与了γ射线诱发的HL-60和U937细胞凋亡，可能是该凋亡途径的枢纽蛋白酶[3]。
Caspase是近年来发现的哺乳动物细胞凋亡相关蛋白酶，现已发现的该家族10个成员中，最引人瞩目的是caspase-3。根据GenBank人类EST(expressed sequence tag)提供的信息，用PCR方法，Fernandes-Alnemri等人于1994年从人类Jurkat T细胞系中克隆出caspase-3基因，并证明其与该家族第一个被发现的成员ICE(interleukin-1 β-converting enzyme)有同源性[4]。大量的实验证明，细胞凋亡是一个复杂的、由caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应过程。
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Caspase蛋白酶在组织分布和降解已知底物的功能上彼此有重叠现象，但在不同组织细胞或同一细胞受同一刺激诱发凋亡过程中，激活的caspase不尽相同。但普遍认为，该家族成员caspase-3是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶[1，5]。
本研究以Northern杂交技术检测凋亡前后HL-60细胞和不同肿瘤细胞系中caspase-3的mRNA，以了解caspase-3基因的表达特性，探求其与细胞凋亡及细胞放射敏感性的关系。
材料和方法
1.细胞及细胞培养：HL-60细胞、人红白血病细胞株K562细胞、人慢性T淋巴细胞白血病细胞株CEM及人视母细胞瘤细胞株SH-SY5Y细胞均在RPMI 1640培养基中培养；人宫颈癌细胞株HeLa细胞和人乳腺癌细胞株MCF7细胞DMEM培养基中培养。以上细胞均为北京放射医学研究所保存提供。
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2.γ射线照射及凋亡时限的确定：HL-60、CEM和K562为悬浮细胞，照射前1天细胞换液，照射时细胞浓度为1×106/ml，HL-60细胞吸收剂量为5 Gy，于照射后继续培养9、12、24、30小时；K 562、CEM及贴壁细胞SH-SY5Y吸收剂量为20 Gy，于照射后继续培养12、24、36、48小时；HeLa和MCF7为贴壁细胞，吸收剂量为40 Gy，于照射后每隔0.5天收获1次细胞。以上各时间点收获的细胞用于DNA梯状带(DNA ladder)检测。以未照射常规培养细胞为阴性对照。
DNA梯状带检测：在1×106个PBS洗涤后的离心沉淀细胞中加入0.5 ml低渗裂解液(1 mmol/L EDTA,10 mmol/L Tris,100 mmol/L NaCl，1%SDS，含100 μg/ml蛋白酶K)，37℃30分钟，离心沉淀；上清用酚：氯仿：异戊醇(1:12:1)抽提，无水乙醇和NaAc沉淀DNA，溶于Tris-EDTA(TE)缓冲液中。1%琼脂糖凝胶电泳，端电压60V，1小时，紫外光下观察。以DNA梯状带出现作为细胞凋亡判断标准。
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3.Northern杂交：用总RNA提取试剂盒(Promega)按说明分别提取未照射常规培养HL-60、CEM、K562、SH-SY5Y、HeLa和MCF7细胞及5Gy照射后24小时和30小时的HL-60细胞的总RNA，紫外核酸分析仪定量，甲醛变性胶电泳，Northern转印至尼龙膜上。用EcoRI和XbaI酶caspase-3 cDNA质粒(军事医学科学院基础所馈赠)，32P标记制备caspase-3探针，于42℃杂交。洗膜，放射自显影。以β-actin探针二次杂交作内参对照。
结果
1.各种细胞凋亡时限检测结果：以DNA梯状带作为细胞凋亡判断标准，HL-60细胞24小时开始出现凋亡。CEM、K562、SH-SY5Y、HeLa及MCF7细胞开始出现凋亡时间分别为20 Gy 24小时、20 Gy 36小时、20 Gy 36小时、40 Gy4天以及40 Gy4.5天。
