裂变中子诱导小鼠胸腺细胞凋亡的剂量效应
作者：苑宾 李梁 薛文成 孙建民 王宝勤
单位：苑宾 李梁 王宝勤(100850 北京放射医学研究所)；孙建民 薛文成(沈阳军区总医院检验科)
关键词：裂变中子；γ射线；胸腺细胞；细胞凋亡；RBE
中华放射医学与防护杂志000205 【摘要】 目的 研究核反应堆裂变中子诱导小鼠胸腺细胞凋亡的剂量效应，并与60Co γ射线的效应相比较，探讨两种辐射诱导细胞凋亡的异同。方法 用光镜和电镜形态学观察与DNA琼脂糖凝胶电泳方法对细胞凋亡进行定性研究；用流式细胞术(FCM)和二苯胺(DPA)法对其进行定量研究。结果 小鼠经裂变中子0.5～5.0 Gy照射后6 h，可检测到胸腺细胞的DNA ladder，光镜及电镜下可观察到胸腺细胞典型的凋亡形态，且其凋亡比例随着照射剂量的增高而增加；γ射线1.0～30 Gy照射后6 h，也都检测到胸腺细胞的DNA ladder，其凋亡比例随剂量增高而增加，20 Gy左右达到峰值，剂量再高，其凋亡比例不再增加。结论 0.5～5.0 Gy的裂变中子或1.0～30 Gy的γ射线照射小鼠，均可引起胸腺细胞发生凋亡，且随剂量的变化规律相似；但裂变中子诱导小鼠胸腺细胞凋亡的效应高于γ射线，其RBE值约为2.09(FCM法)或2.37(DPA法)。表明中子对小鼠免疫组织的损伤在照射后几小时就比γ射线重，这可能是后期免疫组织损伤较重的基础。
, 百拇医药
Dose-effect relationship of apoptosis induced by fission-neutron in murine thymocytes
YUAN Bin,LI Liang,XUE Wencheng, et al.
(Institute of Radiation Medicne,Beijing 100850 China)
【Abstract】 Objective To investigate the effectiveness of high LET fission-neutron to induce apoptosis in murine thymocytes and to compare it with that of low LET 60Co γ-ray. Methods Apoptosis induction was studied qualitatively by light and transmission electron microscopy and DNA gel electrophoresis,also quantitatively by flow cytometry(FCM) and diphenylamine (DPA)methods. Results DNA ladders of murine thymocytes were detectable,the typical apoptosis of thymocytes could be observed morphologically by means of light and electron microscopy at 6 h after fission-neutron irradiation with doses ranging from 0.5 to 5.0 Gy,meanwhile the percentages of apoptosis increased with increasing doses.After exposure to γ-rays with doses ranging from 1.0 to 30 Gy,the expermiental results were similar to those from neutron radiation.The incidence of apoptosis peaked at about 20 Gy，the percentages did not increase further when doses increased. Conclusion Apoptosis of murine thymocytes can be induced when mice are exposed to either fission-neutron (0.5-5.0 Gy) or to γ-ray (1-30 Gy).Although the relationship between apoptosis and radiation doses is similar,the percentage of apoptosis induced by neutron irradiation is higher than that induced by γ-irradiation.The RBE values of fission-neutron for inducing apoptosis murine thymocytes are 2.09 (by FCM method) and 2.37 (by DPA method),respectively.These results also suggest that fission-neutron-induced murine immune tissue is more severe than that induced by γ-rays at several hours post-irradiation and this might be the basis for heavy damage to immune tissues induced by fission-neutron-irradiation in later period.
