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编号:10267290
苯甲酸雌二醇对辐射诱导免疫细胞凋亡的影响
http://www.100md.com 《中华放射医学与防护杂志》 2000年第2期
     作者:吴玮 杨如俊 孔宪涛 张玲珍 李伯龙 蔡建明

    单位:吴玮(100101 北京,解放军第三零六医院);杨如俊 孔宪涛 张玲珍 李伯龙 蔡建明(第二军医大学)

    关键词:苯甲酸雌二醇;辐射损伤;细胞凋亡;免疫细胞

    中华放射医学与防护杂志000208 【摘要】 目的 观察苯甲酸雌二醇对60Coγ射线引起的小鼠胸腺、脾脏细胞凋亡率的影响及脾脏T、B淋巴细胞表面分子表达的改变,探讨其对小鼠免疫细胞凋亡的调节作用及其作用机理。方法 采用60Coγ射线4 Gy单次全身照射,用DNA琼脂糖凝胶电泳、PI染色及双荧光流式细胞术研究小鼠免疫细胞凋亡,细胞表面CD95、CD25、CD69的表达变化规律。结果 注射照射组各细胞亚群凋亡率较单纯照射组明显降低,照射后4 h未出现照射组所呈现的CD95高表达。射线使脾脏细胞CD25和CD69表达升高,而注射照射组未观察到CD25和CD69的高表达。结论 苯甲酸雌二醇可阻断免疫细胞的激活进而阻断Fas(CD95)系统介导的细胞凋亡途径。
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    Effects of estradiol on radiation-induced apoptosis in immunocytes of mouse

    WU Wei,YANG Rujun,KONG Xiantao,et al.

    (PLA 306th Hospital,Beijing 100101,China)

    【Abstract】 Objective To assess the effects of estradiol on 60Coγ-radiation induced apoptosis of splenic lymphocytes and thymocytes,and surface molecule expression of splenic lymphocytes. Methods Mice were whole body irradiated with 4.0 Gy γ-rays. By flow cytometry and electrophoretic analysis of DNA, the changes in apoptosis of mouse immunocytes were determined. The splenic lymphocytes were analyzed by flow cytometry with fluorescent monoclonal antibodies. Results 10 days after administration of estradiol, the characteristic DNA ladder in mice 8h after irradiation was minor than in mice without estradiol administration,indicating that the apoptotic rate reduced on flow cytometry. CD4+ T cells,CD8+ T cells and IgM+ B cells upregulated Fas,CD25 and CD69 expression,but did not so in the estradiol treated mice. Conclusion Estradiol can block CD25,CD69 and Fas overexpression,thereby inhibiting Fas mediated apoptosis inducedby γ-irradiation.
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    【Key words】 Radiation injury; Apoptosis; Immunocytes; Estradiol

    雌激素的辐射防护作用国内外早有报道[1],诸多学者曾对苯甲酸雌二醇的升白细胞作用,抗辐射效价,用药时间与剂量的有效范围以及药物代谢等方面进行了比较系统的观察,证明苯甲酸雌二醇不仅对小鼠预防有效,而且,照后用药也有良好疗效。同时证明产生此种防护作用与保护造血细胞,促使粒系细胞提前恢复有密切关系[2-4]。在上海“6.25”事故受照者的救治中,也证实了苯甲酸雌二醇的临床治疗效果[5]。目前其分子水平的作用机理的研究未见报道。作者通过实验观察用药组小鼠胸腺、脾脏细胞凋亡率的变化及脾脏T、B淋巴细胞表面分子表达的改变,进一步认识该药对免疫器官细胞凋亡的调节作用,并研究其作用机理。

    材料和方法

    1.动物和分组:昆明种小鼠,雄性,体重20±2 g,第二军医大学动物实验中心提供。随机分为对照组、注射组、4 Gy照射组和注射照射组。
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    2.照射条件:采用60Co γ射线,单次全身照射,吸收剂量率为1.5 Gymin-1,总吸收剂量4 Gy。

    3.主要试剂:苯甲酸雌二醇1 mg/ml(上海第九制药厂),中性油,PBS(pH 7.4),台盼蓝,4%多聚甲醛,Triton X-100。细胞培养液:DMEM(GIBCO公司),新生牛血清,体积分数为0.15由杭州四季青生物工程材料研究所提供,单克隆抗体:anti-mouse CD4-FITC,anti-mouse CD8-FITC (Sigma 美国),anti-mouse IgM-FITC,anti-mouseCD95,anti-mouseCD25,anti-mouse CD69(Phar Mingen美国),羊抗大鼠的FITC和PE的IgG抗体购自华美公司。

