人脐血分次移植重症联合免疫缺陷小鼠的实验研究
作者：吴建秋 杨云纺 金志军 蔡建明 杨如俊 项莺松
单位：吴建秋(200003 上海，第二军医大学附属长征医院妇产科)；杨云纺(200003 上海，第二军医大学附属长征医院妇产科)；金志军(200003 上海，第二军医大学附属长征医院妇产科)；蔡建明(防原医学研究室)；杨如俊(防原医学研究室)；项莺松(防原医学研究室)
关键词：脐血；造血干细胞；重症联合免疫缺陷小鼠；分次移植
中华放射医学与防护杂志000405 【摘要】 目的 探讨提高脐血移植效果的新方法，进一步了解脐血造血干细胞体内生长特性。方法 以经亚致死剂量γ射线照射后的重症联合免疫缺陷小鼠为动物模型，进行冻存人脐血的分次移植。利用人粒-单系祖细胞培养及流式细胞仪，检测植入小鼠骨髓等器官中人源性细胞。结果与一次移植相比，分次移植相同细胞数时，小鼠骨髓中人CD45+、CD34+细胞水平明显提高；分次移植细胞数降低到20%时，其造血及部分免疫功能恢复到相近水平。结论 脐血分次移植提高了干细胞的植入率，为临床成人脐血移植提供了一条新思路。
, 百拇医药
Scheduled transplantation of human umbilical cord blood to severe combined immunodificient mice
WU Jianqiu,YANG Yunfang,JIN Zhijun,et al.
(Changzheng Hospital,Affiliated to the Second Military Medical University,Shanghai 200003,China)
【Abstract】 Objective To explore a new method for developing the efficiency of human umbilical cord blood (UCB) cells engraftment,and further understand the growth characteristic of hematopoietic stem cells (HSC) in vivo. Methods Sublethally irradiated severe combined immunodeficient (SCID) mice were transplanted i.v.with UCB cells which had been cryopreserved at -80℃.The human cells in recipient mice were detected by flow cytometry and CFU-GM assay. Results In contrast to the single transplantation,scheduled engraftment of similar numbers of UCB cells resulted in a proportionally obvious increase in the percentages of CD45+,CD34+ cells produced in SCID mouse bone marrow (BM).When the donor cells were reduced to 20 percent,an identical reconstitution of both hematopoietic and part of immunologic functions was achieved. Conclusion Scheduled engraftment improves the repopulating ability of HSC,which would provide a novel way for clinical cord blood engraftment in adult objects.
, 百拇医药
【Key words】 Umbilical cord blood; Hematopoietic stem cells; SCID mice; Scheduled transplantation
脐血移植是目前血液学研究热点之一，由于脐血细胞数量的有限性，人们正通过不同手段来解决这一难题，如多份无关供体脐血的混合移植或单份脐血体外扩增后的脐血移植等，但由于移植物抗宿主病(GVHD)或干细胞分化等原因，其进展受到一定限制。本实验在已建立的SCID-hu小鼠模型[1，2]小鼠骨髓分次移植[3]方法的基础上，采用了人脐血的分次移植，旨在为临床合理地开发和应用脐血提供实验基础。
