小鼠乳腺癌辐射敏感细胞SX-9的ku基因突变与辐射敏感性研究
作者：江国春 袁丽珍 魏康 郭学敏 张雪峰 贾向旭
单位：100850 北京放射医学研究所
关键词：辐射敏感性；ku基因；基因突变
中华放射医学与防护杂志000406 【摘要】 目的 研究辐射敏感小鼠乳腺癌细胞SX-9的ku70、ku80基因型，初步探讨ku基因突变对其辐射敏感性的影响。方法 RT-PCR克隆并鉴定ku70/ku80全长基因，并对其全长进行全自动测序。脂质体转染正常人全长ku80 cDNA至SX-9细胞，克隆形成比较转染了正常ku80基因的SX-9与SX-9以及SR-1细胞存活率。结果 SX-9细胞ku70基因正常，而其ku80存在基因突变，转染了正常人全长ku80 cDNA的SX-9细胞能部分重建其对γ射线的存活率。结论 SX-9细胞ku基因发生突变，这可能是其DNA损伤修复缺陷并导致对辐射敏感的分子基础。
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ku gene mutation of radiosensitive mouse mammary carcinoma-derived cell line SX-9
JIANG Guochun,YUAN Lizhen,WEI Kang,et al.
(Institute of Radiation Medicine Beijing,100850,China)
【Abstract】 Objective To investigate the ku gene status of radiosensitive cell line SX-9 and the effects of ku80 gene mutation on radiosensitivity of SX-9. Methods After comparing the ku70/80 gene status of SX-9 to SR-1 with molecular cloning,the survival fraction of SX-9 transfected with wild-type human ku80,SX-9 and SR-1 was investigated by clonogenic assay. Results Radiosensitive mouse mammary carcinoma-derived cell line SX-9 bore mutation in ku80 gene,and its survival fraction after γ-ray irradiation could be restored by transfection of wild-type human ku80 gene. Conclusions There are two mutation sites in ku80 gene in radiosensitive mouse mammary carcinoma-derived cell line SX-9,which could be the cause of its deficiency in repair of DNA double strand breaks.
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【Key words】 Radiosensitivity; ku gene; Gene mutation
电离辐射可导致DNA损伤，双链断裂(DSB)是其DNA损伤形式之一。DSB可通过同源重组或非同源末端连接(NHEJ)实现修复，哺乳动物中参与NHEJ途径的分子主要有XRCC4、DNA-PK、连接酶IV以及其他多种蛋白组分等。DNA-PK是由Ku70、Ku80以及DNA-PKcs三亚基组成，其中Ku70、Ku80组成Ku蛋白亚基[1]。SX-9细胞是小鼠乳腺癌辐射敏感突变细胞，研究认为DNA损伤修复缺陷是其辐射敏感的主要原因[2]。为进一步了解其DNA损伤修复缺陷的分子机理，作者对其ku基因型进行研究，以探讨ku基因突变对SX-9细胞的辐射敏感性以及DNA损伤修复的影响。
材料和方法
1.细胞株：SX-9、SR-1小鼠乳腺癌细胞，日本放射线研究所佐藤弘毅教授处引进。
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2.细胞培养：SX-9和SR-1细胞在体积分数为5%的CO2、体积分数为10%的胎牛血清1640培养基中、37℃、饱和湿度培养。
3.细胞总RNA提取：对数生长期细胞离心弃培养基，PBS洗涤后，用Promage总RNA提取试剂盒提取，RNA溶于300 μl无RNase水中，定量，-20℃贮存。
4.RT-PCR克隆ku基因编码区cDNA
ku基因cDNA引物的设计与合成[3]：引物由因特网上提供的Primers PCR引物设计软件辅助设计，并由Sybersyn公司(USA)合成。
