低剂量辐射对LAK/TIL培养扩增及抗肿瘤作用的实验研究
作者：刘伟 侯殿俊 乔建维 商希梅 李洁清
单位：济南，山东省医学科学院放射医学研究所 250062
关键词：低剂量；电离辐射；LAK；TIL细胞；扩增；细胞毒性
中华放射医学与防护杂志000111 【摘要】 目的 为了解低剂量电离辐射对LAK/TIL细胞培养扩增及抗肿瘤作用的影响。方法 从荷瘤小鼠的脾脏制得LAK细胞，从荷Lewis肺癌小鼠瘤组织中分离得TIL细胞，给予不同剂量的X射线照射后培养。结果 低剂量电离辐射可增加LAK/TIL细胞的扩增量，降低细胞扩增过程死亡率，并增加细胞毒性。结论 低剂量电离辐射对生物活性细胞不仅有诱导扩增作用，同时亦降低扩增过程细胞死亡率。
Influence of low dose ionizing radiation on
, 百拇医药
amplification and antitumor activity of LAK/TIL cells
LIU Wei HOU Dianjun QIAO Jianwei,et al.
(Institute of Radiation Medicine,Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan 250062,China)
【Abstract】 Objective To study the influence of low dose ionization on amplification and antitumor activity of LAK/TIL cells. Methods TIL cells isolated from Lewis lung cancer tissues and LAK cells from spleen of tumor-bearing mouse were irradiated with different low doses of X-rays and were cultured after irradiation. Results Low dose ionizing radiation improved the amplification volume of LAK/TIL cells,decreased the cell death ratio in amplification process,and increased the toxicity of LAK/TIL cells. Conclusions Low dose ionizing radiation can result in amplification of biologically activated lymphocytes,and decreases the death ratio of the cells in amplification process.
, 百拇医药
【Key words】 Low dose； Ionizing radiation； LAK/TIL cells； Amplification； Cytotoxicity▲
低剂量电离辐射对机体的刺激作用及其机理已有不少报道[1，2]。但低剂量辐射作用于离体的淋巴因子激活的杀伤细胞/肿瘤浸润淋巴细胞(LAK/TIL)后，能否促进LAK/TIL细胞的扩增，增强其抗瘤活性报道较少。本研究就此进行了探讨。
材料和方法
1.实验动物：取C57BL/6小鼠60只，雄性，6～8周龄，体重18～22 g，由中国医学科学院动物繁育场提供。
2.细胞系：淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)来源于荷瘤C57BL/6小鼠的脾脏；肿瘤浸润淋巴细胞(TIL细胞)参照Whiteside方法，将荷Lewis肺癌细胞的C57BL/6小鼠的瘤组织分离剪碎，经0.25%浓度的胰酶消化30 min，过200目钢网得细胞悬液，经不连续密度梯度离心后，取上下两层分离液界面上的细胞悬液即得。
, 百拇医药
3.白细胞介素-2：由上海华新生物高新技术有限公司提供。
4.照射条件：使用PYM-3M型深部X射线治疗机，将分离好的LAK/TIL细胞按照0.65、3.25、16.25、81.25 mGy和0 Gy分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组进行照射，每组3个样品。