材料和方法
1.动物：C.B-17 SCID小鼠购自上海肿瘤生物技术研究所，SPF级饲养于本校东方肝胆外科医院动物中心，饲料、饮水及垫料均经高压灭菌。小鼠6～8 周龄，雌性，体重(20±2)g，实验前至少饲养1周。
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2.脐血：人脐血采自本校长征医院产科正常足月顺产胎儿，孕产妇无妊娠合并症或并发症。采集后2 h内与二甲亚砜(DMSO)混合，终浓度为10%，直接放入-80℃深低温冰箱保存，常规复苏后立即输注给受体小鼠。
3.一次移植时吸收剂量及吸收剂量率分组：受体鼠预处理为60Co γ射线全身照射，吸收剂量分别为3.5 Gy及4.0 Gy，两剂量组中按吸收剂量率又分为1.0 Gy/min及2.0 Gy/min。受体鼠照射后4 h内，经尾静脉1次输注冻存人脐血有核细胞(NC)8×106个。
4.不同移植及分组：受体鼠经吸收剂量率1.0 Gy/min、吸收剂量4.0 Gy照射后，进行移植及分组：①一次移植组：受体鼠照射后4 h内，经尾静脉1次输注冻存人脐血有核细胞(NC)8×106个；②分次移植组：受体鼠分别于照射后4 h内、24、48、72 h，经尾静脉输注冻存脐血NC 2×106或4×105个，共4次；③照射对照组：照射后4 h内，经尾静脉输注与上述同等量RPMI-1640液；④空白对照组：小鼠既不受照射也不作任何输注。实验组每批每组3～5只，空白对照组每批每组1只，共4批。
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5.植入证据/水平检测
(1)FACS流式细胞仪检测：参照文献[1，2]分别取移植后4～6周受体鼠骨髓、脾脏、胸腺及外周血NC 1×106，直接法标记anti-huCD45-FITC、anti-huCD34-FITC\,anti-huCD2-FITC,间接法标记anti-huCD19-PE，同时设阴性对照。LYSIS-Ⅱ软件处理数据，各抗体均由本校长征医院实验科提供。
(2)人CFU-GM培养：参照文献[1，2]，取移植后4～6周SCID小鼠骨髓MNC 2×105，在含30%FBS，10%BSA，rhGM-CSF 150 U/ml,1.35%甲基纤维素和RPMI-1640液的培养基中，37℃，体积分数为5%的CO2及饱和湿度条件下培养14 d后计数。进一步用anti-huCD45-FITC标记、集落经洗涤后流式细胞仪检测鉴定人源性。
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(3)病理学检查：取移植后4～6周活存小鼠爪垫皮肤、肝脏及小肠等脏器，作GVHD病理学检查。
6.统计学方法：各计量资料均用
±s表示，组间比较用F检验。
结 果
1.SCID小鼠存活情况：吸收剂量率1.0 Gy/min，吸收剂量4.0 Gy，80%(15只中12只)死亡；3.5 Gy时，61%(18只中11只)死亡。吸收剂量率降为0.2 Gy/min,吸收剂量为4.0 Gy时，44%(16只中7只)死亡；3.5 Gy时，33.3%(12只中4只)死亡。受体鼠于照射后5～12 d死亡，死亡高峰时间为照射后第6天。照射对照组均死亡，空白组均存活至实验结束。
2.植入水平检测情况：表1为受体鼠骨髓中人源性CD45、CD34抗原表达水平以及CFU-GM存在的证据。其中一次移植组与分次移植NC 1.6×106，其CD45、CD34水平相近，两组间无统计学意义(P>0.05)；分次移植NC提高到8×106，植入水平较上两组增高(P<0.05)。同时，各移植组均检测出人CFU-GM，其集落形态较大，子代细胞以单个核或分叶核细胞为主，进一步经流式细胞仪检测鉴定为人源性，这不仅证实了干细胞的植入，而且也说明了免疫造血功能得到恢复。
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表1 受体鼠骨髓中人脐血细胞检测结果(±s) 组别
NC
例数
CD45+细
胞数(%)
CD34+细
胞数(%)
人CFU-GM
鉴定
A
一次移植
, 百拇医药
8×106
10
10.25±1.85
1.22±0.13
+
B
程序移植
1.6×106
7
12.7±1.09
1.36±0.27
+
, 百拇医药
C
程序移植
8×106
7
16.5±2.75*
2.09±0.34*
+
D
照射对照
0
4
-
, 百拇医药
-
-
