Fas和Bcl-2在受照射小鼠脾淋巴细胞中的表达及与细胞凋亡的关系
作者：高临路 崔玉芳 杨红 夏国伟 彭瑞云 高亚兵 王德文
单位：100850 北京放射医学研究所
关键词：照射；脾淋巴细胞；凋亡；Fas；Bcl-2
中华放射医学与防护杂志000409 【摘要】 目的 探讨Fas和Bcl-2蛋白在受大剂量60Co γ射线照射后小鼠脾淋巴细胞中的表达及与细胞凋亡的关系。方法 小鼠全身一次性 γ射线照射，吸收剂量分别为0、6、9、12、15和20 Gy，于照射后3、6、12、24 h、3、7、14和28 d活杀取材，免疫组化LSAB染色观察后进行定量分析。结果 照射后6 h，Fas的表达呈强阳性，6～12 Gy剂量范围内阳性表达更明显，而随时间递增表达逐渐减少，但无明显的剂量效应关系，7 d后表达明显减弱。Bcl-2的表达于6 h 几乎为阴性，在<12 Gy剂量组更为明显。至照射后28 d依然未恢复。结论 在受大剂量照射小鼠脾淋巴细胞中 Fas 癌基因蛋白表达升高与细胞凋亡有较好相关关系，即 Fas 蛋白可能有促进凋亡的作用。而在相同剂量照射后，Bcl-2 抑制凋亡的作用被减弱甚至消失。上述两种癌蛋白对受大剂量60Co γ射线照射的小鼠脾淋巴细胞凋亡均具有重要调控作用。
, 百拇医药
Expression of Fas and Bcl-2 and their relationship to apoptosis in spleen lymphocytes of mice irradiated with large dose 60Co γ-rays
GAO Linlu, CUI Yufang, YANG Hong, et al.
(Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850, China)
【Abstract】 Objective To investigate the expressions of Fas and Bcl-2 and their significance in apoptosis of spleen lymphocyte of mice after large dose γ -ray irradiation. Methods At 3,6,12,24 h,3,7,14 and 28 d after 6-20 Gy γ-ray irradiation mice were sacrificed and their spleens were removed.The expressions of Fas and Bcl-2 oncoprotein were analysed by LSAB immunohistochemical method. Results The expression of Fas was strongly positive at 6 h after irradiation, especially in 6-12 Gy groups. It became less obvious along with prolongation of time after irradiation and almost disappeared on d 7 after irradiation. The expression of Bcl-2 was nearly negative at 6 h after irradiation, especially in 12-20 Gy groups, and did not recover on d 28 after irradiation. Conclusion After large dose γ-ray irradiation the expression of Fas in mouse spleen lymphocytes shows a better relationship to lymphocyte apoptosis; in other words, Fas can prompt apoptosis. On the other hand, the action of Bcl-2 is reduced or even disappeared. Both of them play an important role in spleen lymphocyte apoptosis after large dose of γ-irradiation.
, http://www.100md.com
【Key words】 Irradiation; Spleen lymphocytes; Apoptosis; Fas; Bcl-2
脾脏组织中有丰富的淋巴细胞。60Co γ射线照射致淋巴细胞显著减少，是急性放射损伤后机体易感染的重要因素之一。作者用免疫组化法观察了 Fas和Bcl-2 这两种具相反作用的癌基因蛋白在受大剂量60Co γ射线照射后脾淋巴细胞中的表达，旨在为急性重度放射病的治疗提供实验依据。
材料和方法
1. 照射及制片：采用军事医学科学院实验动物中心提供的雄性 C57小鼠280只，体重(20±1)g，随机分为6组，每组5只。用60Co γ射线全身一次性照射，吸收剂量分别为0、6、9、12、15和20 Gy。于照射后3、6、12、24 h、3、7、14和28 d活杀取脾脏，10%中性福尔马林固定，石蜡包埋制片。
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2. 免疫组化染色及结果判定：采用LSAB法免疫组化染色，第一抗体为Santa Cruz 公司产品。Fas和Bcl-2蛋白阳性染色为胞浆内着染玫瑰红色，阴性细胞无着色。