5.培养条件及计数方法：将LAK/TIL细胞置于内含小牛血清、RPMI 1640培养液、双抗及白细胞介素2(IL-2)的100 ml培养瓶内，照射后放置37℃、体积分数为5%的CO2孵箱内培养。然后每隔3 d取10 μl混匀，用F-820血球全自动分析仪计数细胞，用台盼蓝染色计数细胞存活率。
6.统计学处理：数据采用t检验及u检验。
结 果
1.低剂量辐射对LAK/TIL细胞培养扩增的影响
, 百拇医药
(1)LAK细胞：结果显示，从第3天LAK细胞开始扩增，第6天达到高峰并保持相对稳定，见表1。
(2)TIL细胞：表2结果显示，受照射的TIL细胞从原始的1.35×105/ml活细胞到第6天开始扩增，12 d时达到高峰，然后渐渐降低，其中Ⅰ、Ⅱ组扩增较好，可达原始细胞数的17.5倍，而对照组扩增量仅为2.5倍。
2.低剂量辐射对LAK/TIL细胞存活率的影响
LAK/TIL细胞经过一段时间培养后，其扩增量逐渐增加，同时细胞的死亡率亦升高。本实验应用台盼蓝染色计数细胞存活率，结果表明，经小剂量照射的Ⅰ、Ⅱ组LAK细胞第9天存活率为50%、51%，第12天为48%、50%，虽低于起始存活率的98%，但仍高于对照组的30%；TIL细胞Ⅰ、Ⅱ组第12、15、18及21天的存活率维持在40%～56%之间，而对照组仅为24%～29%；将LAK/TIL细胞存活率与对照组比较，经u检验，差异有非常显著性(P<0.01)。
, 百拇医药
3.低剂量电离辐射对LAK/TIL细胞抗瘤活性的影响
根据不同剂量X射线照射后对LAK/TIL细胞扩增量及存活率的实验结果，我们设0.65 mGy(Ⅰ组)、3.25 mGy (Ⅱ组)、0 Gy (Ⅲ组) 及空白对照 (Ⅳ组)进行抗肿瘤活性的比较。体外细胞杀伤活性试验采用3H-TdR释放法测定[3]。结果显示，Ⅱ组LAK细胞对自体肿瘤细胞的杀伤活性在36.23%～52.23%之间，Ⅰ、Ⅱ组TIL细胞对自体肿瘤细胞的杀伤活性在56.65%～65.74%之间，与空白对照组的28.36%～34.53%比较，经u检验，差异有非常显著性(P<0.01)。经照射后的LAK/TIL细胞，能延长荷瘤小鼠的生存期达10～20 d。
讨 论
傅强[4]等报道低剂量辐射可增强LAK细胞体外杀伤肿瘤靶细胞的细胞毒性。本实验结果显示，经0.65、3.25 mGy照射的LAK/TIL细胞其扩增速度明显高于其他各组，并保持相对高的存活率，其抗瘤活性亦明显增强。探讨其机理可能为① 在IL-2介导下活化的LAK/TIL细胞分泌内源性IL-2，并通过释放细胞毒颗粒及分泌细胞因子对肿瘤细胞进行直接、间接的杀伤[5]。② 低剂量电离辐射刺激了某些处于休眠状态的细胞，加速其分化增殖，而未影响细胞的内外环境[6]。■
, 百拇医药
表1 不同剂量X射线照射LAK细胞后对其生长的影响(
±s,×105/ml) 组别
LAK细胞数
0 d
3 d
6 d
9 d
12 d
15 d
Ⅰ
1.00±0.10
2.00±0.18
, 百拇医药
4.97±0.24
5.50±0.24
5.00±0.18
4.00±0.16
Ⅱ
1.00±0.10
2.98±0.23
7.01±0.32**
6.98±0.32**
6.50±0.30*
6.00±0.29**
, 百拇医药
Ⅲ
1.00±0.10
2.50±0.22
4.08±0.17
4.32±0.27
4.00±0.21
3.60±0.23
Ⅳ
1.00±0.10
2.72±0.28
2.45±0.20
4.98±0.26
, 百拇医药
3.50±0.19
3.45±0.20
Ⅴ
1.00±0.10
1.78±0.12
4.50±0.18
3.30±0.90
4.51±0.23
3.65±0.19
注：表中所列为活细胞数；与对照组比较，经t检验*P<0.05；**P<0.01表2 不同剂量X射线照射TIL细胞后对其生长的影响(±s,×105/ml) 组别
, http://www.100md.com
TIL细胞数
0 d
3 d
6 d
9 d
12 d
15 d
18 d
21 d
Ⅰ
1.53±0.12
1.88±0.27
3.61±0.54
, 百拇医药
16.50±2.21**
28.60±3.45**
14.2±2.18**
8.51±0.72**
3.80±0.17**
Ⅱ
1.53±0.21
3.50±0.87
8.90±1.10
16.50±2.30**
, 百拇医药
17.20±3.11**
6.30±0.50**
3.60±0.20**
1.80±0.08
Ⅲ
1.53±0.21
