HT1080R细胞的辐射抗性与细胞周期关系初步研究
作者：江国春 袁丽珍 魏康 郭学敏 张雪峰
单位：(100850 北京放射医学研究所)
关键词：辐射敏感性；细胞周期；p53
中华放射医学与防护杂志000203 【摘要】 目的 研究HT1080R的辐射抗性及其照射前后细胞周期分布，探讨其辐射抗性的分子机理。方法 克隆形成比较HT1080与HT1080R照射后细胞存活率，流式细胞术研究细胞周期分布，PCR-SSCP和Western杂交测定p53外显子的基因状态及其表达状况。结果 HT1080R的辐射敏感性降低，具有明显的辐射抗性。照射后具有G2期阻滞现象，而其p53基因5个外显子正常。结论 经γ射线照射HT1080R细胞周期改变与其亲本细胞明显不同，出现明显的G2期阻滞，提示HT1080R辐射抗性的获得可能与其细胞周期G2期阻滞有关，PCR-SSCP和Western杂交研究表明HT1080R细胞辐射抗性不是由于p53基因功能异常所致。
, http://www.100md.com
Radioresistance and cell cycle distribution of HT1080R cells after
γ-ray irradiation
JIANG Guochun,YUAN Lizhen,WEI Kang, et al.
(Institute of Radiation Medicine, Beijing 108500,China)
【Abstract】 Objective To investigate radioresistance and cell cycle distribution of HT1080R cells after γ-ray irradiation. Methods By comparison of the survival fraction between HT1080R and HT1080 using cloning assay,cell cycle distribution and gene status were investigated by FCM and PCR-SSCP,respectively. Results HT1080R was more radioresistant than its parental cell line HT1080,and after exposure to 4 Gy and 6 Gy γ-rays showed G2 phase arrest.PCR-SSCP showed that the expression of p53 gene was normal. Conclusion G2 arrest can be found after 4 Gy and 8 Gy γ-ray irradiation in HT1080R cell line,which is more radioresistant than its parental cell line HT1080,suggesting that the acquirement of radioresistance may be related to its G2 arrest.Because of its normal gene status and expression,radioresistance of HT1080R cannot be explained by abnormal function of p53 gene.
, 百拇医药
【Key words】 Radiosensitivity; Cell cycle; p53
肿瘤细胞的辐射抗性是导致肿瘤常规放射治疗疗效不佳的重要原因之一，如何提高肿瘤细胞的辐射敏感性是临床放射治疗的一个研究热点[1]。细胞辐射敏感性与照射后细胞周期的改变有关。哺乳动物细胞在DNA损伤后，激活胞内的细胞周期监控机制，在限制点(checkpionts)细胞停留于细胞周期的特定阶段，对损伤DNA进行修复，以保证基因组的稳定性[2]。本文选择同一来源而辐射敏感性差异明显的一对细胞进行研究，探讨具有辐射抗性的HT1080R p53基因状态及其表达与γ射线照射后细胞周期变化关系。
材料和方法
1.细胞培养：细胞在含20%胎牛血清的MEM培养基，体积分数为5% 的CO2，37 ℃培养。
, 百拇医药
2.细胞存活率测定：取对数生长期细胞，接种适量的细胞数，贴壁6～8 h后，60Co γ射线照射不同剂量，照射量率4.386×10-2 C。kg-1。min-1 (170R*min-1)。继续培养7～14 d后，固定、染色并计算细胞克隆数。每个集落约含50～200个细胞。
3.细胞周期测定：弃培养基，5 ml MEM无血清培养基饥饿36 h后，再转入含20%胎牛血清的MEM培养液中继续培养[3]。然后用不同剂量的γ射线(60Co)照射细胞。制单细胞悬液，离心，乙醇固定[4]。RNaseA消化，碘化丙啶(PI)染色，美国BD公司FACScalibur型流式细胞仪测定。
4.基因组DNA的提取：按常规方法进行。
, 百拇医药
5.PCR-SSCP检测p53基因突变。
(1)p53外显子引物设计如表1，由Sybersyn公司(USA)合成。
(2)p53外显子的PCR扩增：PCR按以下参数扩增35个循环：94 ℃ 30 s，Ta 30s,72 ℃ 30s,外显子5、6、7、8的Ta为56 ℃，第9外显子的Ta为46 ℃,p53第5、6、7、8、9外显子PCR扩增片段分别长181、201、171、204和185 bp。
