脐血移植中移植物抗宿主病低发生机理研究
作者：张占英 诸雪珍 张澜生 朱寿彭
单位：张占英(215007 江苏，苏州大学放射医学系)；诸雪珍(苏州市妇幼保健院)；张澜生(215007 江苏，苏州大学放射医学系)；朱寿彭(215007 江苏，苏州大学放射医学系)
关键词：脐血血清；T淋巴细胞；可溶性因子；GVHD
中华放射医学与防护杂志000407 【摘要】 目的 通过对脐血和外周血免疫功能的比较，探讨了脐血移植中移植物抗宿主病(GVHD)低发生率的分子机理。方法 经增殖试验、NK杀伤活性试验及免疫荧光双标记方法研究了4种血清对T细胞免疫功能的影响。结果 与成人血清相比较，脐血血清能降低NK细胞杀伤肿瘤靶细胞的活性；同时脐血血清和成人血清都能增加丝裂原特异性T淋巴细胞增殖，成人血清在增殖反应中可达到峰值，而脐血血清没有达到峰值效应，甚至在0.1的稀释度时仍没有下降；成人血清能增加PHA刺激外周血单个核细胞(PBMC)中的T淋巴细胞HLA-DR表达，而脐血血清却没有这种效应。结论 血清中所分泌的某些可溶性因子可能在T细胞活化中起重要作用，与GVHD发生机理相关联。
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Mechanism of low GVHD incidence in umbilical cord blood transplantation
ZHANG Zhanying,ZHU Xuezhen,ZHANG Lansheng, et al.
(Department of Radiation Medicine,Soochow University,Suzhou 215007,China)
【Abstract】 Objective To compare the immunological function between umbilical cord blood (UCB) and peripheral blood, and to explore the mechanism of low incidence of graft-versus host disease (GVHD) in UCB transplantation. Methods The proliferation assay,NK cell killing activity assay and immunologic fluorescence double label technique were used to study four sear effect on T cell immunologic function. Results UCB serum could reduce K562 cell activity, compared to that of adult serum.Furthermore,adult serum will enhanced the percentage of HLA-DR expression of T cells on PHA-stimulated PBMC,whereas fetal serum has no such effect.Both adult and fetal serum enhanced mitogen-specific T cell proliferation,the peak proliferative response could be reached with adult serum but not with fetal serum. Conclusion There must be some soluble factors secreted into serum,which play a role in T cell activation and associate with the incidence of GVHD.
, 百拇医药
【Key words】 Umbilical cord blood; T cells; Soluble factors; Graft-versus-host disease
实验表明，接受人类白细胞抗原(HLA)相配骨髓移植的病人，不管移植后是否应用免疫抑制剂，大约有一半人发生急性移植物抗宿主病(GVHD)。在切尔诺贝利核电站事故发生后，13例进行骨髓移植的病人中，9例移植成功，但是只有2例存活，其他7人死于烧伤等综合征或骨髓移植并发症，主要是GVHD[1，2]。与此相反，应用HLA相配脐血儿童的同胞间移植是以低到测不到GVHD为特征的[3，4]。此外，在第1例报告移植中，使用一部分HLA位点不匹配的脐血，也限制GVHD的发生[4]。因此，一般认为脐血移植优于骨髓移植，是一种更具潜能的替代骨髓移植的方法。
为什么脐血能产生更低的免疫应答，是一个有待研究的问题。在本实验中，我们观察了脐血血清和成人血清对成人外周血T细胞和NK细胞的效应，由此进而阐明脐血移植的GVHD发病降低的分子机理。
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材料和方法
1.血清来源：随机获取健康足月产妇的脐带-胎盘血和20～50岁的健康成人外周血，标本分别来自苏州医学院(外周血)、苏州市妇幼保健院和苏州市第四人民医院产科(脐血)。
2.肿瘤靶细胞：NK敏感的K562细胞系，于RPMI 1640完全培养基中，用作检测NK杀伤活性实验的靶细胞。
3.试剂和方法