ku70：
上游引物：5′-CGGAATTCTCAAATCACCTGAGGACCAGC-3′
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下游引物：5′-CGGAATTCCTTGGTAAGAACACAAGCAGG-3′
ku80：
上游引物：5′-CGGAATTCTCAAATCACCTGAGGACCAGC-3′
下游引物：5′-CGGAATTCAGAGCTGGCACTCTTGGATTC-3′
在0.5 ml离心管中加入如下体系进行逆转录实验：总RNA约1 μg，逆转录酶缓冲液2 μl，RNasin 1 μl,Oligo(dT)15～18 1 μl，逆转录酶0.5 μl,ddH2O加至20 μl，42 ℃水浴1.5 h，95℃变性5 min,-20℃贮存。ku基因RT-PCR扩增：取1 μl逆转录cDNA，加入20 μl PCR Mix,1 μl ExTaq (1 U/μl)，2滴石蜡油，离心数秒，按以下参数扩增35个循环：94 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，PCR循环结束后取5 μl产物1%的琼脂糖凝胶进行电泳，紫外灯下观察，ku70基因编码区cDNA PCR扩增片段长约1 800 bp，ku80基因编码区cDNA PCR扩增片段长约2 200 bp。
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5.ku基因PCR产物的分子克隆：参考分子克隆操作手册有关章节[4]。
6.外源基因转染SX-9细胞[5]：将溶于无血清1640培养基的2 μg pcDNA3\^0-ku80质粒与10 μl脂质体混合后，加入到2×105细胞中，37℃ 5～7 h后加入完全培养基，继续培养48 h，细胞离心，用含G418的1640完全培养基筛选3～4次，然后极限稀释并接种于96孔培养板，7～14 d后将单克隆细胞接种于6孔板，然后提取细胞总RNA，用RT-PCR进行鉴定外源基因的表达。人ku80 PCR引物[5]为：上游引物：5′-ACCAAAGCGCCTGAGGAC-3′
下游引物：5′-CCCATACATCCACGACCTA-3′。
7.细胞存活率测定：取对数生长期细胞，接种适量的细胞数，60Co γ射线照射不同剂量，接种于甲基纤维素半固体培养基中，37℃、体积分数为5%的CO2培养7～14 d后，计算细胞克隆数。每个克隆须含50个以上的细胞。
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8.统计学处理：采用t检验。
结 果
1.RT-PCR克隆SX-9细胞ku基因cDNA
逆转录-PCR分别扩增SX-9和SR-1 ku70、ku80基因，然后将其克隆进pUC-或pGEM-T载体，用EcoRI酶切鉴定出在载体DNA带前长约1 800 bp的ku70基因cDNA和长约2 200 bp的ku80基因cDNA(见图1)。
限制性内切鉴定正确后，用全自动核酸测序仪对ku70、ku80基因进行全长测序。我们发现：SX-9 ku70基因正常，而SX-9 ku80基因存在两处基因突变，即G1233→A1233，A1707→C1707相应氨基酸残基由Ala411→Thr411,Thr569→Pro569，此DNA顺序已登录GenBank，登录号为AF166486。
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图1 ku70、ku80重组T载体的酶切鉴定
M：λDNA/EcoRI+Hind Ⅲ分子量标准
1、2：SX-9、SR-1细胞ku70-pGEMT载体EcoRI酶切鉴定
3、4：SX-9、SR-1细胞ku80-pUCT载体EcoRI酶切鉴定
2.转染细胞的单克隆挑选与RT-PCR鉴定
转染了人ku80基因的SX-9细胞G418筛选3～4轮后，极限稀释接种于96孔板，待长成单克隆后接种于6孔板，然后提取细胞总RNA、RT-PCR扩增人ku80基因进行鉴定(见图2)。转染了外源基因的细胞中有人ku80 mRNA表达，而对照细胞无表达，表明所筛选的细胞已经转染进人ku80基因，并有稳定表达。
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图2 人ku80基因转染细胞的RT-PCR鉴定
M：λDNA/EcoR Ⅰ+Hind Ⅲ分子量标准
2、3、4、5、6：转染了人ku80基因的细胞克隆的RT-PCR
1：对照细胞的RT-PCR
3.转染外源ku80基因的SX-9细胞存活率测定
转染外源ku80基因的SX-9(SX-9T)、SX-9和SR-1细胞经不同剂量γ射线照射后，接种于甲基纤维素半固体培养基中。培养7～14 d后，计算细胞集落数。接种效率为0.10～0.20，SX-9T和SX-9在1、2和4 Gy处存活率差异有显著性(P<0.01)(见图3)。表明SX-9细胞转染外源ku80基因后细胞存活率得到重建，进一步验证了SX-9是ku基因突变细胞。