注：C与A、B组比，*P<0.05；空白组为阴性对照 表2为植入的人脐血细胞部分表型及分布。植入细胞以CD45+细胞计，则在骨髓中最高，在脾脏与外周血中相近，而骨髓中人的细胞又以代表B细胞的CD19亚型为主；CD45在胸腺中大多不表达，或有表达者以代表T细胞的CD2亚型为主；CD19在骨髓、脾脏及外周血中均表达，虽然个体差异较大，但又以脾脏为最高，这均与文献报道相近[1]。CD34在骨髓中表达最高，而在外周血中几乎不表达。同时分次移植脐血NC降低到20%，CD19水平相近；分次移植NC未减少时，CD19表达增高与一次移植组差异有显著性(P<0.05)，这与表1结果也一致。另外，这种CD19、CD2的表达亦进一步证明受鼠免疫功能的恢复。
表2 植入的人脐血细胞部分表型及分布(±s) 组别
, 百拇医药
NC
例数
CD45+细胞(%)
CD19+细胞(%)
骨髓
脾脏
外周血
骨髓
脾脏
外周血
A
一次移植
8×106
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10
10.25±1.85
6.33±2.40
5.52±1.17
4.50±2.55
8.30±5.26
3.30±2.07
B
程序移植
1.6×106
7
12.7 ±1.09
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7.26±3.60
5.07±2.59
5.44±2.12
9.71±4.23
3.72±1.61
C
程序移植
8×106
7
18.5 ±2.75*
10.13±6.28*
, 百拇医药
9.76±2.48*
9.71±3.38*
13.2 ±9.70*
6.11±4.78*
D
照射对照
0
4
-
-
-
-
, 百拇医药
-
-
注：C与A、B组比，*P<0.05；空白组为阴性对照 3.GVHD情况
(1)大体改变：存活受体鼠未见明显消瘦、脱毛、腹泻等典型表现，剖视肝脏、脾脏均较空白组明显增大，但未见其他组织器官明显损害。
(2)组织学检查：光镜下可见，部分受体鼠脾脏、肝脏、爪垫可见轻度淋巴细胞浸润，无坏死或萎缩，实验组间无明显差异。
讨 论
C.B-17 SCID小鼠是一种T、B淋巴细胞联合免疫缺陷小鼠，但其骨髓造血微环境及造血基质完整无损，故能支持异基因细胞的植入和生长。又因器官组织对射线敏感性约比正常小鼠高2～3倍[4]，所以人们摸索出以亚致死剂量350～400 cGy作为造血干细胞移植的适宜剂量，但未有照射的吸收剂量率影响的报道。本文在移植条件相同的情况下，动物死亡率与一定范围内的吸收剂量呈一致趋势，又在一定剂量下，死亡率与吸收剂量率变化趋势一致，故考虑死因为辐射诱发的急性放射病所致。但剂量率与人脐血细胞植入率的比较尚待进一步研究。
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骨髓造血微环境中存在着龛位，它是由可移植性的并可定向归巢的造血基质细胞、周围局部富集的各种造血生长因子以及细胞外基质分子共同形成的相对可移动的功能区，是造血干/祖细胞增殖分化的场所。经照射预处理可使原位造血干细胞在损伤后数天内发生凋亡和/或死亡，进而使龛位腾出；同时腾出的龛位存在又有时间性的，如果没有干细胞的及时植入，则会因基质细胞的损伤、造血生长因子的重分布以及淋巴细胞的浸润而消失[5]。另一方面，腾出的龛位是可以供移植干细胞植入或回巢的。所谓回巢是指造血干细胞高度选择性地定居在骨髓等造血组织，并与造血微环境特异结合，进行增殖分化，重建造血功能。它是一个主动性过程，一般在移植后在髓外经过多次迁移最后大约在24 h内完成，如果没有及时可供植入的龛位，移植干细胞则会进入肝、脾、肺等网状组织中，而不能发挥其正常造血功能[6]。因此分次移植是充分利用了每次腾出的龛位，促进移植干细胞回巢。据此本实验比较了一次大剂量与分次移植同等或降低到20%的脐血，结果分次移植明显优于1次大剂量移植，提高了脐血利用率，无疑给目前成人脐血移植这一难题带来了希望，即有限量的一份脐血有望满足一个成人的需要。另外本实验也可作为干细胞回巢研究的较好模型，与目前荧光染料如PKH-26[6]等标记方法测定回巢相比，显得更为直接、影响因素少；因此我们设想，通过对移植后数天内植入水平的定量及动态检测，描绘出回巢曲线及回巢高峰，可望优化移植方案。
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本模型GVHD的发生也间接证明了干细胞的植入，但其发生率及严重程度均较低，其原因可能：①SCID小鼠自身的T、B淋巴细胞缺陷；②分次移植因移植细胞数的降低而减少了带入宿主的淋巴细胞数；③脐血淋巴细胞免疫活性低，容易克服组织相容性障碍，而易于植入；④深低温保存脐血亦降低了辅助性TH细胞的抗原表达，或降低了脐血的免疫活性-冷冻艾滋病效应(Refrigeration-AIDS)；⑤脐血相对纯净，不含肿瘤细胞，所致病原体感染远比骨髓和外周血低，从而避免了异基因细胞的污染所致的GVHD等。