1.50±0.10
4.49±0.61
9.50±0.61**
12.0±2.30**
, 百拇医药
6.00±1.56**
1.90±0.31
1.30±0.09
Ⅳ
1.53±0.21
1.40±0.08
9.00±2.10
7.10±1.30**
9.10±2.12**
3.50±0.12**
1.50±0.11
, http://www.100md.com
1.10±0.07
Ⅴ
1.53±0.21
1.30±0.12
3.40±1.33
3.30±0.90
3.80±0.18
1.60±0.06
1.00±0.07
1.20±0.12
注：表中所列为活细胞数；与对照组比较，经t检验**P<0.01基金项目：山东省科委基金资助项目〔(94)197〕
, 百拇医药
参考文献
[1]刘树铮，刘伟宏，齐进，等.低剂量辐射增强免疫的细胞机制.中华放射医学与防护杂志，1992，12：299-305.
[2]刘树铮，刘伟宏，蔡露，等.低剂量辐射刺激作用的实验研究.中华放射医学与防护杂志，1989，9：247-250.
[3]吴厚生，谢琪，姜小玲，等.用3H-TdR释放法测量细胞介导的细胞毒功能.上海免疫学杂志，1987，7：230-232.
[4]傅强，张澜生，朱寿彭，等.低剂量照射对LAK细胞体外杀伤肿瘤靶细胞的影响.中华放射医学与防护杂志，1995，15：321-325.
[5]曹雪涛编.白细胞介素2的基础与临床.北京：北京科学技术出版社，1990.203-260.
[6]刘伟，侯殿俊，乔建维，等.小剂量X射线辐照对生物活性细胞培养扩增的影响.中国辐射卫生，1998，7：170-171.
收稿日期:1999-02-08, 百拇医药
单位：济南，山东省医学科学院放射医学研究所 250062
关键词：低剂量；电离辐射；LAK；TIL细胞；扩增；细胞毒性
中华放射医学与防护杂志000111 【摘要】 目的 为了解低剂量电离辐射对LAK/TIL细胞培养扩增及抗肿瘤作用的影响。方法 从荷瘤小鼠的脾脏制得LAK细胞，从荷Lewis肺癌小鼠瘤组织中分离得TIL细胞，给予不同剂量的X射线照射后培养。结果 低剂量电离辐射可增加LAK/TIL细胞的扩增量，降低细胞扩增过程死亡率，并增加细胞毒性。结论 低剂量电离辐射对生物活性细胞不仅有诱导扩增作用，同时亦降低扩增过程细胞死亡率。
Influence of low dose ionizing radiation on
, 百拇医药
amplification and antitumor activity of LAK/TIL cells
LIU Wei HOU Dianjun QIAO Jianwei,et al.
(Institute of Radiation Medicine,Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan 250062,China)
【Abstract】 Objective To study the influence of low dose ionization on amplification and antitumor activity of LAK/TIL cells. Methods TIL cells isolated from Lewis lung cancer tissues and LAK cells from spleen of tumor-bearing mouse were irradiated with different low doses of X-rays and were cultured after irradiation. Results Low dose ionizing radiation improved the amplification volume of LAK/TIL cells,decreased the cell death ratio in amplification process,and increased the toxicity of LAK/TIL cells. Conclusions Low dose ionizing radiation can result in amplification of biologically activated lymphocytes,and decreases the death ratio of the cells in amplification process.