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图3 转染前后SX-9与SR-1细胞存活率比较
讨 论
X射线照射后SX-9细胞DNA断裂重接速率和重接水平明显低于亲本细胞SR-1，所以SX-9是DNA损伤修复缺陷细胞。通过比较研究，我们发现SX-9细胞ku70基因正常，但是其ku80存在基因突变，即G1233突变为A1233，基因突变导致相应的Ala411突变为Thr411。Osipovich[6]等用LexA-酵母双杂交系统筛选出的Ku70/Ku80相互作用区域位于Ku80第449～477氨基酸残基处，并且用体外共转染的方法进行证实，因而认为Ku80的C-末端是其与Ku70相互作用的关键区域；Cary[7]等用Gal4-酵母双杂交系统筛选出的Ku70/Ku80相互作用区域位于Ku80第221～417氨基酸残基处，此结果用体内共转染的方法进一步得到了证实，所以他们认为Ku80与Ku70相互作用的关键区域位于Ku80蛋白的中间位置；Koike[8]等认为Ku80与Ku70相互作用区域位于Ku80第374～502氨基酸残基处。最近，Singleton[9]等发现Ku80的C-末端对于激活DNA-PK激酶活性具有重要作用，但此178个氨基酸残基的缺失不影响Ku80与双链断裂末端DNA的结合。由此可见，SX-9细胞Ku80基因突变位于其与Ku70相互作用的区域，并且也位于其与双链末端DNA相结合的位置，氨基酸残基的改变会引起Ku蛋白构像改变，进而导致蛋白高级结构的变化，使Ku80蛋白/Ku70蛋白相互作用受阻，进而影响SX-9细胞Ku蛋白与DNA-PKcs以及双链断裂DNA的相互作用，使其DNA损伤修复功能异常。由于突变位置远离Ku80 C-末端，所以其Ku80与DNA-PKcs的相互作用可能正常。基因转染后SX-9细胞存活率得到重建，进一步证实SX-9细胞Ku80基因突变的结果，从而部分解释了SX-9细胞对辐射敏感的分子机理。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39900031)
参考文献
1，Jeggo PA.Identification of genes involved in repair of DNA double-strand breaks in mammary cells.Radiat Res,1998,150(Suppl):S80-S91.
2，周平坤，魏康.小鼠乳癌细胞辐射敏感突变株SX-9DNA双链断裂及重接修复研究.辐射研究与辐射工艺学报，1992，10：44-47.
3，Falzon M,Kuff EL.The nucleotide sequence of a mouse cDNA encoding the 80kDa subunit of the Ku (ku70/ku80) autoantigen.Nucleic Acids Res,1992,20:3784.
, http://www.100md.com
4 萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿姆斯T，等.分子克隆.金冬雁，黎孟岚译.北京：科学出版社，1995.16-69.
5，奥斯特F，布伦特R，金斯顿RE，等.精编分子生物学实验指南.颜子颖，王海林译.北京：科学出版社，1998.274-288.
6，Osipovich O,Durum SK,Muegge K.Defining the minimal domain of ku80 for interaction with ku70.J Biol Chem,1997,272:27259-27265.
7， Cary RB,Chen F,Shen Z,et al.A central region of ku80 mediates interaction with ku70 in vivo.Nucleic Acids Res,1998,26:974-979.
, 百拇医药
8， Koike M,Miyasaka T,Mimori T,et al.Subcellular location and protein-protein interaction region of Ku proteins.Biochem Biophys Res Commun,1998,252:679-685.
9， Singleton BK,Torres Arzayas MT,Rottinghaus ST,et al.The C-terminus of ku80 activates the DNA-PK catalytic subunits.Mol Cell Biol,1999,19:3267-3277.