, 百拇医药
【Key words】 Fission neutrons; γ-rays； Thymocytes; Apoptosis; RBE
辐射诱导细胞凋亡的研究，已成为当今分子放射生物学研究领域的热点。人们对X射线、γ射线等低传能线密度(linear energy transfer，LET)辐射诱导细胞凋亡及其分子机理进行了较多的研究[1-4]，而对高LET辐射，如裂变中子诱导细胞凋亡研究得较少[4-6]。国内还未见报道。由于辐射品质不同，裂变中子诱导细胞凋亡的变化规律可能与低LET辐射有所不同。为此，本文对核反应堆裂变中子诱导小鼠胸腺细胞凋亡的剂量变化规律进行了探讨，并与60Co γ射线的作用比较，得到中子诱导小鼠胸腺细胞凋亡作用的RBE值，加深了对中子损伤的作用特点的认识。
材料和方法
1.材料
, http://www.100md.com
(1)实验动物：6～8周龄健康C57BL/6J雄性小鼠，体重(18±2)g,由本院实验动物中心提供。
(2)照射条件：裂变中子照射源为清华大学核能技术设计研究院核反应堆，反应堆功率50 kW或10 kW，中子平均能量为1.43 MeV，剂量率30.5 cGy/min或6.1 cGy/min，总剂量中γ剂量占10% 。γ射线照射源为本所60Co γ射线源，剂量率约1.2 Gy/min。
(3)试剂：Tris购自USB公司；碘化丙啶(PI)、溴化乙啶(EB)、Triton X-100购自Sigma公司；NP-40购自Fluka公司；琼脂糖购自Promega公司；RNase A为Calbiochem公司产品；其余均为国产分析纯试剂。
2.方法
(1)形态学观察：光镜观察采用常规石蜡切片，H.E.染色，光镜下观察，以每1 000个胸腺细胞中的凋亡细胞数目作为凋亡指数，每样品至少计数5个不同视野；小鼠胸腺组织块经戊二醛、锇酸固定，再经脱水、包埋、修块、超薄切片、电子染色后于EM400T型(Philips公司)透射电镜下观察并拍照。
, http://www.100md.com
(2)胸腺细胞悬液的制备：断头活杀小鼠，取其胸腺，加PBS(pH 7.2)轻轻研磨后，过一次200目钢网与尼龙网，再经PBS漂洗，Tris-NH4Cl(pH 7.2)溶解红细胞，800 r/min离心10 min收集细胞，最后用PBS调整细胞浓度约为107/ml，0.2%台盼蓝计数细胞活力。
(3)DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳：DNA的提取参考文献[7]，略有改动。取适量DNA样品及Maker(DL 2000,Takara公司)于1.0%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ml的EB)、0.5×TBE、2 V/cm的条件下电泳1～2 h。紫外灯下观察并拍照。
(4)流式细胞术(FCM)检测：取胸腺细胞约106个，70%乙醇固定，4℃过夜，2 000 r/min离心15 min，PBS调整细胞浓度约106/ml，加入终浓度为200 μg/ml的RNase A，37℃水浴30min，加入终浓度为50 μg/ml的PI染液(含0.2%的Triton X-100及0.9%的NaCl)，置4℃避光染色30 min。然后，于FACS Calibur型流式细胞仪(B.D.公司)测试，激发光波长488 nm，每样品计数1×104个细胞，用ModFit LT 2.0版软件进行结果分析。
, http://www.100md.com
(5)二苯胺(DPA)法测定：参考文献[1]稍加改动。
(6)统计学分析：数据以
±s表示，经t检验判断组间差异。
结 果
1.裂变中子诱导小鼠胸腺细胞凋亡的形态特征
小鼠胸腺的组织切片经H.E.染色，光镜下观察到：正常小鼠的胸腺，凋亡细胞很少，细胞分布均匀，染色质散在分布，核仁可见，裂变中子0.5 Gy～5 Gy照射后6 h，在小鼠的胸腺组织中可看到多种形态的凋亡细胞，如核浓缩，边集，进而成块状、环状、戒指状和月牙状等。此外，还发现靠近胸腺组织表面的细胞发生凋亡的比例较高。