图1 照射后HT1080与HT1080R
细胞存活曲线比较
, 百拇医药 图2 不同剂量γ射线照射HT1080细胞周期各个时相变化的比较分析
A、B、C分别为不同剂量照射后G1、G2、S期细胞数的改变
表1 p53外显子引物设计 外显子
引物(正向/反向)
PCR产物长度
5
5′TTGTCTGTTCACTTGTGCCC
189
5′TCATGTGCTGTGACTGCTTG
6
, 百拇医药
5′ACGACAGGGCTGTTGCCCA
201
5′CTCCCAGAGACCCCAGTTGC
7
5′GGCCTCATCTTGGGCCTGTG
171
5′CAGTGTGCAGGGTGGCAAGT
8
5′CTGCCTCTTGCTTCTCTTTT
204
5′TCTCCTCCACCGCTTCTTGT
, 百拇医药
9
5′GCAGTTATGCCTCAGATTCA
185
5′GGCATTTTGAGTGTTAGACT
(3)SSCP检测：PCR产物变性后8%聚丙烯酰胺80伏电泳过夜，染色，脱色至条带清晰。与正常对照条带不同者即为p53突变阳性。
6.Western blot检测p53蛋白的表达
SDS-PAGE电泳，半干法电转移，转膜后BSA封闭，PBS洗涤，加入鼠抗人一抗(DO-1，Santa Cruz生物技术公司)，再次封闭，PBS洗涤，加入羊抗鼠二抗(华美生物技术公司)，洗涤后DAB显色。
结 果
, 百拇医药
1.HT1080和HT1080R照射后细胞存活率测定
线性二次方程模拟存活曲线，HT1080的α、β值分别为0.18 Gy-1和0.0431 Gy-2，HT1080R的α、β值分别为0.00875 Gy-1和0.0352 Gy-2，HT1080R的α、β值低于HT1080，HT1080R具有辐射抗性(见图1)。
2.γ射线照射后HT1080细胞周期变化
流式细胞仪测定结果分析如图2所示，对照组细胞逐渐离开G1期，使S期G2期细胞逐渐增多。4 Gy照射后HT1080细胞G1期细胞明显增多，G2期细胞也有增加，4 Gy照射后大约在4 h出现G1期阻滞现象，而8 Gy照射后2 h就出现G1期阻滞现象。根据Mckenna WG等的定义[6]，推算出4 Gy照射后HT1080 G1期阻滞时间约为4 h，8 Gy照射后HT1080 G1期阻滞时间约为6 h。
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3.照射前后辐射抗性细胞HT1080R的细胞周期变化
结果如图3所示，4 Gy照射后HT1080R G1期细胞数量没有明显的变化，出现了G2期阻滞。8 Gy照射后4 h HT1080R出现G2期阻滞，14 h达到最高。分析后发现4 Gy照射后HT1080R G2期阻滞时间约为9 h,8 Gy照射后阻滞时间为13 h。
4.HT1080R p53基因状态和蛋白表达的检测
文献报道p53突变后G1期阻滞消失，细胞的辐射敏感性降低[7]，对HT1080/HT1080R p53基因外显子进行PCR-SSCP测定后表明，两细胞p53 5个外显子无基因突变(图4)，这说明HT1080R细胞周期改变以及辐射敏感性降低与p53基因突变无明显关联。4 Gy照射后，HT1080R与HT1080细胞p53蛋白表达水平都比照射前有所增加，且差异没有显著性(图5)，表明HT1080R细胞辐射抗性不是由于p53基因功能异常所引起的。
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图3 不同剂量γ射线照射HT1080R细胞周期各个时相的比较分析
A、B、C分别为对照组和不同剂量组照射后G1、G2、S期细胞数的改变
图4 PCR-SSCP鉴定p53基因状态
1、2、3、4、5分别为p53基因5、6、7、8、9外显子DNA；A、B、C分别为正常对照、HT1080以及HT1080R DNA
讨 论
照射后HT1080R α、β值比HT1080细胞低，HT1080R具有辐射抗性。研究结果显示，γ射线照射后HT1080出现明显的G1期阻滞，Western blot表明此时p53参与此调控过程。而辐射抗性细胞HT1080R照后出现G2期阻滞，与文献报道辐射抗性细胞照射后多出现G2期阻滞现象相一致，如REC(ras+c-myc)、OR-5、NMT-1R、HeLa3A等[8]。
, 百拇医药
图5 p53蛋白的Western杂交
1、3为HT1080细胞照射前后p53的表达；2、4为HT1080R细胞照射前后p53的表达
目前多数人认为细胞辐射抗性可能与p53突变有关，但是也有相反证据[9]，为了澄清HT1080R辐射抗性是否与p53基因突变有关，我们用PCR-SSCP对HT1080R p53基因进行了鉴定。结果表明，p53基因第5～第9功能区无突发变，Wertern blot表明照射后HT1080R与HT1080的p53蛋白表达水平有所升高，并无明显差异，进一步说明HT1080R细胞的p53基因功能正常，其细胞辐射抗性的获得不是由于p53基因突变所引起。总之，辐射抗性细胞HT1080R照射后引起G2期阻滞，由于p53基因功能正常，因而排除了p53基因突变引起辐射抗性的可能，试图进一步阐明其细胞辐射抗性发生机理尚需深入研究。
, 百拇医药 参考文献
1，Clarke SEM.Radionuclide therapy in oncology.Cancer Treatment Rev,1994,20:51-71.