(1)主要试剂：胎牛血清(美国生命技术公司)；3H-TdR(放射性浓度为3.7×107 Bq/ml，中国原子能科学研究院)。HLA-DR MAb(FITC标记)、CD3MAb(PE标记)(北京邦定生物医学公司，进口分装)。
(2)血清制备和PBMC分离：无菌操作下经脐静脉穿刺收集健康顺产的产妇脐带血和静脉穿刺收集健康成人外周血，放置于抗凝和未抗凝的无菌试管内。将未抗凝试管放置37℃水浴1 h,400 g、20 min离心，然后吸出上层血清，置-20℃待测。同时将抗凝试管内的血液经密度梯度离心法分离PBMC，并计数细胞数，悬浮于RPMI 1640完全培养基中。
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(3)增殖试验：按文献[5]方法。
(4)免疫荧光双标记法进行T淋巴细胞表型分析：按文献[5]方法。
(5)NK细胞杀伤活性：按文献[6]方法。
4.本文数据采用SPSS软件，分别经假设条件检验(正态性W检验、方差齐性F检验)和t检验及方差分析(F检验)作统计分析。
结 果
1.不同血清对T淋巴细胞的增殖效应
4种血清对T淋巴细胞增殖计数(.min-1)均大于2 000，说明T淋巴细胞对促有丝分裂信号有反应。并随着血清浓度的增加，对PHA特异性增殖反应有所增加(见图1)。成人血清和AB血清的反应高峰均在稀释度为0.01处，随后下降。虽然脐血血清和胎牛血清也增加了T细胞对PHA的特异性增殖，但在稀释度0.10处没有达到峰值应答。
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图1 4种血清对T细胞增殖的影响
2. 4种血清对T淋巴细胞表面抗原表达的影响
从图2可以看出，在有丝分裂原PHA存在时，T淋巴细胞被活化。当PBMC加血清和PHA温育24 h后，表达HLA-DR的T淋巴细胞百分数发生了变化。与对照组(未加血清组)相比，成人血清和AB血清能增强T细胞对HLA-DR的表达，而脐血清和胎牛血清则无明显作用。
图2 4种血清对T细胞表达CD+3/HLA-DR+百分数的影响
3.两种不同的血清对NK细胞杀伤肿瘤靶细胞的影响
我们的研究表明，与成人血清相比较，脐血血清能降低NK细胞的杀伤肿瘤靶细胞活性，前者为(42.35±5.97)%，后者为(24.81±4.20)%，两者差异有显著性(t=2.4025，P<0.05)。
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讨 论
脐带血中含有丰富的造血干/祖细胞、基质细胞与造血因子，可作为一种极有潜力的造血干/祖细胞移植物来源。到目前为止，全世界已进行了600多例相关和无关供体的脐血移植[7]。有许多研究比较了脐血与成人血单个核细胞(MNC)免疫功能的不同，认为脐血移植病人的GVHD的发病与严重程度的降低是由于脐血淋巴细胞的免疫应答力降低[8]。Lee等[9]报道，在脐血中观察到一种特殊的T淋巴细胞群体(CD-3/CD-8)，而在成人外周血中没发现。推测这些T细胞亚群可能是淋巴生成细胞的前身细胞(T细胞谱系的)，这些T细胞的原始细胞和T细胞亚群的降低，导致了在细胞活化期间释放某些介质，如γ-Interferon(IFN-γ)、tumor necrosis factor-α(TNF-α)等。由于T细胞和NK细胞比较原始，没有被激活而致敏，因此也降低了机体的免疫应答。Harris等[10]发现，与成人相比较脐血中T细胞的绝对数CD+4、CD+8、CD+3是比较低的，但CD+4/CD+8比率较高。Risdon等[11]报道，脐血T淋巴细胞产生表面抗原、IL-2、IL-2R和IFN-γ的水平亦较成人为低，即使在某些外源性因子的作用下，其细胞毒活性仍相当弱，因而可能导致脐血移植的GVDH发生率比骨髓的要低。
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我们的研究发现，血清中所存在的可溶性因子在T淋巴细胞的活化中可能起了重要作用。从图1可见，脐血血清和成人血清都能增加丝裂原特异性T淋巴细胞增殖，成人血清在增殖反应中可达到峰值，而脐血血清在0.1的稀释度时还没有下降。同时经孵育后，成人血清还能增加PHA刺激PBMC中的T细胞表达HLA-DR的百分数(见图2)，而脐血血清却没有这种效应(两均数间差异有非常显著性，t=9.96，P<0.01)。另外，我们还观察到，不同种类的血清对NK细胞的活性亦有影响。脐血血清能降低成人PBMC对NK敏感的肿瘤靶细胞(K562细胞)的杀伤活性为(24.81±4.20)%，成人血清组为(42.35±5.97)%，两组之间差异有显著性(t=2.40，P<0.05)。NK细胞是参与GVHD的效应细胞，本实验结果显示脐血血清能降低NK细胞的活性，提示血清中存在的某些可溶性因子，可能与GVHD的发生机理有关。
我们的研究可能为脐血干/祖细胞治疗放射损伤病人及核事故受害者提供GVHD低发生率的有效治疗途径。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970244)；国家核工业基金资助项目(Y7197Q6206)
参考文献
1， Baranov A,Gale RP,Guskova A,et al.Bone marrow transplantation after the Chernobyl nuclear accident.New Engl J Med,1989,321:205-212.