总之，冻存脐血、分次移植及SCID小鼠三者一体地发挥了本实验的优势。分次移植充分利用了有限数量的脐血，达到了满足成人造血干细胞移植需要的目的，因而更有针对性地优化了脐血移植方案，为其临床应用带来了新的希望。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600077)
参考文献
, 百拇医药
1，Vormoor J,Lapidot T,Pflumio F,et al.Immature human cord blood progenitors engraft and proliferate to high levels in severe combined immundeficient mice.Blood,1994,83:2489-2497.
2， Hogan CJ,Shpall EJ,Mcnulty O,et al.Engraftment and development of human CD34+ -enriched cells from umbilical cord blood in NOD/LtSz-Scid/scid mice.Blood,1997,90:85-96.
3， Rao SS,Peters SO,Crittenden RB,et al.Stem cell transplantation in the normal nonmyeloablated host:relation between cell dose,schedule,and engraftment.Exp Hematol,1997,25:114-121.
, http://www.100md.com
4， Philips RA,Spaner DE.The SCID mouse:mutation in a DNA repair gene creates recipients useful for studies on stem cells,lymphocyte development and graft-versus-host disease.Immunol Rev,1991,124:63-74.
5， Jamali M,Trott KR.Persistent increase in the rates of apoptosis and dicentric chromosomes in surviving V79 cells after X-irradiation.Int J Radiat Biol,1996,70:705-708.
6， Hendrikx PJ,Martens CM,Hagenbeek A,et al.Homing of fluorescently labeled murine hematopoietic stem cells.Exp Hematol,1996,24:129-140.
(收稿日期:1999-09-06), http://www.100md.com
单位：吴建秋(200003 上海，第二军医大学附属长征医院妇产科)；杨云纺(200003 上海，第二军医大学附属长征医院妇产科)；金志军(200003 上海，第二军医大学附属长征医院妇产科)；蔡建明(防原医学研究室)；杨如俊(防原医学研究室)；项莺松(防原医学研究室)
关键词：脐血；造血干细胞；重症联合免疫缺陷小鼠；分次移植
中华放射医学与防护杂志000405 【摘要】 目的 探讨提高脐血移植效果的新方法，进一步了解脐血造血干细胞体内生长特性。方法 以经亚致死剂量γ射线照射后的重症联合免疫缺陷小鼠为动物模型，进行冻存人脐血的分次移植。利用人粒-单系祖细胞培养及流式细胞仪，检测植入小鼠骨髓等器官中人源性细胞。结果与一次移植相比，分次移植相同细胞数时，小鼠骨髓中人CD45+、CD34+细胞水平明显提高；分次移植细胞数降低到20%时，其造血及部分免疫功能恢复到相近水平。结论 脐血分次移植提高了干细胞的植入率，为临床成人脐血移植提供了一条新思路。
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Scheduled transplantation of human umbilical cord blood to severe combined immunodificient mice
WU Jianqiu,YANG Yunfang,JIN Zhijun,et al.
