球囊内灌注32P致体外培养平滑肌细胞凋亡的研究
作者：毛家亮 徐迎佳 黄定九 袁济民 王彬尧 朱顺和 章隆泉 胡建达
单位：毛家亮 黄定九 袁济民 王彬尧 朱顺和 章隆泉(上海第二医科大学附属仁济医院 200001)；徐迎佳(上海胸科医院)；胡建达(中国科学院上海原子核研究所)
关键词：
中华放射医学与防护杂志000114 影响经皮冠状动脉成形术(PTCA)疗效的主要问题是再狭窄。其中血管壁平滑肌细胞(SMCs)增生过度是重要原因之一[1]。放疗在临床上可有效治疗良、恶性细胞增殖性疾病，据此，本研究用PTCA导管球囊灌注液相32P，对培养的兔髂动脉SMCs进行不同剂量单次照射，从细胞凋亡方面探讨射线对体外培养动脉SMCs的作用及量效关系。
一、材料和方法
, 百拇医药 1.血管SMCs原代和传代细胞培养：取撕去外膜刮除内膜兔髂动脉一段，剪碎成组织块，移入培养瓶加小牛血清1640培养液培养。待细胞生长形成单层且60%～70%融合时，分装培养瓶传代培养。
2.放射源及照射条件：医用32P，放射性浓度0.74～1 GBq/ml。取0.5 ml 32P液体注入PTCA导管球囊，加压固定使32P在球囊内充盈良好，消毒球囊置于SMCs培养瓶中贴壁照射，照射时间5到20 min，吸收剂量为10～50 Gy，设另一组用生理盐水灌注球囊作为对照。24 h后观察结果。
3.电镜观察：处理过的SMCs PBS洗涤戊二醛覆盖，刮取细胞离心10 min，将细胞沉积物用凝胶包埋锇酸染色，制成薄片电镜下观察。
4.DNA抽提与电泳：处理过的SMCs滴加0.6 ml细胞裂解液，37℃孵育1 h，加入蛋白酶K至终浓度为100 μg/ml孵育1 h取出，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊酸混合液(25∶24∶1)，离心吸取水相的DNA，重复上述操作2次，加5 mmol/L NaCl至终浓度为0.3 mmol/L，混匀后加2.5倍体积的无水冰乙醇离心，移去上清液用乙醇洗涤沉淀2次，取10 μl DNA与2 μl载样液混匀后电泳观察。
, 百拇医药
5.流式细胞仪检测：取处理过的SMCs胰酶消化离心，沉淀物加入冷乙醇4℃固定12 h，调整细胞浓度为1×106个/ml，碘化丙啶(PI)80 μl染色过滤，上机检测。
6.统计学处理：数据用t及直线相关性检验，P<0.05为差异有显著性。
二、结果
1.光镜形态学观察：照射组见梭形SMCs体积缩小变圆，其范围随照射剂量增大而扩大(见表1)。对照组SMCs无变化。
表1 不同吸收剂量对兔髂动脉SMCs凋亡率
和凋亡范围的影响 吸收剂量(Gy)
凋亡率(%)
凋亡范围(mm)
, 百拇医药
10
8.7
3.9
15
30.2
4.9
20
43.1
5.2
25
54.5
6.9
30
, http://www.100md.com
62.2
7.3
35
67.8
8.1
40
76.1
9.6
45
84.1
9.8
50
88.7
, http://www.100md.com
10.8
2.透射电镜观察：对照组正常SMCs细胞内染色质分布均匀，核仁清楚，而照射组受损SMCs胞浆线粒体肿胀，嵴断裂呈空泡状，核染色质断裂浓缩聚集于核膜边缘，细胞膜出芽，为细胞凋亡形态学特征。
3.核酸电泳：照射组SMCs在电泳凝胶上有DNA降解图形。
4.流式细胞仪检测：照射组SMCs可见明显凋亡峰，与对照组比较凋亡率差异有非常显著性〔(58.06±16.98)% vs (4.51±1.15)%，P<0.01〕，且凋亡率随照射剂量增大而增加(见表1)，两者呈正相关(r=0.95,P<0.01)。
三、讨论
再狭窄是一种损伤性反应，其中细胞凋亡不足可能有重要影响[2]，它使SMCs相对增殖、内膜大量形成而使血管重新狭窄。本研究提示射线有可能通过增加血管壁SMCs凋亡，来减少内膜形成而预防再狭窄。
, 百拇医药
本研究用β射线放射源32P，在相对短的时间内一次性照射可促发SMC凋亡。预防再狭窄的放射源有两类：γ射线和β射线，γ射线穿透力强，近距离生物效应差，达到有效照射剂量所需放射源活度大、照射时间长，可能对病人和操作者有辐射影响。而β射线近距离生物效应好，短时间内照射即可获得高剂量率，且穿透力弱无辐射损害，有望成为预防治疗再狭窄的主要选择[3]。
本研究表明随吸收剂量从10 Gy增加到50 Gy，SMCs凋亡率增加，有明显的剂量效应关系。多数实验结果表明，抑制内膜增生的有效剂量为大于10 Gy到20 Gy，抑制效果随剂量增加而增强[5]。本研究亦表明照射剂量的增加也使培养的SMCs细胞凋亡范围直径达10 mm，这样的范围在体内可作用到冠状动脉外膜，而外膜在再狭窄形成中也有影响[5]。
在放射预防血管再狭窄中多采用放射性导丝和放射性支架[3]，前者需将导丝严格放置在目标血管中轴上(尤其在用β射线放射源时)，否则会使局部血管壁受照射剂量不足而达不到抑制内膜增生目的。而放射性支架生产技术要求高，产品有明显的使用时效性，且放射源是永久植入，可能会有远期副作用。而用液相放射源直接灌注球囊中进行照射，方法简便，其紧贴血管壁照射可使整个目标管壁均匀受到照射而易达到有效照射剂量。但不利之处是照射时血管内血流会阻断，照射时间不能太长，提高放射源的浓度可使照射时间缩短[6]。另一不利之处是球囊一旦破裂，放射源会进入体内。选择物理半衰期和生物代谢都较短的放射源及载体，并控制灌注容量为最小(本研究用0.5 ml便可充满扩张球囊)，则能避免这种危害。■]