(收稿日期:1999-09-28), 百拇医药
单位：100850 北京放射医学研究所
关键词：辐射敏感性；ku基因；基因突变
中华放射医学与防护杂志000406 【摘要】 目的 研究辐射敏感小鼠乳腺癌细胞SX-9的ku70、ku80基因型，初步探讨ku基因突变对其辐射敏感性的影响。方法 RT-PCR克隆并鉴定ku70/ku80全长基因，并对其全长进行全自动测序。脂质体转染正常人全长ku80 cDNA至SX-9细胞，克隆形成比较转染了正常ku80基因的SX-9与SX-9以及SR-1细胞存活率。结果 SX-9细胞ku70基因正常，而其ku80存在基因突变，转染了正常人全长ku80 cDNA的SX-9细胞能部分重建其对γ射线的存活率。结论 SX-9细胞ku基因发生突变，这可能是其DNA损伤修复缺陷并导致对辐射敏感的分子基础。
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ku gene mutation of radiosensitive mouse mammary carcinoma-derived cell line SX-9
JIANG Guochun,YUAN Lizhen,WEI Kang,et al.
(Institute of Radiation Medicine Beijing,100850,China)
【Abstract】 Objective To investigate the ku gene status of radiosensitive cell line SX-9 and the effects of ku80 gene mutation on radiosensitivity of SX-9. Methods After comparing the ku70/80 gene status of SX-9 to SR-1 with molecular cloning,the survival fraction of SX-9 transfected with wild-type human ku80,SX-9 and SR-1 was investigated by clonogenic assay. Results Radiosensitive mouse mammary carcinoma-derived cell line SX-9 bore mutation in ku80 gene,and its survival fraction after γ-ray irradiation could be restored by transfection of wild-type human ku80 gene. Conclusions There are two mutation sites in ku80 gene in radiosensitive mouse mammary carcinoma-derived cell line SX-9,which could be the cause of its deficiency in repair of DNA double strand breaks.
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【Key words】 Radiosensitivity; ku gene; Gene mutation
电离辐射可导致DNA损伤，双链断裂(DSB)是其DNA损伤形式之一。DSB可通过同源重组或非同源末端连接(NHEJ)实现修复，哺乳动物中参与NHEJ途径的分子主要有XRCC4、DNA-PK、连接酶IV以及其他多种蛋白组分等。DNA-PK是由Ku70、Ku80以及DNA-PKcs三亚基组成，其中Ku70、Ku80组成Ku蛋白亚基[1]。SX-9细胞是小鼠乳腺癌辐射敏感突变细胞，研究认为DNA损伤修复缺陷是其辐射敏感的主要原因[2]。为进一步了解其DNA损伤修复缺陷的分子机理，作者对其ku基因型进行研究，以探讨ku基因突变对SX-9细胞的辐射敏感性以及DNA损伤修复的影响。
材料和方法
1.细胞株：SX-9、SR-1小鼠乳腺癌细胞，日本放射线研究所佐藤弘毅教授处引进。
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2.细胞培养：SX-9和SR-1细胞在体积分数为5%的CO2、体积分数为10%的胎牛血清1640培养基中、37℃、饱和湿度培养。
3.细胞总RNA提取：对数生长期细胞离心弃培养基，PBS洗涤后，用Promage总RNA提取试剂盒提取，RNA溶于300 μl无RNase水中，定量，-20℃贮存。
4.RT-PCR克隆ku基因编码区cDNA
ku基因cDNA引物的设计与合成[3]：引物由因特网上提供的Primers PCR引物设计软件辅助设计，并由Sybersyn公司(USA)合成。
ku70：
上游引物：5′-CGGAATTCTCAAATCACCTGAGGACCAGC-3′