(Changzheng Hospital,Affiliated to the Second Military Medical University,Shanghai 200003,China)
【Abstract】 Objective To explore a new method for developing the efficiency of human umbilical cord blood (UCB) cells engraftment,and further understand the growth characteristic of hematopoietic stem cells (HSC) in vivo. Methods Sublethally irradiated severe combined immunodeficient (SCID) mice were transplanted i.v.with UCB cells which had been cryopreserved at -80℃.The human cells in recipient mice were detected by flow cytometry and CFU-GM assay. Results In contrast to the single transplantation,scheduled engraftment of similar numbers of UCB cells resulted in a proportionally obvious increase in the percentages of CD45+,CD34+ cells produced in SCID mouse bone marrow (BM).When the donor cells were reduced to 20 percent,an identical reconstitution of both hematopoietic and part of immunologic functions was achieved. Conclusion Scheduled engraftment improves the repopulating ability of HSC,which would provide a novel way for clinical cord blood engraftment in adult objects.
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【Key words】 Umbilical cord blood; Hematopoietic stem cells; SCID mice; Scheduled transplantation
脐血移植是目前血液学研究热点之一，由于脐血细胞数量的有限性，人们正通过不同手段来解决这一难题，如多份无关供体脐血的混合移植或单份脐血体外扩增后的脐血移植等，但由于移植物抗宿主病(GVHD)或干细胞分化等原因，其进展受到一定限制。本实验在已建立的SCID-hu小鼠模型[1，2]小鼠骨髓分次移植[3]方法的基础上，采用了人脐血的分次移植，旨在为临床合理地开发和应用脐血提供实验基础。
材料和方法
1.动物：C.B-17 SCID小鼠购自上海肿瘤生物技术研究所，SPF级饲养于本校东方肝胆外科医院动物中心，饲料、饮水及垫料均经高压灭菌。小鼠6～8 周龄，雌性，体重(20±2)g，实验前至少饲养1周。
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2.脐血：人脐血采自本校长征医院产科正常足月顺产胎儿，孕产妇无妊娠合并症或并发症。采集后2 h内与二甲亚砜(DMSO)混合，终浓度为10%，直接放入-80℃深低温冰箱保存，常规复苏后立即输注给受体小鼠。
3.一次移植时吸收剂量及吸收剂量率分组：受体鼠预处理为60Co γ射线全身照射，吸收剂量分别为3.5 Gy及4.0 Gy，两剂量组中按吸收剂量率又分为1.0 Gy/min及2.0 Gy/min。受体鼠照射后4 h内，经尾静脉1次输注冻存人脐血有核细胞(NC)8×106个。
4.不同移植及分组：受体鼠经吸收剂量率1.0 Gy/min、吸收剂量4.0 Gy照射后，进行移植及分组：①一次移植组：受体鼠照射后4 h内，经尾静脉1次输注冻存人脐血有核细胞(NC)8×106个；②分次移植组：受体鼠分别于照射后4 h内、24、48、72 h，经尾静脉输注冻存脐血NC 2×106或4×105个，共4次；③照射对照组：照射后4 h内，经尾静脉输注与上述同等量RPMI-1640液；④空白对照组：小鼠既不受照射也不作任何输注。实验组每批每组3～5只，空白对照组每批每组1只，共4批。
