大鼠放射性皮肤溃疡组织中c-erbB-2、 EGF-R蛋白高表达病理研究
作者：谷庆阳 高亚兵 王德文 杨志祥 李永兰
单位：谷庆阳(北京放射医学研究所 100850)；高亚兵(北京放射医学研究所 100850)；王德文(北京放射医学研究所 100850)；杨志祥(北京北太平路医院)；李永兰(武警北京二总队医院)
关键词：
中华放射医学与防护杂志000115 放射性皮肤溃疡多见于临床放疗引起的并发症，其特点为顽固性反复发作、长期不愈，最后可能发展为癌变[1]。放射性皮肤溃疡的基因病理学改变目前尚不清楚，国内外尚少见其相关癌基因改变的病理学研究报道。c-erbB-2在多种癌组织中均有高表达，可作为判断肿瘤良、恶性以及患者预后的参考指标之一。c-erbB-2基因与neu基因被认为是同源基因，在结构上与表皮生长因子受体极其相似，故认为它们也是同一基因[2]。为了解c-erbB-2和EGF-R在放射性皮肤损伤中的改变及其意义，建立了放射性皮肤溃疡动物模型，并检测其基因表达状况。
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一、材料和方法
采用140 只雌性(因雄性在照射时不易屏蔽睾丸)Wistar大鼠经随机分组后进行局部照射，鼠重(250±10)g，照射野为双侧臀部、后腿及尾巴，吸收剂量为35 Gy(60只)、45 Gy(40只)、55 Gy(40只)，吸收剂量率为4.612 Gy/min。观察病变1年并分阶段取材。标本经福尔马林固定，石蜡包埋，切片后行常规染色。免疫组化染色法：切片常规脱蜡，0.3%过氧化氢-甲醇30 min，按微波炉抗原修复法[3]处理后，兔抗鼠c-erbB-2、EGF-R蛋白抗体(中山公司)1：100，4℃过夜。以下方法按SP药盒(Zymed公司)方法进行，以PBS、正常兔血清代替一抗作空白对照和替代对照，以大鼠正常伤口皮肤为正常对照，以胞膜或胞质染成棕黄色作为阳性判定标准。
二、结果
于照射后12～14 d，所有动物照射野均出现溃疡，并有糜烂、水肿，溃疡底部开始为红色，有渗出液，未见感染。随着时间的推移，溃疡逐渐扩大、加深，多数伴随感染，水肿则渐减轻。照射后4月，63%动物出现肢残(后腿或尾巴因溃疡而折断或脱落)，21%较浅小溃疡愈合(其中33%于照射后6月复发)。受照射后动物不断死亡，共自然死亡37只，死亡高峰在照射后10～12月。照射后6月活杀60只动物取材(每组20只)，照射后9月活杀30只(每组10只)，1年将所余13只动物全部活杀取材。
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光镜观察，大鼠放射性皮肤溃疡的基本病理改变为：① 坏死、出血。早期可见受照射组织中表皮及成纤维细胞坏死，出血见于真皮及皮下组织层，血管壁结构破坏，内皮细胞脱落。② 变性增生。早期见真皮层胶原纤维肿胀、变性、断裂、融解。照射后5月可见溃疡底部有小动脉管壁增生肥厚。③ 萎缩。受照射部位表皮细胞及溃疡底部肌层萎缩。④ 渗出。溃疡底部各层中出现中性粒细胞、巨噬细胞、及少量淋巴细胞。⑤ 修复再生。包括表皮细胞增殖、附属腺体再生。成纤维细胞迁移、聚集，其中并可出现少量新生血管，修复被损坏的组织，但其特点是修复不彻底，生机差。⑥ 细胞损伤。出现大型、畸形的放射性成纤维细胞[4]。
44例照射后1～6月和28例照射后6～12月大鼠皮肤溃疡组织切片经微波炉抗原修复法处理，用c-erbB-2蛋白抗体以SP法染色后，其高表达阳性者分别为19例(43.2%)和24例(85.7%)，总阳性率为59.7%(43/72)。正常伤口皮肤及空白、替代对照均为阴性。c-erbB-2蛋白高表达部位主要见于① 增生肥大的鳞状上皮细胞胞膜和胞质；② 间质成纤维细胞及血管内皮细胞胞膜和胞质；③ 小动脉血管壁的中层平滑肌细胞，血管壁呈肥厚、管腔狭窄(见图1)。镜下见阳性细胞呈局灶性或弥漫性分布。照射后1～6月和照射后6～12月EGF-R蛋白高表达阳性率分别为59.1%(26/44)及89.3%(25/28)，总阳性率为70.8%(51/72)，与c-erbB-2分布、定位相同，两者阳性符合率为84.3%(43/51)，即所有c-erbB-2阳性者EGF-R亦均呈阳性。对照组均为阴性。