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下游引物：5′-CGGAATTCCTTGGTAAGAACACAAGCAGG-3′
ku80：
上游引物：5′-CGGAATTCTCAAATCACCTGAGGACCAGC-3′
下游引物：5′-CGGAATTCAGAGCTGGCACTCTTGGATTC-3′
在0.5 ml离心管中加入如下体系进行逆转录实验：总RNA约1 μg，逆转录酶缓冲液2 μl，RNasin 1 μl,Oligo(dT)15～18 1 μl，逆转录酶0.5 μl,ddH2O加至20 μl，42 ℃水浴1.5 h，95℃变性5 min,-20℃贮存。ku基因RT-PCR扩增：取1 μl逆转录cDNA，加入20 μl PCR Mix,1 μl ExTaq (1 U/μl)，2滴石蜡油，离心数秒，按以下参数扩增35个循环：94 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，PCR循环结束后取5 μl产物1%的琼脂糖凝胶进行电泳，紫外灯下观察，ku70基因编码区cDNA PCR扩增片段长约1 800 bp，ku80基因编码区cDNA PCR扩增片段长约2 200 bp。
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5.ku基因PCR产物的分子克隆：参考分子克隆操作手册有关章节[4]。
6.外源基因转染SX-9细胞[5]：将溶于无血清1640培养基的2 μg pcDNA3\^0-ku80质粒与10 μl脂质体混合后，加入到2×105细胞中，37℃ 5～7 h后加入完全培养基，继续培养48 h，细胞离心，用含G418的1640完全培养基筛选3～4次，然后极限稀释并接种于96孔培养板，7～14 d后将单克隆细胞接种于6孔板，然后提取细胞总RNA，用RT-PCR进行鉴定外源基因的表达。人ku80 PCR引物[5]为：上游引物：5′-ACCAAAGCGCCTGAGGAC-3′
下游引物：5′-CCCATACATCCACGACCTA-3′。
7.细胞存活率测定：取对数生长期细胞，接种适量的细胞数，60Co γ射线照射不同剂量，接种于甲基纤维素半固体培养基中，37℃、体积分数为5%的CO2培养7～14 d后，计算细胞克隆数。每个克隆须含50个以上的细胞。
, http://www.100md.com
8.统计学处理：采用t检验。
结 果
1.RT-PCR克隆SX-9细胞ku基因cDNA
逆转录-PCR分别扩增SX-9和SR-1 ku70、ku80基因，然后将其克隆进pUC-或pGEM-T载体，用EcoRI酶切鉴定出在载体DNA带前长约1 800 bp的ku70基因cDNA和长约2 200 bp的ku80基因cDNA(见图1)。
限制性内切鉴定正确后，用全自动核酸测序仪对ku70、ku80基因进行全长测序。我们发现：SX-9 ku70基因正常，而SX-9 ku80基因存在两处基因突变，即G1233→A1233，A1707→C1707相应氨基酸残基由Ala411→Thr411,Thr569→Pro569，此DNA顺序已登录GenBank，登录号为AF166486。
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图1 ku70、ku80重组T载体的酶切鉴定
M：λDNA/EcoRI+Hind Ⅲ分子量标准
1、2：SX-9、SR-1细胞ku70-pGEMT载体EcoRI酶切鉴定
3、4：SX-9、SR-1细胞ku80-pUCT载体EcoRI酶切鉴定
2.转染细胞的单克隆挑选与RT-PCR鉴定
转染了人ku80基因的SX-9细胞G418筛选3～4轮后，极限稀释接种于96孔板，待长成单克隆后接种于6孔板，然后提取细胞总RNA、RT-PCR扩增人ku80基因进行鉴定(见图2)。转染了外源基因的细胞中有人ku80 mRNA表达，而对照细胞无表达，表明所筛选的细胞已经转染进人ku80基因，并有稳定表达。
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图2 人ku80基因转染细胞的RT-PCR鉴定
M：λDNA/EcoR Ⅰ+Hind Ⅲ分子量标准
2、3、4、5、6：转染了人ku80基因的细胞克隆的RT-PCR
1：对照细胞的RT-PCR
3.转染外源ku80基因的SX-9细胞存活率测定
转染外源ku80基因的SX-9(SX-9T)、SX-9和SR-1细胞经不同剂量γ射线照射后，接种于甲基纤维素半固体培养基中。培养7～14 d后，计算细胞集落数。接种效率为0.10～0.20，SX-9T和SX-9在1、2和4 Gy处存活率差异有显著性(P<0.01)(见图3)。表明SX-9细胞转染外源ku80基因后细胞存活率得到重建，进一步验证了SX-9是ku基因突变细胞。