电镜下观察到凋亡细胞结构完整，可清楚地看到完整的线粒体及质膜，而胞核明显浓缩成块状等，还观察到了凋亡小体(图1)。这些特征有别于坏死细胞，表明裂变中子诱导胸腺细胞间期死亡的主要形式是凋亡。
, 百拇医药
图1 裂变中子3.0 Gy照射后6 h，小鼠胸凋亡细胞的透射电镜形态。凋亡细胞体积缩小，核固缩、边集，质膜完整，线粒体清晰可见，细箭头示意凋亡细胞，粗箭头示意正常细胞，电子染色 ×8000
2.凋亡细胞的生化特征
DNA琼脂糖凝胶电泳显示，0.5～5.0 Gy的裂变中子照射后6 h，均检测到小鼠胸腺细胞“梯状条带”(DNA ladders)(图2)；1～30 Gy的γ射线照射小鼠6 h后亦观察到各组的“梯状条带”。说明在此剂量范围内的裂变中子与γ射线均可诱导小鼠胸腺细胞产生凋亡。
3.裂变中子照射所致胸腺细胞凋亡的剂量效应
图2 裂变中子照射后的小鼠胸腺细胞
, 百拇医药
DNA电泳图谱
FCM测定的结果显示，0.5～5.0 Gy的裂变中子照射后6 h，小鼠胸腺细胞凋亡比例随剂量的增高而增加。正常小鼠胸腺细胞仅有2.45%的细胞自发凋亡，当受到剂量分别为0.5、1.0、2.5、5.0 Gy的中子照射后，其凋亡比例依次为7.68%、12.05%、26.8%、32.4%。同时，以光镜下观察计数结果求得的凋亡指数也显示出相似的变化规律；DPA法可快速、简便地测出细胞DNA片段的含量，以此可反映凋亡细胞所占的比例，该法测定的结果也表明，不高于5 Gy的裂变中子照射后6 h，小鼠胸腺细胞凋亡的比例呈线形增加趋势，且与未照射组相比差异都有显著性(表1)。
表1 不同剂量裂变中子照射后胸腺细胞凋亡变化 照射剂量
(Gy)
DPA法
, http://www.100md.com 凋亡比例(%)
光镜观察计数
凋亡指数(%)
0
5.48±1.14
2.46±0.42
1
11.43±0.54*
8.45±2.35*
2
19.29±3.51*
16.75±4.13*
, http://www.100md.com
3
26.86±1.80*
23.17±9.11*
4
38.70±1.36*
33.44±10.85*
5
44.91±0.66*
44.24±6.39*
注：与对照组相比，*P<0.01 4.γ射线照射所致胸腺细胞凋亡的剂量效应
, 百拇医药
FCM测定的结果表明，不同剂量的γ射线照射后6 h，小鼠胸腺细胞凋亡比例随剂量的增高而增加，当剂量高于15～20 Gy时，凋亡细胞比例不再增加。DPA法测定的结果与FCM检测基本一致(图3)。从图3看出，高于20 Gy的γ射线照射，小鼠胸腺细胞凋亡比例反而呈下降趋势。
图3 不同剂量的γ射线照射后胸
腺细胞凋亡比例变化
讨 论
细胞凋亡研究近年来成了生命科学领域研究的热点之一。由于核工业的不断发展、核武器潜在威胁的存在、临床肿瘤放疗的深入及意外辐射事故的发生，辐射诱发的细胞凋亡引起了放射生物学家与肿瘤学家的高度重视[2]。淋巴细胞，胸腺细胞和小肠隐窝细胞等对电离辐射敏感，受照后引起间期死亡或增殖死亡，在一定的剂量范围内表现为凋亡死亡，过高剂量则表现为细胞坏死[2，3]。
, http://www.100md.com
本文以60Co γ射线为参比射线，采用形态观察、DNA电泳及FCM等方法，对裂变中子诱导小鼠胸腺细胞的凋亡进行了研究。根据时间-效应，选取不同剂量照射后6 h活杀小鼠进行剂量-效应研究。结果发现，0.5～5.0 Gy的裂变中子照射后6 h，均在DNA电泳图谱上检测到DNA ladders，且在光镜特别是电镜下观察到小鼠胸腺细胞凋亡的典型形态，说明在此剂量范围内的裂变中子照射引起的小鼠胸腺细胞死亡以凋亡为主；同时发现，骨髓、脾脏和肠系膜淋巴结细胞也都发生了凋亡死亡，而心、肝、肾等组织未见凋亡(另文发表)，表明造血与免疫组织对辐射非常敏感[5]，对其防护是提高动物存活及其质量的关键。