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三、讨论
c-erbB-2是一种由HER2/neu基因编码的跨膜糖蛋白，与EGF-R具有高度的序列同源性，故认为c-erbB-2蛋白有表皮生长因子受体样作用，并在多种恶性肿瘤中发现其有高表达。有作者认为c-erbB-2与肿瘤的恶性生物学行为相关[5，6]。在正常创伤愈合过程中c-erbB-2和EGF-R仅在快速增殖的成纤维细胞、新生毛细血管和表皮细胞中有短暂表达，愈合晚期很快转阴。赵坡等曾以c-erbB-2和EGF-R抗体检测部分人体放射性皮肤溃疡标本，得到其阳性率分别为92.0%和73.7%。作者采用局部照射Wistar大鼠方法，制备了典型的放射性皮肤溃疡动物模型，其病变与人体放射性皮肤溃疡病变十分相似。通过检测这些标本中c-erbB-2和EGF-R的表达，得到的结果与上述对人体标本的检测结果基本符合，且随着溃疡时间的延长，其高表达阳性率增高。本文的结果进一步证实了c-erbB-2和EGF-R的高表达为放射性皮肤溃疡病变的常发事件，可能为受照射后HER2/neu基因发生相应改变的结果，将在下一步工作中予以证实。
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图1 血管内皮细胞、小动脉壁中层平滑肌
细胞c-erbB-2蛋白高表达
血管壁呈肥厚、管腔狭窄(免疫组化染色，×400)
EGF-R的高表达可能为c-erbB-2基因扩增的直接或间接的结果。作者认为c-erbB-2、EGF-R免疫染色阳性率不完全吻合者，可能与两种抗体的抗原决定簇位点等差异有关。推测c-erbB-2、EGF-R在鳞状上皮细胞膜的高表达，可能与其接受过量表皮生长因子刺激，促进上皮反复增生、破溃，最后发展为癌变有关。而c-erbB-2、EGF-R在小血管内皮细胞、小动脉平滑肌细胞的高表达，则可能与这些细胞由此接受过量表皮生长因子信息，使血管壁细胞不断增生肥大，最终导致血管腔狭窄甚至闭缩，使溃疡深部缺血坏死，肉芽形成与纤维化不良有关，并可能成为放射性皮肤溃疡长期不愈及反复破溃的重要机理之一。
参考文献
, 百拇医药
[1]法哈多LF.辐射损伤病理学.李元敏，杜德林，译.北京：原子能出版社，1988.89-93.
[2]姚先莹.进一步提高乳腺癌病理诊断和预后的检测水平.中华病理学杂志，1994，23：323-326.
[3]Shi SR,Key ME,Kalra KI. Antigen retrieval in formalin-fixed,paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. J Histochem Cytochem,1991,39:741-744.
[4]Gu QY,Wang DW,Cui CB,et al. Effects of radiation on wound healing. JEPTO,1998,17:117-120.
, http://www.100md.com
[5]Lipponen P,Eskeline M,Hietala K. Expression of proliferating cell nuclear antigen (pc 10),p53 protein and c-erbB-2 in renal adenocarcinoma. Int J Cancer,1994,57:275-279.
[6]Kallioniemi OP,Holli K,Visakorpi T. Association of c-erbB-2 protein over-expression with high rate of cell proliferation,increased risk of visceral metastasis and poor long-term survival in breast cancer. Int J Cancer,1994,57:650-654.