2，Rhys CM,Bohr VA.Mammalian DNA repair responses and genomic instability.EXS,1996,77:289-305.
3，Brasnahan WA,Boldogh I,Ma TL,et al.CyclinE/cdk2 activity is controlled by different mechanisms in the G0 and G1 phases of the cell cycle.Cell Growth Differ,1996,7:1283-1290.
, 百拇医药
4，Ghosh S,Schroeter D,Paweletz N.Okadaic acid overrides the S phase checkpoint and accelerates progression of G2-phase to induce premature mitosis in HeLa cells,Exp Cell Res,1996,227:165-169.
5，Wei K,Kodym R,Jin C,et al.Radioresistance cell line strain of human fibrosarcoma cells obtained after long term repeated X-ray irradiation.Environ Radiat Biophys,1998,37:133-137.
6，McKenna WG,Iliakis G,Weiss MC,et al.Increased G2 delay in radiation-resistant cells obtained by transformation of primary rat embryo cells with the oncogenes H-ras and v-myc.Radiat Res,1991,125:283-287.
, http://www.100md.com
7，Lee JM,Bernstein A.p53 mutations increase resistance to ionizing radiation.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:5742-5746.
8，Tusboik,Tsuchida Y,Endo K,et al.Isolation of radiosensitive and radioresistant mutants from a medulloblastoma cell line.Brain Tumor Pathol,1997,14:19-25.
9，Russel J,Wheldem TE,Standon P,et al.A radioresistance viarant derived from a human neuroblastoma cell line is less prone to radiation induced apoptosis.Cancer Res,1995,55:1915-1921.
(收稿日期:1999-09-10), 百拇医药
单位：(100850 北京放射医学研究所)
关键词：辐射敏感性；细胞周期；p53
中华放射医学与防护杂志000203 【摘要】 目的 研究HT1080R的辐射抗性及其照射前后细胞周期分布，探讨其辐射抗性的分子机理。方法 克隆形成比较HT1080与HT1080R照射后细胞存活率，流式细胞术研究细胞周期分布，PCR-SSCP和Western杂交测定p53外显子的基因状态及其表达状况。结果 HT1080R的辐射敏感性降低，具有明显的辐射抗性。照射后具有G2期阻滞现象，而其p53基因5个外显子正常。结论 经γ射线照射HT1080R细胞周期改变与其亲本细胞明显不同，出现明显的G2期阻滞，提示HT1080R辐射抗性的获得可能与其细胞周期G2期阻滞有关，PCR-SSCP和Western杂交研究表明HT1080R细胞辐射抗性不是由于p53基因功能异常所致。
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Radioresistance and cell cycle distribution of HT1080R cells after
γ-ray irradiation
JIANG Guochun,YUAN Lizhen,WEI Kang, et al.
(Institute of Radiation Medicine, Beijing 108500,China)
【Abstract】 Objective To investigate radioresistance and cell cycle distribution of HT1080R cells after γ-ray irradiation. Methods By comparison of the survival fraction between HT1080R and HT1080 using cloning assay,cell cycle distribution and gene status were investigated by FCM and PCR-SSCP,respectively. Results HT1080R was more radioresistant than its parental cell line HT1080,and after exposure to 4 Gy and 6 Gy γ-rays showed G2 phase arrest.PCR-SSCP showed that the expression of p53 gene was normal. Conclusion G2 arrest can be found after 4 Gy and 8 Gy γ-ray irradiation in HT1080R cell line,which is more radioresistant than its parental cell line HT1080,suggesting that the acquirement of radioresistance may be related to its G2 arrest.Because of its normal gene status and expression,radioresistance of HT1080R cannot be explained by abnormal function of p53 gene.