3. 定量检测：采用CMIAS病理图像分析系统，切片按统一放大倍数(10×40)检测照射后6 h Fas及Bcl-2阳性细胞的数密度(阳性细胞数/视野细胞面积)及积分光密度(阳性面积和灰度积分)。文中数据以
±s表示，采用t检验。
表1 照射后6 h脾淋巴细胞Fas和Bcl-2表达定量分析结果 吸收剂量
(Gy)
动物数
(只)
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Fas
Bcl-2
数密度(×100/μm2)
积分光密度(×106)
数密度(×100/μm2)
积分光密度(×106)
0
5
0.0002±0.001
0.258±0.14
0.0185±0.0001
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1.82±0.22
6
5
0.0286±0.001**
0.834±0.05**
0.0021±0.0001**
0.48±0.12**
9
5
0.0256±0.003**
0.736±0.04**
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0.0024±0.0003**
0.44±0.20**
12
5
0.027±0.005**
0.737±0.07**
0.0021±0.0002**
0.44±0.04**
15
5
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0.0188±0.003**
0.518±0.06**
0.0014±0.0004**
0.42±0.05**
20
5
0.0193±0.003**
0.494±0.03**
0.0010±0.0005**
0.42±0.05**
, 百拇医药
注：对照组与照射组比，**P<0.01结 果
1. 病理形态观察：照射后3 h照射组动物脾白髓及边缘区出现凋亡细胞。照射后6 h，淋巴细胞凋亡达最高峰。各期凋亡细胞形态均可见到，当吸收剂量>15 Gy 时，坏死细胞数量明显增多。12～24 h 时，淋巴细胞及凋亡细胞的数量均明显减少。3～7 d时已无明显凋亡细胞。至14～28 d 时，脾脏淋巴细胞再生活跃，数量增多。电镜下见凋亡的淋巴细胞体积变小，表面微绒毛消失，核仁崩解但核膜完整。细胞器变得致密。12～24h 时凋亡的淋巴细胞数量减少，除核浓聚外，已难见到典型的凋亡形态。照射后3 d，电镜下无法见到凋亡的淋巴细胞。
2. 免疫组化观察及定量分析结果(见表1)：照射后3 h，Fas 开始出现表达，至6 h 阳性表达达高峰。但在6～12 Gy范围内，Fas的表达较15～20 Gy组强，以后逐渐呈下降趋势，至照射后7 d 表达基本消失。而Bcl-2的表达在照射后3 h即减少，至照射后6 h，降至最低，部分切片基至几乎无阳性表达。这种现象一直持续至照射后28 d。
, 百拇医药
由表1可知，照射后6 h，Fas阳性细胞的数密度及积分光密度均增加，虽然6～12 Gy组强于15～20 Gy组，但各组间无统计学差别。各照射组与对照组相比，差异均有显著性(P<0.01)。Bcl-2的上述体视学参数在6 h时显著下降，尤其在15～20Gy组中，虽然与6～12Gy组相比差异无显著性，但其下降较6～12 Gy组明显。各组与对照组相比，差异均有显著性(P<0.01)。
讨 论
脾脏是辐射高度敏感组织。有研究显示小鼠经低剂量γ射线照射可造成淋巴细胞的凋亡[1]。Fas 为介导凋亡的膜蛋白，以抗Fas 抗体与之交联，即可诱异典型的细胞凋亡。Bcl-2是一种可阻滞细胞凋亡发生的癌基因蛋白[2]。在本实验中，小鼠脾淋巴细胞受到大剂量60Co γ射线照射后3 h即出现明显凋亡，照射后6 h凋亡达高峰时Fas 的表达也达高峰，随着照射剂量的增加及照后时间的延长，Fas 的表达呈现出下降的趋势。尤其是当照射剂量>15 Gy 后，这种趋势更加明显。表明经60Co γ射线照射后，Fas 有重要的促进凋亡的作用。当照射剂量<12 Gy时，脾淋巴细胞的死亡方式以凋亡为主。当照射剂量>15 Gy时，坏死细胞数量增加。因而凋亡和坏死均是重要的细胞死亡途径。另一方面，Bcl-2癌基因蛋白的表达却出现了明显的下降，甚至无阳性表达，这种状况一直持续至照后28 d且与照射剂量及照后时间无关。Bcl-2 可抑制细胞凋亡，显然，照射后它的作用丧失或受到抑制。有实验显示[3]，对于射线所致细胞损伤，Bcl-2 主要是借助诱发活性氧自由基的间接危害而致细胞损伤的。当脾淋巴细胞大量凋亡时，Bcl-2的表达呈明显的下降趋势即调控细胞凋亡的作用受到抑制，这与文献报道的结果一致。
, 百拇医药
综上所述，当小鼠受到大、中剂量的60Co γ射线照射后，脾淋巴细胞的凋亡是多种因素相互作用的结果。其中Fas 蛋白起到了明显的促进作用。而Bcl-2的功能则丧失或受到抑制。因为两种基因属于完全不同的家族，它们之间是否具有拮抗作用及如何作用，尚在进一步研究中。
基金项目：解放军总后勤部留学回国人员启动基金资助项目(9405021)；军事医学科学院第二届创新基金资助项目(9805106)
参考文献
1，Booker JK, Reap EA, Cohen PL, et al. Expression and function of Fas on cells damaged by gamma-irradiation in B6 and B6/Ipr mice. J Immunol， 1998,161:4536-4541.