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5.植入证据/水平检测
(1)FACS流式细胞仪检测：参照文献[1，2]分别取移植后4～6周受体鼠骨髓、脾脏、胸腺及外周血NC 1×106，直接法标记anti-huCD45-FITC、anti-huCD34-FITC\,anti-huCD2-FITC,间接法标记anti-huCD19-PE，同时设阴性对照。LYSIS-Ⅱ软件处理数据，各抗体均由本校长征医院实验科提供。
(2)人CFU-GM培养：参照文献[1，2]，取移植后4～6周SCID小鼠骨髓MNC 2×105，在含30%FBS，10%BSA，rhGM-CSF 150 U/ml,1.35%甲基纤维素和RPMI-1640液的培养基中，37℃，体积分数为5%的CO2及饱和湿度条件下培养14 d后计数。进一步用anti-huCD45-FITC标记、集落经洗涤后流式细胞仪检测鉴定人源性。
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(3)病理学检查：取移植后4～6周活存小鼠爪垫皮肤、肝脏及小肠等脏器，作GVHD病理学检查。
6.统计学方法：各计量资料均用
±s表示，组间比较用F检验。结 果
1.SCID小鼠存活情况：吸收剂量率1.0 Gy/min，吸收剂量4.0 Gy，80%(15只中12只)死亡；3.5 Gy时，61%(18只中11只)死亡。吸收剂量率降为0.2 Gy/min,吸收剂量为4.0 Gy时，44%(16只中7只)死亡；3.5 Gy时，33.3%(12只中4只)死亡。受体鼠于照射后5～12 d死亡，死亡高峰时间为照射后第6天。照射对照组均死亡，空白组均存活至实验结束。
2.植入水平检测情况：表1为受体鼠骨髓中人源性CD45、CD34抗原表达水平以及CFU-GM存在的证据。其中一次移植组与分次移植NC 1.6×106，其CD45、CD34水平相近，两组间无统计学意义(P>0.05)；分次移植NC提高到8×106，植入水平较上两组增高(P<0.05)。同时，各移植组均检测出人CFU-GM，其集落形态较大，子代细胞以单个核或分叶核细胞为主，进一步经流式细胞仪检测鉴定为人源性，这不仅证实了干细胞的植入，而且也说明了免疫造血功能得到恢复。
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表1 受体鼠骨髓中人脐血细胞检测结果(
±s) 组别NC
例数
CD45+细
胞数(%)
CD34+细
胞数(%)
人CFU-GM
鉴定
A
一次移植
, 百拇医药
8×106
10
10.25±1.85
1.22±0.13
+
B
程序移植
1.6×106
7
12.7±1.09
1.36±0.27
+
, 百拇医药
C
程序移植
8×106
7
16.5±2.75*
2.09±0.34*
+
D
照射对照
0
4
-
, 百拇医药
-
-
注：C与A、B组比，*P<0.05；空白组为阴性对照 表2为植入的人脐血细胞部分表型及分布。植入细胞以CD45+细胞计，则在骨髓中最高，在脾脏与外周血中相近，而骨髓中人的细胞又以代表B细胞的CD19亚型为主；CD45在胸腺中大多不表达，或有表达者以代表T细胞的CD2亚型为主；CD19在骨髓、脾脏及外周血中均表达，虽然个体差异较大，但又以脾脏为最高，这均与文献报道相近[1]。CD34在骨髓中表达最高，而在外周血中几乎不表达。同时分次移植脐血NC降低到20%，CD19水平相近；分次移植NC未减少时，CD19表达增高与一次移植组差异有显著性(P<0.05)，这与表1结果也一致。另外，这种CD19、CD2的表达亦进一步证明受鼠免疫功能的恢复。
表2 植入的人脐血细胞部分表型及分布(
±s) 组别, 百拇医药
NC
例数
CD45+细胞(%)
CD19+细胞(%)
骨髓
脾脏
外周血
骨髓
脾脏
外周血
A
一次移植
8×106
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10
10.25±1.85
6.33±2.40
5.52±1.17
4.50±2.55
8.30±5.26
3.30±2.07
B
程序移植
1.6×106
7
12.7 ±1.09