研究还发现，裂变中子诱导小鼠胸腺细胞凋亡的效应高于γ射线，将用DPA法得到的剂量-效应曲线(图3)的上升部分的剂量和凋亡比例，以及表1中的剂量和凋亡比例分别进行直线回归，得到的回归方程为Y=3.9780+8.1870X(裂变中子，r=0.9922)与Y=6.3300+3.2760X(γ射线，r=0.9924)，据此可计算出50%细胞凋亡的对应剂量(X)，中子为5.62 Gy，γ射线为13.33 Gy。从而得到裂变中子引起50%胸腺细胞凋亡的RBE值为2.37。同理，依据FCM法求得的RBE值则为2.09。二者均大于2，与较后期胸腺重量减轻、细胞数量减少等的RBE值接近。据此推测较小剂量到中等剂量的裂变中子照射后几小时内，发生凋亡的胸腺细胞的数目要高于γ射线照射，凋亡细胞被吞噬、清除，是照后24 h或较后期的胸腺重量减轻及细胞数量减少等RBE值较高的原因，这可能就是裂变中子对免疫组织损伤较重的基础。
, 百拇医药
裂变中子诱导小鼠胸腺细胞凋亡的RBE值高于2，表明LET对辐射诱导凋亡效应有较显著作用。Hendry等人[4]研究得到中子诱导的小肠隐窝细胞凋亡与γ射线相比的RBE值约为3～4；最近Meijer等人[5]利用AO荧光染色法及细胞体积测量法，比较研究了14N离子加速器产生的中子与137Cs γ射线诱导人外周血淋巴细胞凋亡的效应，得到的RBE值介于1.3～3.0之间，且有时间依赖性。这些都进一步支持了上述看法，但也有学者研究得到快中子诱导体外小鼠胸腺细胞凋亡的RBE值为1.0[6]。因此，辐射诱导细胞凋亡的效应也不完全与LET成正比，这主要受中子的能量，辐射剂量及混合辐射中γ成分的多少等因素的影响。
裂变中子诱导细胞凋亡的效应高于γ射线，但在低于中高剂量的裂变中子或γ射线照射后，胸腺细胞的凋亡比例随剂量的增高而增加的趋势是一致的；过高剂量的γ射线照射后，胸腺细胞的凋亡比例不再明显增加。由于中子照射的条件所限，高于5 Gy的中子照射还未取得实验结果，其诱导细胞凋亡的规律及其机理，尚待进一步的研究。
, 百拇医药
参考文献
1，Mathieu J,Ferlat S,Ballester B,et al.Radiation-induced apoptosis in thymocytes:inhibition by diethylithiocarbamate and zinc.Radiat Res,1996,146：652-659.
2，Blank KR,Rudoltz MS,Kao JD, et al.The molecular regulation of apoptosis and implications for radiation oncology.Int J Radiat Biol,1997,71:455-466.
3，Kawai H,Kitamura Y,Nikaido O.et al.Isolation and characterization of apoptosis-resistant mutant from a radiosensitive mouse lymphoma cell line.Radiat Res,1998,149:41-51.
, 百拇医药
4，Hendy JH,Potten CS,Merrit A.Apoptosis induced by high-and low-LET radiation.Radiat Environ Biophys, 1995,34:59-62.
5，Meijer AE,Kronqvist USE,Lewensohn,et al.RBE for the induction of apoptosis in human peripheral lymphocytes exposed in vitro to high-LET radiation generated by accelerated nitrogen ions.Int J Radiat Biol,1998,73:169-177.
6，Warenius HM, Down JD.RBE of fast neutrons for apoptosis in mouse thymocytes.Int J Radiat Biol,1995,68,625-629.
7，John SMW,Weitzner G,Rozen R,et al.A rapid procedure for extracting genomic DNA from leukocytes.Nucleic Acids Res,1991,19:108.