, 百拇医药
【Key words】 Radiosensitivity; Cell cycle; p53
肿瘤细胞的辐射抗性是导致肿瘤常规放射治疗疗效不佳的重要原因之一，如何提高肿瘤细胞的辐射敏感性是临床放射治疗的一个研究热点[1]。细胞辐射敏感性与照射后细胞周期的改变有关。哺乳动物细胞在DNA损伤后，激活胞内的细胞周期监控机制，在限制点(checkpionts)细胞停留于细胞周期的特定阶段，对损伤DNA进行修复，以保证基因组的稳定性[2]。本文选择同一来源而辐射敏感性差异明显的一对细胞进行研究，探讨具有辐射抗性的HT1080R p53基因状态及其表达与γ射线照射后细胞周期变化关系。
材料和方法
1.细胞培养：细胞在含20%胎牛血清的MEM培养基，体积分数为5% 的CO2，37 ℃培养。
, 百拇医药
2.细胞存活率测定：取对数生长期细胞，接种适量的细胞数，贴壁6～8 h后，60Co γ射线照射不同剂量，照射量率4.386×10-2 C。kg-1。min-1 (170R*min-1)。继续培养7～14 d后，固定、染色并计算细胞克隆数。每个集落约含50～200个细胞。
3.细胞周期测定：弃培养基，5 ml MEM无血清培养基饥饿36 h后，再转入含20%胎牛血清的MEM培养液中继续培养[3]。然后用不同剂量的γ射线(60Co)照射细胞。制单细胞悬液，离心，乙醇固定[4]。RNaseA消化，碘化丙啶(PI)染色，美国BD公司FACScalibur型流式细胞仪测定。
4.基因组DNA的提取：按常规方法进行。
, 百拇医药
5.PCR-SSCP检测p53基因突变。
(1)p53外显子引物设计如表1，由Sybersyn公司(USA)合成。
(2)p53外显子的PCR扩增：PCR按以下参数扩增35个循环：94 ℃ 30 s，Ta 30s,72 ℃ 30s,外显子5、6、7、8的Ta为56 ℃，第9外显子的Ta为46 ℃,p53第5、6、7、8、9外显子PCR扩增片段分别长181、201、171、204和185 bp。
图1 照射后HT1080与HT1080R
细胞存活曲线比较
, 百拇医药 图2 不同剂量γ射线照射HT1080细胞周期各个时相变化的比较分析
A、B、C分别为不同剂量照射后G1、G2、S期细胞数的改变
表1 p53外显子引物设计 外显子
引物(正向/反向)
PCR产物长度
5
5′TTGTCTGTTCACTTGTGCCC
189
5′TCATGTGCTGTGACTGCTTG
6
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5′ACGACAGGGCTGTTGCCCA
201
5′CTCCCAGAGACCCCAGTTGC
7
5′GGCCTCATCTTGGGCCTGTG
171
5′CAGTGTGCAGGGTGGCAAGT
8
5′CTGCCTCTTGCTTCTCTTTT
204
5′TCTCCTCCACCGCTTCTTGT
, 百拇医药
9
5′GCAGTTATGCCTCAGATTCA
185
5′GGCATTTTGAGTGTTAGACT
(3)SSCP检测：PCR产物变性后8%聚丙烯酰胺80伏电泳过夜，染色，脱色至条带清晰。与正常对照条带不同者即为p53突变阳性。
6.Western blot检测p53蛋白的表达
SDS-PAGE电泳，半干法电转移，转膜后BSA封闭，PBS洗涤，加入鼠抗人一抗(DO-1，Santa Cruz生物技术公司)，再次封闭，PBS洗涤，加入羊抗鼠二抗(华美生物技术公司)，洗涤后DAB显色。
结 果
, 百拇医药
1.HT1080和HT1080R照射后细胞存活率测定
线性二次方程模拟存活曲线，HT1080的α、β值分别为0.18 Gy-1和0.0431 Gy-2，HT1080R的α、β值分别为0.00875 Gy-1和0.0352 Gy-2，HT1080R的α、β值低于HT1080，HT1080R具有辐射抗性(见图1)。
2.γ射线照射后HT1080细胞周期变化
流式细胞仪测定结果分析如图2所示，对照组细胞逐渐离开G1期，使S期G2期细胞逐渐增多。4 Gy照射后HT1080细胞G1期细胞明显增多，G2期细胞也有增加，4 Gy照射后大约在4 h出现G1期阻滞现象，而8 Gy照射后2 h就出现G1期阻滞现象。根据Mckenna WG等的定义[6]，推算出4 Gy照射后HT1080 G1期阻滞时间约为4 h，8 Gy照射后HT1080 G1期阻滞时间约为6 h。
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3.照射前后辐射抗性细胞HT1080R的细胞周期变化
结果如图3所示，4 Gy照射后HT1080R G1期细胞数量没有明显的变化，出现了G2期阻滞。8 Gy照射后4 h HT1080R出现G2期阻滞，14 h达到最高。分析后发现4 Gy照射后HT1080R G2期阻滞时间约为9 h,8 Gy照射后阻滞时间为13 h。
4.HT1080R p53基因状态和蛋白表达的检测
文献报道p53突变后G1期阻滞消失，细胞的辐射敏感性降低[7]，对HT1080/HT1080R p53基因外显子进行PCR-SSCP测定后表明，两细胞p53 5个外显子无基因突变(图4)，这说明HT1080R细胞周期改变以及辐射敏感性降低与p53基因突变无明显关联。4 Gy照射后，HT1080R与HT1080细胞p53蛋白表达水平都比照射前有所增加，且差异没有显著性(图5)，表明HT1080R细胞辐射抗性不是由于p53基因功能异常所引起的。