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2.Northern杂交结果：图1示caspase-3基因在不同肿瘤细胞中的表达。在6种肿瘤细胞中都有几乎同等量的表达，说明上样量基本相同，其间有可比性。caspase-3 mRNA在6种肿瘤细胞中均可检见，但表达量有所不同，HL-60、CEM、K562及SH-SY5Y细胞的caspase-3基因表达量高，而HeLa和MCF7细胞表达量较低。
图1 用Northern杂交法分析人肿瘤细胞中caspase-3基因的表达 图2示caspase-3基因在凋亡前后HL-60细胞中的表达。检测未照射常规培养HL-60细胞、照射后24小时及照后30小时HL-60细胞caspase-3 mRNA，虽然RNA上样量定量一致，但在未照射HL-60细胞及5 Gy照射后24小时细胞比5 Gy照射后30小时细胞杂交信号强。与之相反，caspase-3基因表达量按未照射细胞、5 Gy24小时及5 Gy30小时凋亡细胞的顺序依此增高。
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图2 用Northern杂交法分析caspase-3基因在γ射线诱导的凋亡前后HL-60细胞中的表达
讨论
细胞凋亡是不可逆转的细胞死亡过程，经历细胞凋亡的受损细胞不会产生突变基因而留下异常后代，而耐受损伤存活下来的细胞产生突变基因以抵抗环境中不利因素(日照、有害气体、饮食中毒性物质等)的影响。辐射是有害刺激之一，也是治疗肿瘤的手段。不同类型的细胞对辐射的敏感性不同，体现出细胞内在的存活能力的差异。细胞的存活能力是由关键的死亡基因产物的重复出现决定的，细胞中这些基因表达水平的差异是决定细胞对毒素敏感性的物质基础。有关专家认为，可望改变重要的执行死亡基因的表达改变细胞的存活能力，以达到治疗疾病的目的[6]。
以γ射线照射剂量及照后开始出现凋亡的时间反映细胞对射线的敏感性。以DNA梯状带的出现作为细胞凋亡判断标准，白血病细胞HL-60、CEM及K562细胞凋亡时间分别为5 Gy24小时、20 Gy24小时及20 Gy36小时；视母细胞瘤细胞SH-SY5Y凋亡时间是20 Gy36小时；而宫颈癌细胞HeLa及乳腺癌细胞MCF7凋亡时间分别为40 Gy4天和40 Gy4.5天。这些细胞对射线的敏感性从大到小依此为HL-60、CEM、K562/SH-SY5Y、HeLa和MCF7，反应出其存活能力依此增强。已知造血细胞比其他器官组织细胞寿命短；临床资料表明，白血病细胞及视母细胞瘤细胞对辐射及抗癌药敏感，而且好发于儿童；来源于上皮的癌细胞有很强的生存能力，这就是为什么白血病相对少见，癌症发病率较高的原因[6]。因此，caspase-3表达量与辐射敏感性成正比的实验结果表明，caspase-3表达水平的高低与辐射敏感性及细胞寿命有直接关系。
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γ射线诱导HL-60细胞凋亡时，caspase-3高表达，且随着照后时间的推移即凋亡进程的发展而增高。这一现象与γ射线诱发U937细胞凋亡前后caspase-3表达水平不变的结果不同。目前，关于caspase的表达有两种观点：一种认为，细胞凋亡时活性蛋白酶的增高仅发生在细胞内原有酶原的活化环节，并无转录翻译的改变；另一种认为细胞凋亡分子的活化是通过基因本身转录的启动而实现[7]。综合以上实验结果，作者认为，细胞凋亡蛋白酶级联反应的启动不仅发生于翻译后的活化水平，同时随着活化蛋白酶的增多，反馈性启动蛋白酶基因本身的转录和翻译，合成更多的酶原转化成具有功能的活性蛋白酶。或许，不同的细胞存在不同的表达及活化方式，不能一概而论。
本课题受国家自然科学基金资助(项目号：9605007)
参考文献
1 Nicolson DW,Thornberry NA.Caspase:killer proteases. Trends Biochem Sci,1997,22:299-306.
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2 Han ZY,Chatterjee D,He DM,et al.Evidence for a G2 checkpoint in p53-independent apoptosis induction by X-irradiation. Mol Cell Biol,1995,15:5849-5857.
3 童新，罗瑛，董燕，等.辐射诱发白血病U937细胞凋亡基因分离与鉴定.军事医学科学院院刊，1998，22：51-54.