(收稿日期:1999-02-02), 百拇医药
单位：苑宾 李梁 王宝勤(100850 北京放射医学研究所)；孙建民 薛文成(沈阳军区总医院检验科)
关键词：裂变中子；γ射线；胸腺细胞；细胞凋亡；RBE
中华放射医学与防护杂志000205 【摘要】 目的 研究核反应堆裂变中子诱导小鼠胸腺细胞凋亡的剂量效应，并与60Co γ射线的效应相比较，探讨两种辐射诱导细胞凋亡的异同。方法 用光镜和电镜形态学观察与DNA琼脂糖凝胶电泳方法对细胞凋亡进行定性研究；用流式细胞术(FCM)和二苯胺(DPA)法对其进行定量研究。结果 小鼠经裂变中子0.5～5.0 Gy照射后6 h，可检测到胸腺细胞的DNA ladder，光镜及电镜下可观察到胸腺细胞典型的凋亡形态，且其凋亡比例随着照射剂量的增高而增加；γ射线1.0～30 Gy照射后6 h，也都检测到胸腺细胞的DNA ladder，其凋亡比例随剂量增高而增加，20 Gy左右达到峰值，剂量再高，其凋亡比例不再增加。结论 0.5～5.0 Gy的裂变中子或1.0～30 Gy的γ射线照射小鼠，均可引起胸腺细胞发生凋亡，且随剂量的变化规律相似；但裂变中子诱导小鼠胸腺细胞凋亡的效应高于γ射线，其RBE值约为2.09(FCM法)或2.37(DPA法)。表明中子对小鼠免疫组织的损伤在照射后几小时就比γ射线重，这可能是后期免疫组织损伤较重的基础。
, 百拇医药
Dose-effect relationship of apoptosis induced by fission-neutron in murine thymocytes
YUAN Bin,LI Liang,XUE Wencheng, et al.
(Institute of Radiation Medicne,Beijing 100850 China)
【Abstract】 Objective To investigate the effectiveness of high LET fission-neutron to induce apoptosis in murine thymocytes and to compare it with that of low LET 60Co γ-ray. Methods Apoptosis induction was studied qualitatively by light and transmission electron microscopy and DNA gel electrophoresis,also quantitatively by flow cytometry(FCM) and diphenylamine (DPA)methods. Results DNA ladders of murine thymocytes were detectable,the typical apoptosis of thymocytes could be observed morphologically by means of light and electron microscopy at 6 h after fission-neutron irradiation with doses ranging from 0.5 to 5.0 Gy,meanwhile the percentages of apoptosis increased with increasing doses.After exposure to γ-rays with doses ranging from 1.0 to 30 Gy,the expermiental results were similar to those from neutron radiation.The incidence of apoptosis peaked at about 20 Gy，the percentages did not increase further when doses increased. Conclusion Apoptosis of murine thymocytes can be induced when mice are exposed to either fission-neutron (0.5-5.0 Gy) or to γ-ray (1-30 Gy).Although the relationship between apoptosis and radiation doses is similar,the percentage of apoptosis induced by neutron irradiation is higher than that induced by γ-irradiation.The RBE values of fission-neutron for inducing apoptosis murine thymocytes are 2.09 (by FCM method) and 2.37 (by DPA method),respectively.These results also suggest that fission-neutron-induced murine immune tissue is more severe than that induced by γ-rays at several hours post-irradiation and this might be the basis for heavy damage to immune tissues induced by fission-neutron-irradiation in later period.