, 百拇医药
参考文献
[1]Bauters C,Isner JM. The biology of restenosis. Proge Cardiovasc Dis,1997,40:107-116.
[2]Bochaton-Piallat ML,Gabbiani F,Redard M,et al. Apoptosis participates in cellularity regulation during rat aortic intimal thickening. Am J Pathol,1995,146:1059-1064.
[3]Teirstein P. β-radiation to reduce restenosis. Circulation,1997,95:1095-1098.
[4]Robinson KA,Pipes DW,Bibber RV,et al. 186Re-liquid-filled balloon catheter system for endovascular brachytherapy:dose-response efficacy study and biodistribution after coronary injection. Circulation,1998,(SupplI1-I1016):3430-3431.
, http://www.100md.com
[5]Robert L,Wilensky,Keith L,et al. Vascular injury,repair,and restenosis after percutaneous transluminal angioplasty in the atherosclerotic rabbit. Circulation,1995,92:2995-3005.
[6]Amols HI,Reinstein LE,Weinberger J. Dosimeter of a radioactive coronary balloon dilatation catheter for treatment of neointimal hyperplasia. Med Phys,1996,23:1783-1788.
收稿日期:1999-03-15, 百拇医药
单位：毛家亮 黄定九 袁济民 王彬尧 朱顺和 章隆泉(上海第二医科大学附属仁济医院 200001)；徐迎佳(上海胸科医院)；胡建达(中国科学院上海原子核研究所)
关键词：
中华放射医学与防护杂志000114 影响经皮冠状动脉成形术(PTCA)疗效的主要问题是再狭窄。其中血管壁平滑肌细胞(SMCs)增生过度是重要原因之一[1]。放疗在临床上可有效治疗良、恶性细胞增殖性疾病，据此，本研究用PTCA导管球囊灌注液相32P，对培养的兔髂动脉SMCs进行不同剂量单次照射，从细胞凋亡方面探讨射线对体外培养动脉SMCs的作用及量效关系。
一、材料和方法
, 百拇医药 1.血管SMCs原代和传代细胞培养：取撕去外膜刮除内膜兔髂动脉一段，剪碎成组织块，移入培养瓶加小牛血清1640培养液培养。待细胞生长形成单层且60%～70%融合时，分装培养瓶传代培养。
2.放射源及照射条件：医用32P，放射性浓度0.74～1 GBq/ml。取0.5 ml 32P液体注入PTCA导管球囊，加压固定使32P在球囊内充盈良好，消毒球囊置于SMCs培养瓶中贴壁照射，照射时间5到20 min，吸收剂量为10～50 Gy，设另一组用生理盐水灌注球囊作为对照。24 h后观察结果。
3.电镜观察：处理过的SMCs PBS洗涤戊二醛覆盖，刮取细胞离心10 min，将细胞沉积物用凝胶包埋锇酸染色，制成薄片电镜下观察。
4.DNA抽提与电泳：处理过的SMCs滴加0.6 ml细胞裂解液，37℃孵育1 h，加入蛋白酶K至终浓度为100 μg/ml孵育1 h取出，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊酸混合液(25∶24∶1)，离心吸取水相的DNA，重复上述操作2次，加5 mmol/L NaCl至终浓度为0.3 mmol/L，混匀后加2.5倍体积的无水冰乙醇离心，移去上清液用乙醇洗涤沉淀2次，取10 μl DNA与2 μl载样液混匀后电泳观察。
, 百拇医药
5.流式细胞仪检测：取处理过的SMCs胰酶消化离心，沉淀物加入冷乙醇4℃固定12 h，调整细胞浓度为1×106个/ml，碘化丙啶(PI)80 μl染色过滤，上机检测。
6.统计学处理：数据用t及直线相关性检验，P<0.05为差异有显著性。
二、结果
1.光镜形态学观察：照射组见梭形SMCs体积缩小变圆，其范围随照射剂量增大而扩大(见表1)。对照组SMCs无变化。
表1 不同吸收剂量对兔髂动脉SMCs凋亡率
和凋亡范围的影响 吸收剂量(Gy)
凋亡率(%)
凋亡范围(mm)
, 百拇医药
10
8.7
3.9
15
30.2
4.9
20
43.1
5.2