4 Fernandes-Alnemri T.Litwack G,Alnemri ES.CPP32,a novel human apoptotic protein with homology to caeorhabditis elegans cell death protein ced-3 and mammalian interleukin-1 β-converting enzyme.J Biol Chem,1994,269:30761-30764.
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5 Alnemri ES.Mammalian cell death proteases:a family of highly conserved aspartate specific cysteine proteases.J Cell Biochem,1997,64:33-42.
6 Roberts RA,Nebert DW,Hickman JA,et al.Perturbation of the mitosis/apoptosis balance:a fundamental mechanism in toxicology.Fund Appl Toxicol,1997,38:107-115.
7 Ni B,Wu X,Du Y,et al.Cloning and expression of rat in apoptosis of cultured cerebellar granule neurons.J Neurosci,1997,17(5):1561-1569.
(收稿:1998-09-17 修回1999-01-22), 百拇医药
单位：李小明、宋天保 710061，西安医科大学组织胚胎学教研室；童新、孙志贤 北京放射医学研究所
关键词：γ射线；细胞凋亡；caspase-3；基因表达
中华放射医学与防护杂志/990502 【摘要】 目的 明确caspase-3基因在凋亡前后HL-60细胞及不同肿瘤细胞系中的表达特性。方法 用Northern杂交技术检测γ射线诱发的凋亡前后HL-60细胞和6种肿瘤细胞中caspase-3的mRNA。结果 caspase-3基因在白血病细胞株HL-60、CEM和K562细胞及视母细胞瘤细胞SH-SY5Y中表达高于宫颈癌细胞HeLa及乳腺癌细胞MCF7；在凋亡HL-60细胞表达高于未照射对照HL-60细胞。结论 caspase-3表达水平与细胞寿命、对辐射敏感性及细胞凋亡的发生有关。
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Expression of caspase-3 gene in apoptotic HL-60 cell and different human tumor cell lines
LI Xiaoming1，TONG Xin2,SONG Tianbao1,et al.
1.Dept.of Histology and Embryology,Xi'an Medical University,Xi′an 710061,China.
2.Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850,China
【Abstract】 Objective To research the expression of caspase-3 gene in the apoptotic and the control HL-60 cells and in the different human tumor cell lines. Methods Caspase-3 mRNA in the control and γ-radiation-induced apoptotic HL-60 cells,and in the 6 types of human tumor cell lines,was analysed by Northern blot. Results The caspase-3 gene transcript was more highly expressed in leukemia cells HL-60,CEM,K562 and neuroblastoma SH-SY5Y than in cervical adenocarcinoma HeLa and breast carcinoma MCF7,and more highly in the radiation-induced apoptotic HL-60 than in the control HL-60 cells. Conclusion The high level of expression of caspase-3 may aid the efforts to understand the tumor cell sensitivity to radiation,apoptosis and its inherent ability to survive.
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【Key words】 γ-radiation Apoptosis Caspase-3 Gene expression