, 百拇医药
【Key words】 Fission neutrons; γ-rays； Thymocytes; Apoptosis; RBE
辐射诱导细胞凋亡的研究，已成为当今分子放射生物学研究领域的热点。人们对X射线、γ射线等低传能线密度(linear energy transfer，LET)辐射诱导细胞凋亡及其分子机理进行了较多的研究[1-4]，而对高LET辐射，如裂变中子诱导细胞凋亡研究得较少[4-6]。国内还未见报道。由于辐射品质不同，裂变中子诱导细胞凋亡的变化规律可能与低LET辐射有所不同。为此，本文对核反应堆裂变中子诱导小鼠胸腺细胞凋亡的剂量变化规律进行了探讨，并与60Co γ射线的作用比较，得到中子诱导小鼠胸腺细胞凋亡作用的RBE值，加深了对中子损伤的作用特点的认识。
材料和方法
1.材料
, http://www.100md.com
(1)实验动物：6～8周龄健康C57BL/6J雄性小鼠，体重(18±2)g,由本院实验动物中心提供。
(2)照射条件：裂变中子照射源为清华大学核能技术设计研究院核反应堆，反应堆功率50 kW或10 kW，中子平均能量为1.43 MeV，剂量率30.5 cGy/min或6.1 cGy/min，总剂量中γ剂量占10% 。γ射线照射源为本所60Co γ射线源，剂量率约1.2 Gy/min。
(3)试剂：Tris购自USB公司；碘化丙啶(PI)、溴化乙啶(EB)、Triton X-100购自Sigma公司；NP-40购自Fluka公司；琼脂糖购自Promega公司；RNase A为Calbiochem公司产品；其余均为国产分析纯试剂。
2.方法
(1)形态学观察：光镜观察采用常规石蜡切片，H.E.染色，光镜下观察，以每1 000个胸腺细胞中的凋亡细胞数目作为凋亡指数，每样品至少计数5个不同视野；小鼠胸腺组织块经戊二醛、锇酸固定，再经脱水、包埋、修块、超薄切片、电子染色后于EM400T型(Philips公司)透射电镜下观察并拍照。
, http://www.100md.com
(2)胸腺细胞悬液的制备：断头活杀小鼠，取其胸腺，加PBS(pH 7.2)轻轻研磨后，过一次200目钢网与尼龙网，再经PBS漂洗，Tris-NH4Cl(pH 7.2)溶解红细胞，800 r/min离心10 min收集细胞，最后用PBS调整细胞浓度约为107/ml，0.2%台盼蓝计数细胞活力。
(3)DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳：DNA的提取参考文献[7]，略有改动。取适量DNA样品及Maker(DL 2000,Takara公司)于1.0%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ml的EB)、0.5×TBE、2 V/cm的条件下电泳1～2 h。紫外灯下观察并拍照。
(4)流式细胞术(FCM)检测：取胸腺细胞约106个，70%乙醇固定，4℃过夜，2 000 r/min离心15 min，PBS调整细胞浓度约106/ml，加入终浓度为200 μg/ml的RNase A，37℃水浴30min，加入终浓度为50 μg/ml的PI染液(含0.2%的Triton X-100及0.9%的NaCl)，置4℃避光染色30 min。然后，于FACS Calibur型流式细胞仪(B.D.公司)测试，激发光波长488 nm，每样品计数1×104个细胞，用ModFit LT 2.0版软件进行结果分析。
, http://www.100md.com
(5)二苯胺(DPA)法测定：参考文献[1]稍加改动。
(6)统计学分析：数据以
±s表示，经t检验判断组间差异。结 果
1.裂变中子诱导小鼠胸腺细胞凋亡的形态特征
小鼠胸腺的组织切片经H.E.染色，光镜下观察到：正常小鼠的胸腺，凋亡细胞很少，细胞分布均匀，染色质散在分布，核仁可见，裂变中子0.5 Gy～5 Gy照射后6 h，在小鼠的胸腺组织中可看到多种形态的凋亡细胞，如核浓缩，边集，进而成块状、环状、戒指状和月牙状等。此外，还发现靠近胸腺组织表面的细胞发生凋亡的比例较高。