2， Nugis VY,Knochalovskii MV.Bioloigical dosimetry,diagnosis,and treatment of bone-marrow syndrome in victims of the Chernobyl accident.Research Enterprises:Richland,Washington,1993,349-385.
, 百拇医药
3， Broxmeyer HE,Kurtzberg J,Gluckman E,et al.Umbilical cord blood hematopoietic stem cells and repopulating cells in human clinical transplantation,Blood Cells,1991,17:313.
4， Vilmers E,Sterkers G,Rahimy C,et al.HLA-mismatched cord blood transplantation in a patient with advanced leukemia.Transplantation,1992,53:1155.
5， Cohen SBA,Madrigal JA.Immunological and functional differences between cord and peripheral blood.Bone Marrow Transplant,1998,21:9-12.
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6， 朱寿彭，张澜生.医用同位素示踪技术.北京：原子能出版社，1989.134-137.
7， Rocha V,Chastang CI,Souillet G,et al.Related cord blood transplants:the Eurocord experience from 78 transplants.Bone Marrow Transplant,1998,21(30):59-62.
8， Newburger P,Quesenberry P.Umbilical cord blood as a new and promising source of unrelated-donor hematopoietic progenitor cells for transplantation.J Curr Opin Pediat,1996,8:29-32.
9， Lee S,Sune Y,Knoppel E,et al.Decreased interleukin-12 mRNA expression and protein production from activated cord vs.adult mononuclear cells:possible role in the decreased incidence of graft-vs-host disease post cord blood transplant.Blood,1995,86:163.
, 百拇医药
10， Harris D,Schumacher M,Locascio J, et al.Phenotypic and functional immaturity of human umbilical cord blood T lymphocytes.Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:10006.
11， Risdon G,Gaddy J,Stehman FB,et al.Proliferative and cytotoxic responses of human umbilical cord blood T lymphocytes following allogeneic stimulation.Celluar Immunol,1994,154:14-24.
(收稿日期:1999-10-19), 百拇医药
单位：张占英(215007 江苏，苏州大学放射医学系)；诸雪珍(苏州市妇幼保健院)；张澜生(215007 江苏，苏州大学放射医学系)；朱寿彭(215007 江苏，苏州大学放射医学系)
关键词：脐血血清；T淋巴细胞；可溶性因子；GVHD
中华放射医学与防护杂志000407 【摘要】 目的 通过对脐血和外周血免疫功能的比较，探讨了脐血移植中移植物抗宿主病(GVHD)低发生率的分子机理。方法 经增殖试验、NK杀伤活性试验及免疫荧光双标记方法研究了4种血清对T细胞免疫功能的影响。结果 与成人血清相比较，脐血血清能降低NK细胞杀伤肿瘤靶细胞的活性；同时脐血血清和成人血清都能增加丝裂原特异性T淋巴细胞增殖，成人血清在增殖反应中可达到峰值，而脐血血清没有达到峰值效应，甚至在0.1的稀释度时仍没有下降；成人血清能增加PHA刺激外周血单个核细胞(PBMC)中的T淋巴细胞HLA-DR表达，而脐血血清却没有这种效应。结论 血清中所分泌的某些可溶性因子可能在T细胞活化中起重要作用，与GVHD发生机理相关联。
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Mechanism of low GVHD incidence in umbilical cord blood transplantation
ZHANG Zhanying,ZHU Xuezhen,ZHANG Lansheng, et al.
(Department of Radiation Medicine,Soochow University,Suzhou 215007,China)
【Abstract】 Objective To compare the immunological function between umbilical cord blood (UCB) and peripheral blood, and to explore the mechanism of low incidence of graft-versus host disease (GVHD) in UCB transplantation. Methods The proliferation assay,NK cell killing activity assay and immunologic fluorescence double label technique were used to study four sear effect on T cell immunologic function. Results UCB serum could reduce K562 cell activity, compared to that of adult serum.Furthermore,adult serum will enhanced the percentage of HLA-DR expression of T cells on PHA-stimulated PBMC,whereas fetal serum has no such effect.Both adult and fetal serum enhanced mitogen-specific T cell proliferation,the peak proliferative response could be reached with adult serum but not with fetal serum. Conclusion There must be some soluble factors secreted into serum,which play a role in T cell activation and associate with the incidence of GVHD.