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7.26±3.60
5.07±2.59
5.44±2.12
9.71±4.23
3.72±1.61
C
程序移植
8×106
7
18.5 ±2.75*
10.13±6.28*
, 百拇医药
9.76±2.48*
9.71±3.38*
13.2 ±9.70*
6.11±4.78*
D
照射对照
0
4
-
-
-
-
, 百拇医药
-
-
注：C与A、B组比，*P<0.05；空白组为阴性对照 3.GVHD情况
(1)大体改变：存活受体鼠未见明显消瘦、脱毛、腹泻等典型表现，剖视肝脏、脾脏均较空白组明显增大，但未见其他组织器官明显损害。
(2)组织学检查：光镜下可见，部分受体鼠脾脏、肝脏、爪垫可见轻度淋巴细胞浸润，无坏死或萎缩，实验组间无明显差异。
讨 论
C.B-17 SCID小鼠是一种T、B淋巴细胞联合免疫缺陷小鼠，但其骨髓造血微环境及造血基质完整无损，故能支持异基因细胞的植入和生长。又因器官组织对射线敏感性约比正常小鼠高2～3倍[4]，所以人们摸索出以亚致死剂量350～400 cGy作为造血干细胞移植的适宜剂量，但未有照射的吸收剂量率影响的报道。本文在移植条件相同的情况下，动物死亡率与一定范围内的吸收剂量呈一致趋势，又在一定剂量下，死亡率与吸收剂量率变化趋势一致，故考虑死因为辐射诱发的急性放射病所致。但剂量率与人脐血细胞植入率的比较尚待进一步研究。
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骨髓造血微环境中存在着龛位，它是由可移植性的并可定向归巢的造血基质细胞、周围局部富集的各种造血生长因子以及细胞外基质分子共同形成的相对可移动的功能区，是造血干/祖细胞增殖分化的场所。经照射预处理可使原位造血干细胞在损伤后数天内发生凋亡和/或死亡，进而使龛位腾出；同时腾出的龛位存在又有时间性的，如果没有干细胞的及时植入，则会因基质细胞的损伤、造血生长因子的重分布以及淋巴细胞的浸润而消失[5]。另一方面，腾出的龛位是可以供移植干细胞植入或回巢的。所谓回巢是指造血干细胞高度选择性地定居在骨髓等造血组织，并与造血微环境特异结合，进行增殖分化，重建造血功能。它是一个主动性过程，一般在移植后在髓外经过多次迁移最后大约在24 h内完成，如果没有及时可供植入的龛位，移植干细胞则会进入肝、脾、肺等网状组织中，而不能发挥其正常造血功能[6]。因此分次移植是充分利用了每次腾出的龛位，促进移植干细胞回巢。据此本实验比较了一次大剂量与分次移植同等或降低到20%的脐血，结果分次移植明显优于1次大剂量移植，提高了脐血利用率，无疑给目前成人脐血移植这一难题带来了希望，即有限量的一份脐血有望满足一个成人的需要。另外本实验也可作为干细胞回巢研究的较好模型，与目前荧光染料如PKH-26[6]等标记方法测定回巢相比，显得更为直接、影响因素少；因此我们设想，通过对移植后数天内植入水平的定量及动态检测，描绘出回巢曲线及回巢高峰，可望优化移植方案。
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本模型GVHD的发生也间接证明了干细胞的植入，但其发生率及严重程度均较低，其原因可能：①SCID小鼠自身的T、B淋巴细胞缺陷；②分次移植因移植细胞数的降低而减少了带入宿主的淋巴细胞数；③脐血淋巴细胞免疫活性低，容易克服组织相容性障碍，而易于植入；④深低温保存脐血亦降低了辅助性TH细胞的抗原表达，或降低了脐血的免疫活性-冷冻艾滋病效应(Refrigeration-AIDS)；⑤脐血相对纯净，不含肿瘤细胞，所致病原体感染远比骨髓和外周血低，从而避免了异基因细胞的污染所致的GVHD等。
总之，冻存脐血、分次移植及SCID小鼠三者一体地发挥了本实验的优势。分次移植充分利用了有限数量的脐血，达到了满足成人造血干细胞移植需要的目的，因而更有针对性地优化了脐血移植方案，为其临床应用带来了新的希望。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600077)
参考文献
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6， Hendrikx PJ,Martens CM,Hagenbeek A,et al.Homing of fluorescently labeled murine hematopoietic stem cells.Exp Hematol,1996,24:129-140.
(收稿日期:1999-09-06), http://www.100md.com