电镜下观察到凋亡细胞结构完整，可清楚地看到完整的线粒体及质膜，而胞核明显浓缩成块状等，还观察到了凋亡小体(图1)。这些特征有别于坏死细胞，表明裂变中子诱导胸腺细胞间期死亡的主要形式是凋亡。
, 百拇医药
图1 裂变中子3.0 Gy照射后6 h，小鼠胸凋亡细胞的透射电镜形态。凋亡细胞体积缩小，核固缩、边集，质膜完整，线粒体清晰可见，细箭头示意凋亡细胞，粗箭头示意正常细胞，电子染色 ×8000
2.凋亡细胞的生化特征
DNA琼脂糖凝胶电泳显示，0.5～5.0 Gy的裂变中子照射后6 h，均检测到小鼠胸腺细胞“梯状条带”(DNA ladders)(图2)；1～30 Gy的γ射线照射小鼠6 h后亦观察到各组的“梯状条带”。说明在此剂量范围内的裂变中子与γ射线均可诱导小鼠胸腺细胞产生凋亡。
3.裂变中子照射所致胸腺细胞凋亡的剂量效应
图2 裂变中子照射后的小鼠胸腺细胞
, 百拇医药
DNA电泳图谱
FCM测定的结果显示，0.5～5.0 Gy的裂变中子照射后6 h，小鼠胸腺细胞凋亡比例随剂量的增高而增加。正常小鼠胸腺细胞仅有2.45%的细胞自发凋亡，当受到剂量分别为0.5、1.0、2.5、5.0 Gy的中子照射后，其凋亡比例依次为7.68%、12.05%、26.8%、32.4%。同时，以光镜下观察计数结果求得的凋亡指数也显示出相似的变化规律；DPA法可快速、简便地测出细胞DNA片段的含量，以此可反映凋亡细胞所占的比例，该法测定的结果也表明，不高于5 Gy的裂变中子照射后6 h，小鼠胸腺细胞凋亡的比例呈线形增加趋势，且与未照射组相比差异都有显著性(表1)。
表1 不同剂量裂变中子照射后胸腺细胞凋亡变化 照射剂量
(Gy)
DPA法
, http://www.100md.com 凋亡比例(%)
光镜观察计数
凋亡指数(%)
0
5.48±1.14
2.46±0.42
1
11.43±0.54*
8.45±2.35*
2
19.29±3.51*
16.75±4.13*
, http://www.100md.com
3
26.86±1.80*
23.17±9.11*
4
38.70±1.36*
33.44±10.85*
5
44.91±0.66*
44.24±6.39*
注：与对照组相比，*P<0.01 4.γ射线照射所致胸腺细胞凋亡的剂量效应
, 百拇医药
FCM测定的结果表明，不同剂量的γ射线照射后6 h，小鼠胸腺细胞凋亡比例随剂量的增高而增加，当剂量高于15～20 Gy时，凋亡细胞比例不再增加。DPA法测定的结果与FCM检测基本一致(图3)。从图3看出，高于20 Gy的γ射线照射，小鼠胸腺细胞凋亡比例反而呈下降趋势。
图3 不同剂量的γ射线照射后胸
腺细胞凋亡比例变化
讨 论
细胞凋亡研究近年来成了生命科学领域研究的热点之一。由于核工业的不断发展、核武器潜在威胁的存在、临床肿瘤放疗的深入及意外辐射事故的发生，辐射诱发的细胞凋亡引起了放射生物学家与肿瘤学家的高度重视[2]。淋巴细胞，胸腺细胞和小肠隐窝细胞等对电离辐射敏感，受照后引起间期死亡或增殖死亡，在一定的剂量范围内表现为凋亡死亡，过高剂量则表现为细胞坏死[2，3]。
, http://www.100md.com
本文以60Co γ射线为参比射线，采用形态观察、DNA电泳及FCM等方法，对裂变中子诱导小鼠胸腺细胞的凋亡进行了研究。根据时间-效应，选取不同剂量照射后6 h活杀小鼠进行剂量-效应研究。结果发现，0.5～5.0 Gy的裂变中子照射后6 h，均在DNA电泳图谱上检测到DNA ladders，且在光镜特别是电镜下观察到小鼠胸腺细胞凋亡的典型形态，说明在此剂量范围内的裂变中子照射引起的小鼠胸腺细胞死亡以凋亡为主；同时发现，骨髓、脾脏和肠系膜淋巴结细胞也都发生了凋亡死亡，而心、肝、肾等组织未见凋亡(另文发表)，表明造血与免疫组织对辐射非常敏感[5]，对其防护是提高动物存活及其质量的关键。