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图3 不同剂量γ射线照射HT1080R细胞周期各个时相的比较分析
A、B、C分别为对照组和不同剂量组照射后G1、G2、S期细胞数的改变
图4 PCR-SSCP鉴定p53基因状态
1、2、3、4、5分别为p53基因5、6、7、8、9外显子DNA；A、B、C分别为正常对照、HT1080以及HT1080R DNA
讨 论
照射后HT1080R α、β值比HT1080细胞低，HT1080R具有辐射抗性。研究结果显示，γ射线照射后HT1080出现明显的G1期阻滞，Western blot表明此时p53参与此调控过程。而辐射抗性细胞HT1080R照后出现G2期阻滞，与文献报道辐射抗性细胞照射后多出现G2期阻滞现象相一致，如REC(ras+c-myc)、OR-5、NMT-1R、HeLa3A等[8]。
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图5 p53蛋白的Western杂交
1、3为HT1080细胞照射前后p53的表达；2、4为HT1080R细胞照射前后p53的表达
目前多数人认为细胞辐射抗性可能与p53突变有关，但是也有相反证据[9]，为了澄清HT1080R辐射抗性是否与p53基因突变有关，我们用PCR-SSCP对HT1080R p53基因进行了鉴定。结果表明，p53基因第5～第9功能区无突发变，Wertern blot表明照射后HT1080R与HT1080的p53蛋白表达水平有所升高，并无明显差异，进一步说明HT1080R细胞的p53基因功能正常，其细胞辐射抗性的获得不是由于p53基因突变所引起。总之，辐射抗性细胞HT1080R照射后引起G2期阻滞，由于p53基因功能正常，因而排除了p53基因突变引起辐射抗性的可能，试图进一步阐明其细胞辐射抗性发生机理尚需深入研究。
, 百拇医药 参考文献
1，Clarke SEM.Radionuclide therapy in oncology.Cancer Treatment Rev,1994,20:51-71.
2，Rhys CM,Bohr VA.Mammalian DNA repair responses and genomic instability.EXS,1996,77:289-305.
3，Brasnahan WA,Boldogh I,Ma TL,et al.CyclinE/cdk2 activity is controlled by different mechanisms in the G0 and G1 phases of the cell cycle.Cell Growth Differ,1996,7:1283-1290.
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4，Ghosh S,Schroeter D,Paweletz N.Okadaic acid overrides the S phase checkpoint and accelerates progression of G2-phase to induce premature mitosis in HeLa cells,Exp Cell Res,1996,227:165-169.
5，Wei K,Kodym R,Jin C,et al.Radioresistance cell line strain of human fibrosarcoma cells obtained after long term repeated X-ray irradiation.Environ Radiat Biophys,1998,37:133-137.
6，McKenna WG,Iliakis G,Weiss MC,et al.Increased G2 delay in radiation-resistant cells obtained by transformation of primary rat embryo cells with the oncogenes H-ras and v-myc.Radiat Res,1991,125:283-287.
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7，Lee JM,Bernstein A.p53 mutations increase resistance to ionizing radiation.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:5742-5746.
8，Tusboik,Tsuchida Y,Endo K,et al.Isolation of radiosensitive and radioresistant mutants from a medulloblastoma cell line.Brain Tumor Pathol,1997,14:19-25.
9，Russel J,Wheldem TE,Standon P,et al.A radioresistance viarant derived from a human neuroblastoma cell line is less prone to radiation induced apoptosis.Cancer Res,1995,55:1915-1921.
(收稿日期:1999-09-10), 百拇医药