收稿日期:1999-02-21, http://www.100md.com
单位：谷庆阳(北京放射医学研究所 100850)；高亚兵(北京放射医学研究所 100850)；王德文(北京放射医学研究所 100850)；杨志祥(北京北太平路医院)；李永兰(武警北京二总队医院)
关键词：
中华放射医学与防护杂志000115 放射性皮肤溃疡多见于临床放疗引起的并发症，其特点为顽固性反复发作、长期不愈，最后可能发展为癌变[1]。放射性皮肤溃疡的基因病理学改变目前尚不清楚，国内外尚少见其相关癌基因改变的病理学研究报道。c-erbB-2在多种癌组织中均有高表达，可作为判断肿瘤良、恶性以及患者预后的参考指标之一。c-erbB-2基因与neu基因被认为是同源基因，在结构上与表皮生长因子受体极其相似，故认为它们也是同一基因[2]。为了解c-erbB-2和EGF-R在放射性皮肤损伤中的改变及其意义，建立了放射性皮肤溃疡动物模型，并检测其基因表达状况。
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一、材料和方法
采用140 只雌性(因雄性在照射时不易屏蔽睾丸)Wistar大鼠经随机分组后进行局部照射，鼠重(250±10)g，照射野为双侧臀部、后腿及尾巴，吸收剂量为35 Gy(60只)、45 Gy(40只)、55 Gy(40只)，吸收剂量率为4.612 Gy/min。观察病变1年并分阶段取材。标本经福尔马林固定，石蜡包埋，切片后行常规染色。免疫组化染色法：切片常规脱蜡，0.3%过氧化氢-甲醇30 min，按微波炉抗原修复法[3]处理后，兔抗鼠c-erbB-2、EGF-R蛋白抗体(中山公司)1：100，4℃过夜。以下方法按SP药盒(Zymed公司)方法进行，以PBS、正常兔血清代替一抗作空白对照和替代对照，以大鼠正常伤口皮肤为正常对照，以胞膜或胞质染成棕黄色作为阳性判定标准。
二、结果
于照射后12～14 d，所有动物照射野均出现溃疡，并有糜烂、水肿，溃疡底部开始为红色，有渗出液，未见感染。随着时间的推移，溃疡逐渐扩大、加深，多数伴随感染，水肿则渐减轻。照射后4月，63%动物出现肢残(后腿或尾巴因溃疡而折断或脱落)，21%较浅小溃疡愈合(其中33%于照射后6月复发)。受照射后动物不断死亡，共自然死亡37只，死亡高峰在照射后10～12月。照射后6月活杀60只动物取材(每组20只)，照射后9月活杀30只(每组10只)，1年将所余13只动物全部活杀取材。
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光镜观察，大鼠放射性皮肤溃疡的基本病理改变为：① 坏死、出血。早期可见受照射组织中表皮及成纤维细胞坏死，出血见于真皮及皮下组织层，血管壁结构破坏，内皮细胞脱落。② 变性增生。早期见真皮层胶原纤维肿胀、变性、断裂、融解。照射后5月可见溃疡底部有小动脉管壁增生肥厚。③ 萎缩。受照射部位表皮细胞及溃疡底部肌层萎缩。④ 渗出。溃疡底部各层中出现中性粒细胞、巨噬细胞、及少量淋巴细胞。⑤ 修复再生。包括表皮细胞增殖、附属腺体再生。成纤维细胞迁移、聚集，其中并可出现少量新生血管，修复被损坏的组织，但其特点是修复不彻底，生机差。⑥ 细胞损伤。出现大型、畸形的放射性成纤维细胞[4]。
44例照射后1～6月和28例照射后6～12月大鼠皮肤溃疡组织切片经微波炉抗原修复法处理，用c-erbB-2蛋白抗体以SP法染色后，其高表达阳性者分别为19例(43.2%)和24例(85.7%)，总阳性率为59.7%(43/72)。正常伤口皮肤及空白、替代对照均为阴性。c-erbB-2蛋白高表达部位主要见于① 增生肥大的鳞状上皮细胞胞膜和胞质；② 间质成纤维细胞及血管内皮细胞胞膜和胞质；③ 小动脉血管壁的中层平滑肌细胞，血管壁呈肥厚、管腔狭窄(见图1)。镜下见阳性细胞呈局灶性或弥漫性分布。照射后1～6月和照射后6～12月EGF-R蛋白高表达阳性率分别为59.1%(26/44)及89.3%(25/28)，总阳性率为70.8%(51/72)，与c-erbB-2分布、定位相同，两者阳性符合率为84.3%(43/51)，即所有c-erbB-2阳性者EGF-R亦均呈阳性。对照组均为阴性。