    4.给药方法:小鼠大腿肌肉注射,注射药物剂量0.1 mg/只。给药时间及与照射的时间关系见说明。
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    5.单细胞悬液的制备:小鼠眼球放血,断颈,取脾脏、胸腺组织,分别用PBS冲洗,研磨过200目尼龙网制得单细胞悬液,加入Ficoll淋巴细胞分离液(比重:1.087)中,离心,4000rmin-

    1,20 min,取单核细胞层,离心、计数调整细胞浓度为2×107/ml备用;一部分加台盼蓝计数活细胞。

    6.单克隆荧光抗体的标记及流式细胞仪检测:应用凋亡细胞可经流式细胞仪测定前向(FSC)及侧向光散射(SSC)与非凋亡细胞相区分,前向光散射的减少和90度侧向散射的增加,可反映凋亡过程中的改变,最大程度反映染色质和核酸片断的密度[6,7],测定细胞凋亡率;同时用双色免疫荧光分析淋巴细胞亚群的细胞凋亡的变化。将每份样品取200 μl细胞悬液(2×106个细胞)在室温下固定于4%多聚甲醛的PBS溶液中20 min,于0.1%Triton-100的Tris缓冲液(含新生牛血清白蛋白体积分数为0.001)浸透5 min[7],PBS冲洗3次,细胞与FITC标记的抗体作用45 min,PBS洗后加PI或加PE标记的抗体,45 min后PBS清洗上机检测。进行FCM多参数分析,计数5 000以上细胞,数据软件分析。
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    7.DNA裂解片断的测定参阅文献[8]

    8.统计学处理:t检验,数据以±s表示。

    结 果

    1.凝胶电泳分析细胞凋亡

    图1,2示苯甲酸雌二醇对4 Gy γ射线诱导的胸腺、脾脏细胞的凋亡有明显的抑制作用。图1中可见胸腺细胞注射照射组与照射组和中性油对照组比较DNA片段明显减少。脾脏细胞的注射照射组和照射注射组的DNA片段较正常对照组明显减少(图2)。单独注射组在注射后8~12 h及7~10 d的脾脏细胞有细胞凋亡的梯状条带(图3)。

    2.小鼠脾脏淋巴细胞亚群细胞凋亡率及CD95阳性细胞表达的变化
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    小鼠脾脏细胞注射苯甲酸雌二醇组在照射后8 h的细胞凋亡率为25%,明显低于单纯照射组的细胞凋亡率(51%),检测结果经统计学处理差异有非常显著性(P<0.01,n=4,图4)。CD4+T细胞、CD8+T细胞及IgM+B细胞注射苯甲酸雌二醇照射后的细胞凋亡率均较未注射组下降,凋亡率两者比较差异均有非常显著性(P<0.01),3种淋巴细胞亚群的细胞凋亡率减少倍数基本相近(表1)。各组淋巴细胞亚群CD95阳性细胞表达的变化见图5。注射照射组CD95的表达在照后8 h,即照射组表达明显升高的时相未见升高,CD95的表达较正常对照组稍低。

    图1

    图2
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    图1 4Gy照射后各组胸腺细胞的DNA凝胶电泳图A:注射苯甲酸雌二醇10 d,照射后4 h;B:照射后4 h;C:注射中性油照射后4 h;D:正常对照

    图2 4Gy照射后各组脾脏细胞DNA凝胶电泳图

    A:注射苯甲酸雌二醇10 d,照射后4 h;B:照射后4 h; C:注射后即注射苯甲酸雌二醇4 h;D:正常对照

    图3 注射苯甲酸雌二醇后脾脏细胞凋亡的凝胶电泳图

    A~H分别为注射后1、2、4、12和24 h、3、7及10 d

    表1 注射照射组和照射组照后4 h的CD4+T细胞、CD8+T细胞及IgM+B细胞凋亡率 组 别
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    PCD细胞(%)

    (CD8+)T细胞

    (CD4+)T细胞

    (IgM+)B细胞

    单纯照射组

    13.21±2.15

    8.97±1.08

    31.27±1.46

    注射后照射组

    5.13±0.35

    2.34±1.51
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    14.86±1.73

    注:表内数值为PI测得的DNA含量。是3个脾脏组织经6次检测获得数据。各组凋亡率之间统计学处理差异有非常显著性,P<0.01

    图4 注射照射组和照射组脾脏淋巴细胞照射后4 h的细胞凋亡率(%)

    左边为FSC相对SSC的直方图;右边为PI测得的DNA含量。3个脾脏组织经6次检测获得数据,照射组为45.47±1.67;注射照射组为23.20±2.1,P<0.01