2，Cohen JJ. Apoptosis. Immunol Today,1993,14:334-339.
3，Stanley J, Korsmeyer. Bcl-2 initiates a new category of oncogenes:regulators of cell death. Blood,1992,80:879-881.
(收稿日期:1999-09-18), 百拇医药
单位：100850 北京放射医学研究所
关键词：照射；脾淋巴细胞；凋亡；Fas；Bcl-2
中华放射医学与防护杂志000409 【摘要】 目的 探讨Fas和Bcl-2蛋白在受大剂量60Co γ射线照射后小鼠脾淋巴细胞中的表达及与细胞凋亡的关系。方法 小鼠全身一次性 γ射线照射，吸收剂量分别为0、6、9、12、15和20 Gy，于照射后3、6、12、24 h、3、7、14和28 d活杀取材，免疫组化LSAB染色观察后进行定量分析。结果 照射后6 h，Fas的表达呈强阳性，6～12 Gy剂量范围内阳性表达更明显，而随时间递增表达逐渐减少，但无明显的剂量效应关系，7 d后表达明显减弱。Bcl-2的表达于6 h 几乎为阴性，在<12 Gy剂量组更为明显。至照射后28 d依然未恢复。结论 在受大剂量照射小鼠脾淋巴细胞中 Fas 癌基因蛋白表达升高与细胞凋亡有较好相关关系，即 Fas 蛋白可能有促进凋亡的作用。而在相同剂量照射后，Bcl-2 抑制凋亡的作用被减弱甚至消失。上述两种癌蛋白对受大剂量60Co γ射线照射的小鼠脾淋巴细胞凋亡均具有重要调控作用。
, 百拇医药
Expression of Fas and Bcl-2 and their relationship to apoptosis in spleen lymphocytes of mice irradiated with large dose 60Co γ-rays
GAO Linlu, CUI Yufang, YANG Hong, et al.
(Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850, China)
【Abstract】 Objective To investigate the expressions of Fas and Bcl-2 and their significance in apoptosis of spleen lymphocyte of mice after large dose γ -ray irradiation. Methods At 3,6,12,24 h,3,7,14 and 28 d after 6-20 Gy γ-ray irradiation mice were sacrificed and their spleens were removed.The expressions of Fas and Bcl-2 oncoprotein were analysed by LSAB immunohistochemical method. Results The expression of Fas was strongly positive at 6 h after irradiation, especially in 6-12 Gy groups. It became less obvious along with prolongation of time after irradiation and almost disappeared on d 7 after irradiation. The expression of Bcl-2 was nearly negative at 6 h after irradiation, especially in 12-20 Gy groups, and did not recover on d 28 after irradiation. Conclusion After large dose γ-ray irradiation the expression of Fas in mouse spleen lymphocytes shows a better relationship to lymphocyte apoptosis; in other words, Fas can prompt apoptosis. On the other hand, the action of Bcl-2 is reduced or even disappeared. Both of them play an important role in spleen lymphocyte apoptosis after large dose of γ-irradiation.
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【Key words】 Irradiation; Spleen lymphocytes; Apoptosis; Fas; Bcl-2
脾脏组织中有丰富的淋巴细胞。60Co γ射线照射致淋巴细胞显著减少，是急性放射损伤后机体易感染的重要因素之一。作者用免疫组化法观察了 Fas和Bcl-2 这两种具相反作用的癌基因蛋白在受大剂量60Co γ射线照射后脾淋巴细胞中的表达，旨在为急性重度放射病的治疗提供实验依据。
材料和方法
1. 照射及制片：采用军事医学科学院实验动物中心提供的雄性 C57小鼠280只，体重(20±1)g，随机分为6组，每组5只。用60Co γ射线全身一次性照射，吸收剂量分别为0、6、9、12、15和20 Gy。于照射后3、6、12、24 h、3、7、14和28 d活杀取脾脏，10%中性福尔马林固定，石蜡包埋制片。
