脐血CD34＋造血干/祖细胞及其亚群的研究

http://www.100md.com 《中华放射医学与防护杂志》 2000年第4期

     作者：刘长安 贾廷珍

    单位：100083 北京医科大学附属第三医院肿瘤与放射病科

    关键词：

    中华放射医学与防护杂志000415 近年来，脐血在肿瘤、白血病和放射病的临床治疗中初步显现出广阔的前景。为进一步探讨脐血造血干/祖细胞(HSC/HPC)的生物学特性，本文作者采用单克隆抗体技术及流式细胞术检测了脐带血CD34⁺细胞及其亚群的分布，并与成人外周血和骨髓进行了比较，以期为脐血的合理使用提供实验资料。

    一、材料和方法

    1.试剂与仪器：异硫氰酸荧光素(FITC)标记的小鼠抗人CD34单克隆抗体(MoAb)，藻红蛋白(PE)标记的小鼠抗人CD38MoAb，分别以FITC及PE标记的小鼠IgG₁MoAb(均为美国Pharmingen出品)。FACScan型流式细胞仪(BD公司)。
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    2.标本采集和单个核细胞(MNC)分离：采集健康产妇足月分娩46名正常新生儿脐带血，36名健康成人外周血及22名健康成人骨髓。肝素抗凝。用淋巴细胞分离液(1.077 g/ml)分离MNC层。PBS洗涤2次。

    3.CD34⁺细胞及其亚群测定：①荧光标记单克隆抗体(MoAb)染色：调整MNC浓度为1×10⁷/ml，每份样品取细胞悬液100 μl，加入FITC-CD34MoAb、PE-CD38 MoAb各20 μl；非特异对照管加入FITC及PE标记的小鼠IgG₁ MoAb各20 μl。40℃避光孵育30 min，洗涤后制备MNC悬液(1×10⁶/ml)。②流式细胞仪检测：激发光源为15 mW氩离子激光，波长488 nm，FITC和PE受激发分别发出绿色、橙色荧光。检测前先以标准微球校正仪器，使变异系数在2%以内。每一样品用FACScan软件收集1×10⁵个细胞，用LysysII软件分析处理数据。
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    二、结果

    1.MNC中CD34⁺细胞含量：脐血、骨髓和成人外周血的比较：脐血MNC中CD34⁺细胞及CD34⁺ CD38⁺亚群细胞含量均低于骨髓(P<0.01)，但明显高于成人外周血(P<0.01)。脐血MNC中CD34⁺CD38^-亚群含量与骨髓相比差异无显著性(P>0.05)，二者均远远高于成人外周血(P<0.01)，见表1。

    2.CD34⁺CD38⁺及CD34⁺CD38^-亚群在CD34⁺细胞中的比例：脐血、骨髓及成人外周血比较。脐血CD34⁺CD38⁺亚群在CD34⁺细胞中的比例少于骨髓与外周血(P<0.01)，而CD34⁺CD38^-亚群在CD34⁺细胞中的比例显著高于骨髓与外周血(P<0.01)，见表2。
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    表1 脐血、骨髓及成人外周血MNC中CD34⁺细胞及

    其亚群比例(±s) 样本

    n

    CD34⁺

    细胞(%)

    CD34⁺CD38⁺

    亚群(%)

    CD34⁺CD38^-

    亚群(%)
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    脐血

    46

    1.44±0.66

    1.30±0.78

    0.14±0.10

    骨髓

    36

    3.50±0.77^*

    3.34±0.92²

    0.13±0.05

    外周血

    22
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    0.179±0.116^*#

    0.172±0.114^*#

    0.07±0.05^*#

    注：与脐血相比,^*P<0.01；与骨髓相比，^#P<0.01表2 脐血、骨髓、外周血在CD34⁺细胞中CD34⁺CD38⁺

    及CD34⁺CD38^-亚群的比例(±s) 样本

    n

    CD34⁺CD38⁺亚群(%)
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    CD34⁺CD38^-亚群(%)

    脐血

    46

    91.64±1.09

    8.36±1.13

    骨髓

    36

    95.99±0.66^*

    4.01±0.66^*

    外周血

    22
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    96.07±0.67^*

    3.93±0.82^*

    注：与脐血相比，^*P<0.01 三、讨论

    HSC/HPC可分为造血干细胞(HSC)和造血祖细胞(HPC)，HSC具有高度的自我更新及自我维持能力，在体内永久存在并维持正常造血功能，而HPC则因分化到终末而必然凋亡。HSC/HPC绝大部分存在于CD34⁺细胞组分中，而不表达CD34抗原的细胞几乎没有集落形成能力，因此，CD34⁺可作为HSC/HPC的标志。CD34⁺细胞有CD34⁺CD38⁺和CD34⁺CD38^-两个细胞亚群。二者经体外培养均可大量扩增，但CD34⁺ CD38⁺亚群集落形成率较低，集落形态各异，其中含较多的成熟细胞，不形成CFU-GEMM；CD34⁺CD38^-细胞集落形成率高，集落形态较为一致，以原始细胞为多，再植能力及多向分化潜能较强，能形成CFU-GEMM。说明CD34⁺CD38^-亚群的性能更接近HSC。
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    本文作者比较了脐带血、成人外周血及骨髓中CD34⁺细胞及其亚群的分布。结果表明：MNC中CD34⁺细胞含量以骨髓最高，其次是脐血，成人外周血最低，脐血MNC中CD34⁺细胞的比例是成人外周血的8倍。有关脐带血CD34⁺细胞含量各家报道不尽相同，但可以肯定脐带血中含有丰富的HPC/HSC，其数量远远超过成人外周血。虽然脐血中CD34⁺细胞含量少于骨髓，但其CD34⁺CD38^-亚群在CD34⁺细胞中的比例显著高于骨髓和成人外周血，提示脐血富含较原始的造血干细胞。脐血CD34⁺细胞较骨髓和外周血增殖能力更强，其CD34⁺CD38⁺细胞可在体外形成大量各系集落，而CD34⁺CD38^-细胞可在液体培养体系中维持较长时间的造血功能，并且对细胞因子反应敏感，表明脐血是造血干细胞的又一良好来源；随着富集CD34⁺CD38^-细胞体外扩增技术的进步，脐血移植可能突破年龄的限制而用于成人。

    (收稿日期:1999-11-30), 百拇医药

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