    图5 各组小鼠脾脏淋巴细胞亚群照射后4 h CD95分子的表达

    3.各组脾脏细胞表面活化因子的表达
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    各组脾脏细胞照后4 h CD25、CD69表面分子的表达变化见表2。照射组CD25及CD69的表达较正常组明显升高,而注射照射组两种分子的表达无升高现象。

    表2 各组小鼠4Gy照射后4 h脾脏淋巴细胞CD25、CD69的表达 组 别

    表面分子

    CD25

    CD69

    正常对照组

    2.13±0.02

    26.71±2.12

    单纯照射组

    32.87±4.65
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    57.23±3.98

    注射后照射组

    2.98±1.02**

    20.12±1.47**

    注:注射照射组为注射苯甲醇雌二醇10 d后注射,所示数据为3个脾脏组织6次检测获得;注射照射组与照射组比较,**P<0.01讨 论

    雌激素类药物对造血系统的作用已被许多学者肯定,对外周血淋巴细胞的辐射防护作用也有所研究,我们的实验表明苯甲酸雌二醇可明显降低小鼠脾脏T、B淋巴细胞的辐射敏感性,照前、照后用药脾脏细胞的凋亡率均显著下降,凝胶电泳显示DNA片断明显减少,说明其对免疫器官淋巴细胞有显著的辐射防护作用。

    作者以往研究发现[9],辐射诱发的淋巴细胞的凋亡,通过激活淋巴细胞而凋亡是较为重要的途径,而激活诱导的凋亡主要是由于CD95与CD95配体的相互作用所致,本实验表明小鼠淋巴细胞亚群辅助T细胞(CD4+T细胞)、抑制性/细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)及B细胞(IgM+B细胞)照射后4 h细胞表面分子CD95表达升高,而注射苯甲酸雌二醇的小鼠脾脏细胞亚群凋亡率明显降低,未出现CD95的高表达,相反由于细胞凋亡表达相对减少。这充分表明辐射后脾脏细胞发生了Fas(CD95)系统介导的凋亡,而苯甲酸雌二醇正是由于阻断这个途径,细胞凋亡率显著减少。因为CD25主要是T细胞活化的标志,CD69+细胞是活化T、B细胞的标志,为进一步说明苯甲酸雌二醇的辐射防护作用是通过阻断淋巴细胞的激活途径而实现的,我们同时观察了这两种T、B细胞激活的相关表面分子,结果显示,射线使脾脏细胞CD25和CD69表达升高,而注射苯甲酸雌二醇的小鼠脾脏细胞没有观察到由于射线损伤DNA而激活的细胞表面分子CD25和CD69的高表达,提示射线致脾脏细胞CD95高表达的同时CD25和CD69均高表达,说明辐射致免疫器官淋巴细胞的凋亡是通过激活途径进行的。而苯甲酸雌二醇是阻断了淋巴细胞通过上述表面分子激活的途径,从而减少了由于激活而凋亡的细胞。
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    Fas系统功能的研究正在不断深入,Fas介导凋亡的下一级信号,近来进行了颇有意义的研究,认为神经酰胺很可能是凋亡启动的一个共同的第二信使,在凋亡信号传导中起主要作用。Chmura等报道[10]细胞和组织中基因扣除神经鞘磷脂的鼠及神经鞘磷脂产物—神经酰胺丢失,可对抗射线诱导的凋亡,而外源性神经酰胺可恢复细胞对射线诱导凋亡的应答,提示Fas、FasL结合,通过神经鞘磷脂酶的活化,使神经鞘磷脂分解,产生神经酰胺,从而激活一系列神经酰胺依赖性蛋白激酶,启动了胞内磷酸化过程,最终导致DNA降解细胞凋亡。CD25是IL-2R,研究表明IL-2R与血浆蛋白结合可促进CD95的表达[11],即CD25高表达也是通过CD95的途径介导凋亡。只不过CD25的高表达是Fas途径的上游事件。CD69是T、B细胞活化的最早期标志,又称为活化诱导分子,那么,CD69的高表达是否也促进CD95的高表达,进而通过该途径引起凋亡,尚待进一步探讨。

    实验中同时观察了苯甲酸雌二醇本身对脾脏细胞凋亡的影响,发现在用药后两个时间段(见图4)均引起淋巴细胞少量凋亡,该凋亡时相与射线引起的凋亡时相相符,提示是否有这样一种机理存在,即雌激素引起凋亡在凋亡峰值范围内,细胞处于应答不应期,这时接受射线照射细胞不应答,所以不引起激活,其机理有待探讨。
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    参考文献

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    (收稿日期:1999-03-20), 百拇医药