, 百拇医药
【Key words】 Low dose； Ionizing radiation； LAK/TIL cells； Amplification； Cytotoxicity▲
低剂量电离辐射对机体的刺激作用及其机理已有不少报道[1，2]。但低剂量辐射作用于离体的淋巴因子激活的杀伤细胞/肿瘤浸润淋巴细胞(LAK/TIL)后，能否促进LAK/TIL细胞的扩增，增强其抗瘤活性报道较少。本研究就此进行了探讨。
材料和方法
1.实验动物：取C57BL/6小鼠60只，雄性，6～8周龄，体重18～22 g，由中国医学科学院动物繁育场提供。
2.细胞系：淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)来源于荷瘤C57BL/6小鼠的脾脏；肿瘤浸润淋巴细胞(TIL细胞)参照Whiteside方法，将荷Lewis肺癌细胞的C57BL/6小鼠的瘤组织分离剪碎，经0.25%浓度的胰酶消化30 min，过200目钢网得细胞悬液，经不连续密度梯度离心后，取上下两层分离液界面上的细胞悬液即得。
, 百拇医药
3.白细胞介素-2：由上海华新生物高新技术有限公司提供。
4.照射条件：使用PYM-3M型深部X射线治疗机，将分离好的LAK/TIL细胞按照0.65、3.25、16.25、81.25 mGy和0 Gy分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组进行照射，每组3个样品。
5.培养条件及计数方法：将LAK/TIL细胞置于内含小牛血清、RPMI 1640培养液、双抗及白细胞介素2(IL-2)的100 ml培养瓶内，照射后放置37℃、体积分数为5%的CO2孵箱内培养。然后每隔3 d取10 μl混匀，用F-820血球全自动分析仪计数细胞，用台盼蓝染色计数细胞存活率。
6.统计学处理：数据采用t检验及u检验。
结 果
1.低剂量辐射对LAK/TIL细胞培养扩增的影响
, 百拇医药
(1)LAK细胞：结果显示，从第3天LAK细胞开始扩增，第6天达到高峰并保持相对稳定，见表1。
(2)TIL细胞：表2结果显示，受照射的TIL细胞从原始的1.35×105/ml活细胞到第6天开始扩增，12 d时达到高峰，然后渐渐降低，其中Ⅰ、Ⅱ组扩增较好，可达原始细胞数的17.5倍，而对照组扩增量仅为2.5倍。
2.低剂量辐射对LAK/TIL细胞存活率的影响
LAK/TIL细胞经过一段时间培养后，其扩增量逐渐增加，同时细胞的死亡率亦升高。本实验应用台盼蓝染色计数细胞存活率，结果表明，经小剂量照射的Ⅰ、Ⅱ组LAK细胞第9天存活率为50%、51%，第12天为48%、50%，虽低于起始存活率的98%，但仍高于对照组的30%；TIL细胞Ⅰ、Ⅱ组第12、15、18及21天的存活率维持在40%～56%之间，而对照组仅为24%～29%；将LAK/TIL细胞存活率与对照组比较，经u检验，差异有非常显著性(P<0.01)。
, 百拇医药
3.低剂量电离辐射对LAK/TIL细胞抗瘤活性的影响
根据不同剂量X射线照射后对LAK/TIL细胞扩增量及存活率的实验结果，我们设0.65 mGy(Ⅰ组)、3.25 mGy (Ⅱ组)、0 Gy (Ⅲ组) 及空白对照 (Ⅳ组)进行抗肿瘤活性的比较。体外细胞杀伤活性试验采用3H-TdR释放法测定[3]。结果显示，Ⅱ组LAK细胞对自体肿瘤细胞的杀伤活性在36.23%～52.23%之间，Ⅰ、Ⅱ组TIL细胞对自体肿瘤细胞的杀伤活性在56.65%～65.74%之间，与空白对照组的28.36%～34.53%比较，经u检验，差异有非常显著性(P<0.01)。经照射后的LAK/TIL细胞，能延长荷瘤小鼠的生存期达10～20 d。
讨 论