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2. 免疫组化染色及结果判定：采用LSAB法免疫组化染色，第一抗体为Santa Cruz 公司产品。Fas和Bcl-2蛋白阳性染色为胞浆内着染玫瑰红色，阴性细胞无着色。
3. 定量检测：采用CMIAS病理图像分析系统，切片按统一放大倍数(10×40)检测照射后6 h Fas及Bcl-2阳性细胞的数密度(阳性细胞数/视野细胞面积)及积分光密度(阳性面积和灰度积分)。文中数据以
±s表示，采用t检验。表1 照射后6 h脾淋巴细胞Fas和Bcl-2表达定量分析结果 吸收剂量
(Gy)
动物数
(只)
, http://www.100md.com
Fas
Bcl-2
数密度(×100/μm2)
积分光密度(×106)
数密度(×100/μm2)
积分光密度(×106)
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0.0002±0.001
0.258±0.14
0.0185±0.0001
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0.0286±0.001**
0.834±0.05**
0.0021±0.0001**
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0.0014±0.0004**
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0.494±0.03**
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注：对照组与照射组比，**P<0.01结 果
1. 病理形态观察：照射后3 h照射组动物脾白髓及边缘区出现凋亡细胞。照射后6 h，淋巴细胞凋亡达最高峰。各期凋亡细胞形态均可见到，当吸收剂量>15 Gy 时，坏死细胞数量明显增多。12～24 h 时，淋巴细胞及凋亡细胞的数量均明显减少。3～7 d时已无明显凋亡细胞。至14～28 d 时，脾脏淋巴细胞再生活跃，数量增多。电镜下见凋亡的淋巴细胞体积变小，表面微绒毛消失，核仁崩解但核膜完整。细胞器变得致密。12～24h 时凋亡的淋巴细胞数量减少，除核浓聚外，已难见到典型的凋亡形态。照射后3 d，电镜下无法见到凋亡的淋巴细胞。
2. 免疫组化观察及定量分析结果(见表1)：照射后3 h，Fas 开始出现表达，至6 h 阳性表达达高峰。但在6～12 Gy范围内，Fas的表达较15～20 Gy组强，以后逐渐呈下降趋势，至照射后7 d 表达基本消失。而Bcl-2的表达在照射后3 h即减少，至照射后6 h，降至最低，部分切片基至几乎无阳性表达。这种现象一直持续至照射后28 d。
, 百拇医药
由表1可知，照射后6 h，Fas阳性细胞的数密度及积分光密度均增加，虽然6～12 Gy组强于15～20 Gy组，但各组间无统计学差别。各照射组与对照组相比，差异均有显著性(P<0.01)。Bcl-2的上述体视学参数在6 h时显著下降，尤其在15～20Gy组中，虽然与6～12Gy组相比差异无显著性，但其下降较6～12 Gy组明显。各组与对照组相比，差异均有显著性(P<0.01)。
讨 论
脾脏是辐射高度敏感组织。有研究显示小鼠经低剂量γ射线照射可造成淋巴细胞的凋亡[1]。Fas 为介导凋亡的膜蛋白，以抗Fas 抗体与之交联，即可诱异典型的细胞凋亡。Bcl-2是一种可阻滞细胞凋亡发生的癌基因蛋白[2]。在本实验中，小鼠脾淋巴细胞受到大剂量60Co γ射线照射后3 h即出现明显凋亡，照射后6 h凋亡达高峰时Fas 的表达也达高峰，随着照射剂量的增加及照后时间的延长，Fas 的表达呈现出下降的趋势。尤其是当照射剂量>15 Gy 后，这种趋势更加明显。表明经60Co γ射线照射后，Fas 有重要的促进凋亡的作用。当照射剂量<12 Gy时，脾淋巴细胞的死亡方式以凋亡为主。当照射剂量>15 Gy时，坏死细胞数量增加。因而凋亡和坏死均是重要的细胞死亡途径。另一方面，Bcl-2癌基因蛋白的表达却出现了明显的下降，甚至无阳性表达，这种状况一直持续至照后28 d且与照射剂量及照后时间无关。Bcl-2 可抑制细胞凋亡，显然，照射后它的作用丧失或受到抑制。有实验显示[3]，对于射线所致细胞损伤，Bcl-2 主要是借助诱发活性氧自由基的间接危害而致细胞损伤的。当脾淋巴细胞大量凋亡时，Bcl-2的表达呈明显的下降趋势即调控细胞凋亡的作用受到抑制，这与文献报道的结果一致。
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综上所述，当小鼠受到大、中剂量的60Co γ射线照射后，脾淋巴细胞的凋亡是多种因素相互作用的结果。其中Fas 蛋白起到了明显的促进作用。而Bcl-2的功能则丧失或受到抑制。因为两种基因属于完全不同的家族，它们之间是否具有拮抗作用及如何作用，尚在进一步研究中。
基金项目：解放军总后勤部留学回国人员启动基金资助项目(9405021)；军事医学科学院第二届创新基金资助项目(9805106)
参考文献
1，Booker JK, Reap EA, Cohen PL, et al. Expression and function of Fas on cells damaged by gamma-irradiation in B6 and B6/Ipr mice. J Immunol， 1998,161:4536-4541.
2，Cohen JJ. Apoptosis. Immunol Today,1993,14:334-339.
3，Stanley J, Korsmeyer. Bcl-2 initiates a new category of oncogenes:regulators of cell death. Blood,1992,80:879-881.
(收稿日期:1999-09-18), 百拇医药