不同因素诱发不同种类细胞凋亡的进程及其调控机制不尽相同[1]。人髓性白血病细胞株HL-60细胞是各种抗瘤药及辐射诱导凋亡敏感细胞[2]。为研究辐射诱发肿瘤细胞凋亡的蛋白酶解机制，建立了γ射线诱发HL-60和U937细胞凋亡体外模型；从该凋亡细胞中克隆出了caspase-3基因片段，证明caspase-3参与了γ射线诱发的HL-60和U937细胞凋亡，可能是该凋亡途径的枢纽蛋白酶[3]。
Caspase是近年来发现的哺乳动物细胞凋亡相关蛋白酶，现已发现的该家族10个成员中，最引人瞩目的是caspase-3。根据GenBank人类EST(expressed sequence tag)提供的信息，用PCR方法，Fernandes-Alnemri等人于1994年从人类Jurkat T细胞系中克隆出caspase-3基因，并证明其与该家族第一个被发现的成员ICE(interleukin-1 β-converting enzyme)有同源性[4]。大量的实验证明，细胞凋亡是一个复杂的、由caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应过程。
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Caspase蛋白酶在组织分布和降解已知底物的功能上彼此有重叠现象，但在不同组织细胞或同一细胞受同一刺激诱发凋亡过程中，激活的caspase不尽相同。但普遍认为，该家族成员caspase-3是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶[1，5]。
本研究以Northern杂交技术检测凋亡前后HL-60细胞和不同肿瘤细胞系中caspase-3的mRNA，以了解caspase-3基因的表达特性，探求其与细胞凋亡及细胞放射敏感性的关系。
材料和方法
1.细胞及细胞培养：HL-60细胞、人红白血病细胞株K562细胞、人慢性T淋巴细胞白血病细胞株CEM及人视母细胞瘤细胞株SH-SY5Y细胞均在RPMI 1640培养基中培养；人宫颈癌细胞株HeLa细胞和人乳腺癌细胞株MCF7细胞DMEM培养基中培养。以上细胞均为北京放射医学研究所保存提供。
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2.γ射线照射及凋亡时限的确定：HL-60、CEM和K562为悬浮细胞，照射前1天细胞换液，照射时细胞浓度为1×106/ml，HL-60细胞吸收剂量为5 Gy，于照射后继续培养9、12、24、30小时；K 562、CEM及贴壁细胞SH-SY5Y吸收剂量为20 Gy，于照射后继续培养12、24、36、48小时；HeLa和MCF7为贴壁细胞，吸收剂量为40 Gy，于照射后每隔0.5天收获1次细胞。以上各时间点收获的细胞用于DNA梯状带(DNA ladder)检测。以未照射常规培养细胞为阴性对照。
DNA梯状带检测：在1×106个PBS洗涤后的离心沉淀细胞中加入0.5 ml低渗裂解液(1 mmol/L EDTA,10 mmol/L Tris,100 mmol/L NaCl，1%SDS，含100 μg/ml蛋白酶K)，37℃30分钟，离心沉淀；上清用酚：氯仿：异戊醇(1:12:1)抽提，无水乙醇和NaAc沉淀DNA，溶于Tris-EDTA(TE)缓冲液中。1%琼脂糖凝胶电泳，端电压60V，1小时，紫外光下观察。以DNA梯状带出现作为细胞凋亡判断标准。
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3.Northern杂交：用总RNA提取试剂盒(Promega)按说明分别提取未照射常规培养HL-60、CEM、K562、SH-SY5Y、HeLa和MCF7细胞及5Gy照射后24小时和30小时的HL-60细胞的总RNA，紫外核酸分析仪定量，甲醛变性胶电泳，Northern转印至尼龙膜上。用EcoRI和XbaI酶caspase-3 cDNA质粒(军事医学科学院基础所馈赠)，32P标记制备caspase-3探针，于42℃杂交。洗膜，放射自显影。以β-actin探针二次杂交作内参对照。
结果
1.各种细胞凋亡时限检测结果：以DNA梯状带作为细胞凋亡判断标准，HL-60细胞24小时开始出现凋亡。CEM、K562、SH-SY5Y、HeLa及MCF7细胞开始出现凋亡时间分别为20 Gy 24小时、20 Gy 36小时、20 Gy 36小时、40 Gy4天以及40 Gy4.5天。
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2.Northern杂交结果：图1示caspase-3基因在不同肿瘤细胞中的表达。在6种肿瘤细胞中都有几乎同等量的表达，说明上样量基本相同，其间有可比性。caspase-3 mRNA在6种肿瘤细胞中均可检见，但表达量有所不同，HL-60、CEM、K562及SH-SY5Y细胞的caspase-3基因表达量高，而HeLa和MCF7细胞表达量较低。
图1 用Northern杂交法分析人肿瘤细胞中caspase-3基因的表达 图2示caspase-3基因在凋亡前后HL-60细胞中的表达。检测未照射常规培养HL-60细胞、照射后24小时及照后30小时HL-60细胞caspase-3 mRNA，虽然RNA上样量定量一致，但在未照射HL-60细胞及5 Gy照射后24小时细胞比5 Gy照射后30小时细胞杂交信号强。与之相反，caspase-3基因表达量按未照射细胞、5 Gy24小时及5 Gy30小时凋亡细胞的顺序依此增高。