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三、讨论
c-erbB-2是一种由HER2/neu基因编码的跨膜糖蛋白，与EGF-R具有高度的序列同源性，故认为c-erbB-2蛋白有表皮生长因子受体样作用，并在多种恶性肿瘤中发现其有高表达。有作者认为c-erbB-2与肿瘤的恶性生物学行为相关[5，6]。在正常创伤愈合过程中c-erbB-2和EGF-R仅在快速增殖的成纤维细胞、新生毛细血管和表皮细胞中有短暂表达，愈合晚期很快转阴。赵坡等曾以c-erbB-2和EGF-R抗体检测部分人体放射性皮肤溃疡标本，得到其阳性率分别为92.0%和73.7%。作者采用局部照射Wistar大鼠方法，制备了典型的放射性皮肤溃疡动物模型，其病变与人体放射性皮肤溃疡病变十分相似。通过检测这些标本中c-erbB-2和EGF-R的表达，得到的结果与上述对人体标本的检测结果基本符合，且随着溃疡时间的延长，其高表达阳性率增高。本文的结果进一步证实了c-erbB-2和EGF-R的高表达为放射性皮肤溃疡病变的常发事件，可能为受照射后HER2/neu基因发生相应改变的结果，将在下一步工作中予以证实。
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图1 血管内皮细胞、小动脉壁中层平滑肌
细胞c-erbB-2蛋白高表达
血管壁呈肥厚、管腔狭窄(免疫组化染色，×400)
EGF-R的高表达可能为c-erbB-2基因扩增的直接或间接的结果。作者认为c-erbB-2、EGF-R免疫染色阳性率不完全吻合者，可能与两种抗体的抗原决定簇位点等差异有关。推测c-erbB-2、EGF-R在鳞状上皮细胞膜的高表达，可能与其接受过量表皮生长因子刺激，促进上皮反复增生、破溃，最后发展为癌变有关。而c-erbB-2、EGF-R在小血管内皮细胞、小动脉平滑肌细胞的高表达，则可能与这些细胞由此接受过量表皮生长因子信息，使血管壁细胞不断增生肥大，最终导致血管腔狭窄甚至闭缩，使溃疡深部缺血坏死，肉芽形成与纤维化不良有关，并可能成为放射性皮肤溃疡长期不愈及反复破溃的重要机理之一。
参考文献
, 百拇医药
[1]法哈多LF.辐射损伤病理学.李元敏，杜德林，译.北京：原子能出版社，1988.89-93.
[2]姚先莹.进一步提高乳腺癌病理诊断和预后的检测水平.中华病理学杂志，1994，23：323-326.
[3]Shi SR,Key ME,Kalra KI. Antigen retrieval in formalin-fixed,paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. J Histochem Cytochem,1991,39:741-744.
[4]Gu QY,Wang DW,Cui CB,et al. Effects of radiation on wound healing. JEPTO,1998,17:117-120.
, http://www.100md.com
[5]Lipponen P,Eskeline M,Hietala K. Expression of proliferating cell nuclear antigen (pc 10),p53 protein and c-erbB-2 in renal adenocarcinoma. Int J Cancer,1994,57:275-279.
[6]Kallioniemi OP,Holli K,Visakorpi T. Association of c-erbB-2 protein over-expression with high rate of cell proliferation,increased risk of visceral metastasis and poor long-term survival in breast cancer. Int J Cancer,1994,57:650-654.
收稿日期:1999-02-21, http://www.100md.com