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图3 转染前后SX-9与SR-1细胞存活率比较
讨 论
X射线照射后SX-9细胞DNA断裂重接速率和重接水平明显低于亲本细胞SR-1，所以SX-9是DNA损伤修复缺陷细胞。通过比较研究，我们发现SX-9细胞ku70基因正常，但是其ku80存在基因突变，即G1233突变为A1233，基因突变导致相应的Ala411突变为Thr411。Osipovich[6]等用LexA-酵母双杂交系统筛选出的Ku70/Ku80相互作用区域位于Ku80第449～477氨基酸残基处，并且用体外共转染的方法进行证实，因而认为Ku80的C-末端是其与Ku70相互作用的关键区域；Cary[7]等用Gal4-酵母双杂交系统筛选出的Ku70/Ku80相互作用区域位于Ku80第221～417氨基酸残基处，此结果用体内共转染的方法进一步得到了证实，所以他们认为Ku80与Ku70相互作用的关键区域位于Ku80蛋白的中间位置；Koike[8]等认为Ku80与Ku70相互作用区域位于Ku80第374～502氨基酸残基处。最近，Singleton[9]等发现Ku80的C-末端对于激活DNA-PK激酶活性具有重要作用，但此178个氨基酸残基的缺失不影响Ku80与双链断裂末端DNA的结合。由此可见，SX-9细胞Ku80基因突变位于其与Ku70相互作用的区域，并且也位于其与双链末端DNA相结合的位置，氨基酸残基的改变会引起Ku蛋白构像改变，进而导致蛋白高级结构的变化，使Ku80蛋白/Ku70蛋白相互作用受阻，进而影响SX-9细胞Ku蛋白与DNA-PKcs以及双链断裂DNA的相互作用，使其DNA损伤修复功能异常。由于突变位置远离Ku80 C-末端，所以其Ku80与DNA-PKcs的相互作用可能正常。基因转染后SX-9细胞存活率得到重建，进一步证实SX-9细胞Ku80基因突变的结果，从而部分解释了SX-9细胞对辐射敏感的分子机理。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39900031)
参考文献
1，Jeggo PA.Identification of genes involved in repair of DNA double-strand breaks in mammary cells.Radiat Res,1998,150(Suppl):S80-S91.
2，周平坤，魏康.小鼠乳癌细胞辐射敏感突变株SX-9DNA双链断裂及重接修复研究.辐射研究与辐射工艺学报，1992，10：44-47.
3，Falzon M,Kuff EL.The nucleotide sequence of a mouse cDNA encoding the 80kDa subunit of the Ku (ku70/ku80) autoantigen.Nucleic Acids Res,1992,20:3784.
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4 萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿姆斯T，等.分子克隆.金冬雁，黎孟岚译.北京：科学出版社，1995.16-69.
5，奥斯特F，布伦特R，金斯顿RE，等.精编分子生物学实验指南.颜子颖，王海林译.北京：科学出版社，1998.274-288.
6，Osipovich O,Durum SK,Muegge K.Defining the minimal domain of ku80 for interaction with ku70.J Biol Chem,1997,272:27259-27265.
7， Cary RB,Chen F,Shen Z,et al.A central region of ku80 mediates interaction with ku70 in vivo.Nucleic Acids Res,1998,26:974-979.
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8， Koike M,Miyasaka T,Mimori T,et al.Subcellular location and protein-protein interaction region of Ku proteins.Biochem Biophys Res Commun,1998,252:679-685.
9， Singleton BK,Torres Arzayas MT,Rottinghaus ST,et al.The C-terminus of ku80 activates the DNA-PK catalytic subunits.Mol Cell Biol,1999,19:3267-3277.
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