研究还发现，裂变中子诱导小鼠胸腺细胞凋亡的效应高于γ射线，将用DPA法得到的剂量-效应曲线(图3)的上升部分的剂量和凋亡比例，以及表1中的剂量和凋亡比例分别进行直线回归，得到的回归方程为Y=3.9780+8.1870X(裂变中子，r=0.9922)与Y=6.3300+3.2760X(γ射线，r=0.9924)，据此可计算出50%细胞凋亡的对应剂量(X)，中子为5.62 Gy，γ射线为13.33 Gy。从而得到裂变中子引起50%胸腺细胞凋亡的RBE值为2.37。同理，依据FCM法求得的RBE值则为2.09。二者均大于2，与较后期胸腺重量减轻、细胞数量减少等的RBE值接近。据此推测较小剂量到中等剂量的裂变中子照射后几小时内，发生凋亡的胸腺细胞的数目要高于γ射线照射，凋亡细胞被吞噬、清除，是照后24 h或较后期的胸腺重量减轻及细胞数量减少等RBE值较高的原因，这可能就是裂变中子对免疫组织损伤较重的基础。
, 百拇医药
裂变中子诱导小鼠胸腺细胞凋亡的RBE值高于2，表明LET对辐射诱导凋亡效应有较显著作用。Hendry等人[4]研究得到中子诱导的小肠隐窝细胞凋亡与γ射线相比的RBE值约为3～4；最近Meijer等人[5]利用AO荧光染色法及细胞体积测量法，比较研究了14N离子加速器产生的中子与137Cs γ射线诱导人外周血淋巴细胞凋亡的效应，得到的RBE值介于1.3～3.0之间，且有时间依赖性。这些都进一步支持了上述看法，但也有学者研究得到快中子诱导体外小鼠胸腺细胞凋亡的RBE值为1.0[6]。因此，辐射诱导细胞凋亡的效应也不完全与LET成正比，这主要受中子的能量，辐射剂量及混合辐射中γ成分的多少等因素的影响。
裂变中子诱导细胞凋亡的效应高于γ射线，但在低于中高剂量的裂变中子或γ射线照射后，胸腺细胞的凋亡比例随剂量的增高而增加的趋势是一致的；过高剂量的γ射线照射后，胸腺细胞的凋亡比例不再明显增加。由于中子照射的条件所限，高于5 Gy的中子照射还未取得实验结果，其诱导细胞凋亡的规律及其机理，尚待进一步的研究。
, 百拇医药
参考文献
1，Mathieu J,Ferlat S,Ballester B,et al.Radiation-induced apoptosis in thymocytes:inhibition by diethylithiocarbamate and zinc.Radiat Res,1996,146：652-659.
2，Blank KR,Rudoltz MS,Kao JD, et al.The molecular regulation of apoptosis and implications for radiation oncology.Int J Radiat Biol,1997,71:455-466.
3，Kawai H,Kitamura Y,Nikaido O.et al.Isolation and characterization of apoptosis-resistant mutant from a radiosensitive mouse lymphoma cell line.Radiat Res,1998,149:41-51.
, 百拇医药
4，Hendy JH,Potten CS,Merrit A.Apoptosis induced by high-and low-LET radiation.Radiat Environ Biophys, 1995,34:59-62.
5，Meijer AE,Kronqvist USE,Lewensohn,et al.RBE for the induction of apoptosis in human peripheral lymphocytes exposed in vitro to high-LET radiation generated by accelerated nitrogen ions.Int J Radiat Biol,1998,73:169-177.
6，Warenius HM, Down JD.RBE of fast neutrons for apoptosis in mouse thymocytes.Int J Radiat Biol,1995,68,625-629.
7，John SMW,Weitzner G,Rozen R,et al.A rapid procedure for extracting genomic DNA from leukocytes.Nucleic Acids Res,1991,19:108.
(收稿日期:1999-02-02), 百拇医药