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【Key words】 Umbilical cord blood; T cells; Soluble factors; Graft-versus-host disease
实验表明，接受人类白细胞抗原(HLA)相配骨髓移植的病人，不管移植后是否应用免疫抑制剂，大约有一半人发生急性移植物抗宿主病(GVHD)。在切尔诺贝利核电站事故发生后，13例进行骨髓移植的病人中，9例移植成功，但是只有2例存活，其他7人死于烧伤等综合征或骨髓移植并发症，主要是GVHD[1，2]。与此相反，应用HLA相配脐血儿童的同胞间移植是以低到测不到GVHD为特征的[3，4]。此外，在第1例报告移植中，使用一部分HLA位点不匹配的脐血，也限制GVHD的发生[4]。因此，一般认为脐血移植优于骨髓移植，是一种更具潜能的替代骨髓移植的方法。
为什么脐血能产生更低的免疫应答，是一个有待研究的问题。在本实验中，我们观察了脐血血清和成人血清对成人外周血T细胞和NK细胞的效应，由此进而阐明脐血移植的GVHD发病降低的分子机理。
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材料和方法
1.血清来源：随机获取健康足月产妇的脐带-胎盘血和20～50岁的健康成人外周血，标本分别来自苏州医学院(外周血)、苏州市妇幼保健院和苏州市第四人民医院产科(脐血)。
2.肿瘤靶细胞：NK敏感的K562细胞系，于RPMI 1640完全培养基中，用作检测NK杀伤活性实验的靶细胞。
3.试剂和方法
(1)主要试剂：胎牛血清(美国生命技术公司)；3H-TdR(放射性浓度为3.7×107 Bq/ml，中国原子能科学研究院)。HLA-DR MAb(FITC标记)、CD3MAb(PE标记)(北京邦定生物医学公司，进口分装)。
(2)血清制备和PBMC分离：无菌操作下经脐静脉穿刺收集健康顺产的产妇脐带血和静脉穿刺收集健康成人外周血，放置于抗凝和未抗凝的无菌试管内。将未抗凝试管放置37℃水浴1 h,400 g、20 min离心，然后吸出上层血清，置-20℃待测。同时将抗凝试管内的血液经密度梯度离心法分离PBMC，并计数细胞数，悬浮于RPMI 1640完全培养基中。
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(3)增殖试验：按文献[5]方法。
(4)免疫荧光双标记法进行T淋巴细胞表型分析：按文献[5]方法。
(5)NK细胞杀伤活性：按文献[6]方法。
4.本文数据采用SPSS软件，分别经假设条件检验(正态性W检验、方差齐性F检验)和t检验及方差分析(F检验)作统计分析。
结 果
1.不同血清对T淋巴细胞的增殖效应
4种血清对T淋巴细胞增殖计数(.min-1)均大于2 000，说明T淋巴细胞对促有丝分裂信号有反应。并随着血清浓度的增加，对PHA特异性增殖反应有所增加(见图1)。成人血清和AB血清的反应高峰均在稀释度为0.01处，随后下降。虽然脐血血清和胎牛血清也增加了T细胞对PHA的特异性增殖，但在稀释度0.10处没有达到峰值应答。
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图1 4种血清对T细胞增殖的影响
2. 4种血清对T淋巴细胞表面抗原表达的影响
从图2可以看出，在有丝分裂原PHA存在时，T淋巴细胞被活化。当PBMC加血清和PHA温育24 h后，表达HLA-DR的T淋巴细胞百分数发生了变化。与对照组(未加血清组)相比，成人血清和AB血清能增强T细胞对HLA-DR的表达，而脐血清和胎牛血清则无明显作用。
图2 4种血清对T细胞表达CD+3/HLA-DR+百分数的影响
3.两种不同的血清对NK细胞杀伤肿瘤靶细胞的影响
我们的研究表明，与成人血清相比较，脐血血清能降低NK细胞的杀伤肿瘤靶细胞活性，前者为(42.35±5.97)%，后者为(24.81±4.20)%，两者差异有显著性(t=2.4025，P<0.05)。
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讨 论
脐带血中含有丰富的造血干/祖细胞、基质细胞与造血因子，可作为一种极有潜力的造血干/祖细胞移植物来源。到目前为止，全世界已进行了600多例相关和无关供体的脐血移植[7]。有许多研究比较了脐血与成人血单个核细胞(MNC)免疫功能的不同，认为脐血移植病人的GVHD的发病与严重程度的降低是由于脐血淋巴细胞的免疫应答力降低[8]。Lee等[9]报道，在脐血中观察到一种特殊的T淋巴细胞群体(CD-3/CD-8)，而在成人外周血中没发现。推测这些T细胞亚群可能是淋巴生成细胞的前身细胞(T细胞谱系的)，这些T细胞的原始细胞和T细胞亚群的降低，导致了在细胞活化期间释放某些介质，如γ-Interferon(IFN-γ)、tumor necrosis factor-α(TNF-α)等。由于T细胞和NK细胞比较原始，没有被激活而致敏，因此也降低了机体的免疫应答。Harris等[10]发现，与成人相比较脐血中T细胞的绝对数CD+4、CD+8、CD+3是比较低的，但CD+4/CD+8比率较高。Risdon等[11]报道，脐血T淋巴细胞产生表面抗原、IL-2、IL-2R和IFN-γ的水平亦较成人为低，即使在某些外源性因子的作用下，其细胞毒活性仍相当弱，因而可能导致脐血移植的GVDH发生率比骨髓的要低。