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54.5
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62.2
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9.8
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10.8
2.透射电镜观察：对照组正常SMCs细胞内染色质分布均匀，核仁清楚，而照射组受损SMCs胞浆线粒体肿胀，嵴断裂呈空泡状，核染色质断裂浓缩聚集于核膜边缘，细胞膜出芽，为细胞凋亡形态学特征。
3.核酸电泳：照射组SMCs在电泳凝胶上有DNA降解图形。
4.流式细胞仪检测：照射组SMCs可见明显凋亡峰，与对照组比较凋亡率差异有非常显著性〔(58.06±16.98)% vs (4.51±1.15)%，P<0.01〕，且凋亡率随照射剂量增大而增加(见表1)，两者呈正相关(r=0.95,P<0.01)。
三、讨论
再狭窄是一种损伤性反应，其中细胞凋亡不足可能有重要影响[2]，它使SMCs相对增殖、内膜大量形成而使血管重新狭窄。本研究提示射线有可能通过增加血管壁SMCs凋亡，来减少内膜形成而预防再狭窄。
, 百拇医药
本研究用β射线放射源32P，在相对短的时间内一次性照射可促发SMC凋亡。预防再狭窄的放射源有两类：γ射线和β射线，γ射线穿透力强，近距离生物效应差，达到有效照射剂量所需放射源活度大、照射时间长，可能对病人和操作者有辐射影响。而β射线近距离生物效应好，短时间内照射即可获得高剂量率，且穿透力弱无辐射损害，有望成为预防治疗再狭窄的主要选择[3]。
本研究表明随吸收剂量从10 Gy增加到50 Gy，SMCs凋亡率增加，有明显的剂量效应关系。多数实验结果表明，抑制内膜增生的有效剂量为大于10 Gy到20 Gy，抑制效果随剂量增加而增强[5]。本研究亦表明照射剂量的增加也使培养的SMCs细胞凋亡范围直径达10 mm，这样的范围在体内可作用到冠状动脉外膜，而外膜在再狭窄形成中也有影响[5]。
在放射预防血管再狭窄中多采用放射性导丝和放射性支架[3]，前者需将导丝严格放置在目标血管中轴上(尤其在用β射线放射源时)，否则会使局部血管壁受照射剂量不足而达不到抑制内膜增生目的。而放射性支架生产技术要求高，产品有明显的使用时效性，且放射源是永久植入，可能会有远期副作用。而用液相放射源直接灌注球囊中进行照射，方法简便，其紧贴血管壁照射可使整个目标管壁均匀受到照射而易达到有效照射剂量。但不利之处是照射时血管内血流会阻断，照射时间不能太长，提高放射源的浓度可使照射时间缩短[6]。另一不利之处是球囊一旦破裂，放射源会进入体内。选择物理半衰期和生物代谢都较短的放射源及载体，并控制灌注容量为最小(本研究用0.5 ml便可充满扩张球囊)，则能避免这种危害。■]
, 百拇医药
参考文献
[1]Bauters C,Isner JM. The biology of restenosis. Proge Cardiovasc Dis,1997,40:107-116.
[2]Bochaton-Piallat ML,Gabbiani F,Redard M,et al. Apoptosis participates in cellularity regulation during rat aortic intimal thickening. Am J Pathol,1995,146:1059-1064.
[3]Teirstein P. β-radiation to reduce restenosis. Circulation,1997,95:1095-1098.
[4]Robinson KA,Pipes DW,Bibber RV,et al. 186Re-liquid-filled balloon catheter system for endovascular brachytherapy:dose-response efficacy study and biodistribution after coronary injection. Circulation,1998,(SupplI1-I1016):3430-3431.
, http://www.100md.com
[5]Robert L,Wilensky,Keith L,et al. Vascular injury,repair,and restenosis after percutaneous transluminal angioplasty in the atherosclerotic rabbit. Circulation,1995,92:2995-3005.
[6]Amols HI,Reinstein LE,Weinberger J. Dosimeter of a radioactive coronary balloon dilatation catheter for treatment of neointimal hyperplasia. Med Phys,1996,23:1783-1788.
收稿日期:1999-03-15, 百拇医药