傅强[4]等报道低剂量辐射可增强LAK细胞体外杀伤肿瘤靶细胞的细胞毒性。本实验结果显示，经0.65、3.25 mGy照射的LAK/TIL细胞其扩增速度明显高于其他各组，并保持相对高的存活率，其抗瘤活性亦明显增强。探讨其机理可能为① 在IL-2介导下活化的LAK/TIL细胞分泌内源性IL-2，并通过释放细胞毒颗粒及分泌细胞因子对肿瘤细胞进行直接、间接的杀伤[5]。② 低剂量电离辐射刺激了某些处于休眠状态的细胞，加速其分化增殖，而未影响细胞的内外环境[6]。■
, 百拇医药
表1 不同剂量X射线照射LAK细胞后对其生长的影响(
±s,×105/ml) 组别LAK细胞数
0 d
3 d
6 d
9 d
12 d
15 d
Ⅰ
1.00±0.10
2.00±0.18
, 百拇医药
4.97±0.24
5.50±0.24
5.00±0.18
4.00±0.16
Ⅱ
1.00±0.10
2.98±0.23
7.01±0.32**
6.98±0.32**
6.50±0.30*
6.00±0.29**
, 百拇医药
Ⅲ
1.00±0.10
2.50±0.22
4.08±0.17
4.32±0.27
4.00±0.21
3.60±0.23
Ⅳ
1.00±0.10
2.72±0.28
2.45±0.20
4.98±0.26
, 百拇医药
3.50±0.19
3.45±0.20
Ⅴ
1.00±0.10
1.78±0.12
4.50±0.18
3.30±0.90
4.51±0.23
3.65±0.19
注：表中所列为活细胞数；与对照组比较，经t检验*P<0.05；**P<0.01表2 不同剂量X射线照射TIL细胞后对其生长的影响(
±s,×105/ml) 组别, http://www.100md.com
TIL细胞数
0 d
3 d
6 d
9 d
12 d
15 d
18 d
21 d
Ⅰ
1.53±0.12
1.88±0.27
3.61±0.54
, 百拇医药
16.50±2.21**
28.60±3.45**
14.2±2.18**
8.51±0.72**
3.80±0.17**
Ⅱ
1.53±0.21
3.50±0.87
8.90±1.10
16.50±2.30**
, 百拇医药
17.20±3.11**
6.30±0.50**
3.60±0.20**
1.80±0.08
Ⅲ
1.53±0.21
1.50±0.10
4.49±0.61
9.50±0.61**
12.0±2.30**
, 百拇医药
6.00±1.56**
1.90±0.31
1.30±0.09
Ⅳ
1.53±0.21
1.40±0.08
9.00±2.10
7.10±1.30**
9.10±2.12**
3.50±0.12**
1.50±0.11
, http://www.100md.com
1.10±0.07
Ⅴ
1.53±0.21
1.30±0.12
3.40±1.33
3.30±0.90
3.80±0.18
1.60±0.06
1.00±0.07
1.20±0.12
注：表中所列为活细胞数；与对照组比较，经t检验**P<0.01基金项目：山东省科委基金资助项目〔(94)197〕
, 百拇医药
参考文献
[1]刘树铮，刘伟宏，齐进，等.低剂量辐射增强免疫的细胞机制.中华放射医学与防护杂志，1992，12：299-305.
[2]刘树铮，刘伟宏，蔡露，等.低剂量辐射刺激作用的实验研究.中华放射医学与防护杂志，1989，9：247-250.
[3]吴厚生，谢琪，姜小玲，等.用3H-TdR释放法测量细胞介导的细胞毒功能.上海免疫学杂志，1987，7：230-232.
[4]傅强，张澜生，朱寿彭，等.低剂量照射对LAK细胞体外杀伤肿瘤靶细胞的影响.中华放射医学与防护杂志，1995，15：321-325.
[5]曹雪涛编.白细胞介素2的基础与临床.北京：北京科学技术出版社，1990.203-260.
[6]刘伟，侯殿俊，乔建维，等.小剂量X射线辐照对生物活性细胞培养扩增的影响.中国辐射卫生，1998，7：170-171.
收稿日期:1999-02-08, 百拇医药