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图2 用Northern杂交法分析caspase-3基因在γ射线诱导的凋亡前后HL-60细胞中的表达
讨论
细胞凋亡是不可逆转的细胞死亡过程，经历细胞凋亡的受损细胞不会产生突变基因而留下异常后代，而耐受损伤存活下来的细胞产生突变基因以抵抗环境中不利因素(日照、有害气体、饮食中毒性物质等)的影响。辐射是有害刺激之一，也是治疗肿瘤的手段。不同类型的细胞对辐射的敏感性不同，体现出细胞内在的存活能力的差异。细胞的存活能力是由关键的死亡基因产物的重复出现决定的，细胞中这些基因表达水平的差异是决定细胞对毒素敏感性的物质基础。有关专家认为，可望改变重要的执行死亡基因的表达改变细胞的存活能力，以达到治疗疾病的目的[6]。
以γ射线照射剂量及照后开始出现凋亡的时间反映细胞对射线的敏感性。以DNA梯状带的出现作为细胞凋亡判断标准，白血病细胞HL-60、CEM及K562细胞凋亡时间分别为5 Gy24小时、20 Gy24小时及20 Gy36小时；视母细胞瘤细胞SH-SY5Y凋亡时间是20 Gy36小时；而宫颈癌细胞HeLa及乳腺癌细胞MCF7凋亡时间分别为40 Gy4天和40 Gy4.5天。这些细胞对射线的敏感性从大到小依此为HL-60、CEM、K562/SH-SY5Y、HeLa和MCF7，反应出其存活能力依此增强。已知造血细胞比其他器官组织细胞寿命短；临床资料表明，白血病细胞及视母细胞瘤细胞对辐射及抗癌药敏感，而且好发于儿童；来源于上皮的癌细胞有很强的生存能力，这就是为什么白血病相对少见，癌症发病率较高的原因[6]。因此，caspase-3表达量与辐射敏感性成正比的实验结果表明，caspase-3表达水平的高低与辐射敏感性及细胞寿命有直接关系。
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γ射线诱导HL-60细胞凋亡时，caspase-3高表达，且随着照后时间的推移即凋亡进程的发展而增高。这一现象与γ射线诱发U937细胞凋亡前后caspase-3表达水平不变的结果不同。目前，关于caspase的表达有两种观点：一种认为，细胞凋亡时活性蛋白酶的增高仅发生在细胞内原有酶原的活化环节，并无转录翻译的改变；另一种认为细胞凋亡分子的活化是通过基因本身转录的启动而实现[7]。综合以上实验结果，作者认为，细胞凋亡蛋白酶级联反应的启动不仅发生于翻译后的活化水平，同时随着活化蛋白酶的增多，反馈性启动蛋白酶基因本身的转录和翻译，合成更多的酶原转化成具有功能的活性蛋白酶。或许，不同的细胞存在不同的表达及活化方式，不能一概而论。
本课题受国家自然科学基金资助(项目号：9605007)
参考文献
1 Nicolson DW,Thornberry NA.Caspase:killer proteases. Trends Biochem Sci,1997,22:299-306.
, 百拇医药
2 Han ZY,Chatterjee D,He DM,et al.Evidence for a G2 checkpoint in p53-independent apoptosis induction by X-irradiation. Mol Cell Biol,1995,15:5849-5857.
3 童新，罗瑛，董燕，等.辐射诱发白血病U937细胞凋亡基因分离与鉴定.军事医学科学院院刊，1998，22：51-54.
4 Fernandes-Alnemri T.Litwack G,Alnemri ES.CPP32,a novel human apoptotic protein with homology to caeorhabditis elegans cell death protein ced-3 and mammalian interleukin-1 β-converting enzyme.J Biol Chem,1994,269:30761-30764.
, http://www.100md.com
5 Alnemri ES.Mammalian cell death proteases:a family of highly conserved aspartate specific cysteine proteases.J Cell Biochem,1997,64:33-42.
6 Roberts RA,Nebert DW,Hickman JA,et al.Perturbation of the mitosis/apoptosis balance:a fundamental mechanism in toxicology.Fund Appl Toxicol,1997,38:107-115.
7 Ni B,Wu X,Du Y,et al.Cloning and expression of rat in apoptosis of cultured cerebellar granule neurons.J Neurosci,1997,17(5):1561-1569.
(收稿:1998-09-17 修回1999-01-22), 百拇医药