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我们的研究发现，血清中所存在的可溶性因子在T淋巴细胞的活化中可能起了重要作用。从图1可见，脐血血清和成人血清都能增加丝裂原特异性T淋巴细胞增殖，成人血清在增殖反应中可达到峰值，而脐血血清在0.1的稀释度时还没有下降。同时经孵育后，成人血清还能增加PHA刺激PBMC中的T细胞表达HLA-DR的百分数(见图2)，而脐血血清却没有这种效应(两均数间差异有非常显著性，t=9.96，P<0.01)。另外，我们还观察到，不同种类的血清对NK细胞的活性亦有影响。脐血血清能降低成人PBMC对NK敏感的肿瘤靶细胞(K562细胞)的杀伤活性为(24.81±4.20)%，成人血清组为(42.35±5.97)%，两组之间差异有显著性(t=2.40，P<0.05)。NK细胞是参与GVHD的效应细胞，本实验结果显示脐血血清能降低NK细胞的活性，提示血清中存在的某些可溶性因子，可能与GVHD的发生机理有关。
我们的研究可能为脐血干/祖细胞治疗放射损伤病人及核事故受害者提供GVHD低发生率的有效治疗途径。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970244)；国家核工业基金资助项目(Y7197Q6206)
参考文献
1， Baranov A,Gale RP,Guskova A,et al.Bone marrow transplantation after the Chernobyl nuclear accident.New Engl J Med,1989,321:205-212.
2， Nugis VY,Knochalovskii MV.Bioloigical dosimetry,diagnosis,and treatment of bone-marrow syndrome in victims of the Chernobyl accident.Research Enterprises:Richland,Washington,1993,349-385.
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3， Broxmeyer HE,Kurtzberg J,Gluckman E,et al.Umbilical cord blood hematopoietic stem cells and repopulating cells in human clinical transplantation,Blood Cells,1991,17:313.
4， Vilmers E,Sterkers G,Rahimy C,et al.HLA-mismatched cord blood transplantation in a patient with advanced leukemia.Transplantation,1992,53:1155.
5， Cohen SBA,Madrigal JA.Immunological and functional differences between cord and peripheral blood.Bone Marrow Transplant,1998,21:9-12.
, http://www.100md.com
6， 朱寿彭，张澜生.医用同位素示踪技术.北京：原子能出版社，1989.134-137.
7， Rocha V,Chastang CI,Souillet G,et al.Related cord blood transplants:the Eurocord experience from 78 transplants.Bone Marrow Transplant,1998,21(30):59-62.
8， Newburger P,Quesenberry P.Umbilical cord blood as a new and promising source of unrelated-donor hematopoietic progenitor cells for transplantation.J Curr Opin Pediat,1996,8:29-32.
9， Lee S,Sune Y,Knoppel E,et al.Decreased interleukin-12 mRNA expression and protein production from activated cord vs.adult mononuclear cells:possible role in the decreased incidence of graft-vs-host disease post cord blood transplant.Blood,1995,86:163.
, 百拇医药
10， Harris D,Schumacher M,Locascio J, et al.Phenotypic and functional immaturity of human umbilical cord blood T lymphocytes.Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:10006.
11， Risdon G,Gaddy J,Stehman FB,et al.Proliferative and cytotoxic responses of human umbilical cord blood T lymphocytes following allogeneic stimulation.Celluar Immunol,1994,154:14-24.
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