用多重PCR分析60Co γ射线引起人白血病细胞HPRT基因突变
作者：刘胜学 曹佳 安辉 周紫恒 孙华明
单位：400038 重庆，第三军医大学预防医学系分子毒理室
关键词：HPRT基因；60Co；γ射线；致突变作用；多重PCR
中华放射医学与防护杂志000401 【摘要】 目的 探讨60Co γ射线诱导人HPRT基因突变的分子图谱和发生机理，以及与辐射抗肿瘤的关系。方法 采用单细胞克隆培养、双向筛选计数、多重PCR扩增和电泳分析等方法。结果①随着辐射剂量的增加，细胞接种存活率下降，突变频率升高。②自发突变中92.3%是点突变，而γ射线诱发突变主要由缺失与点突变两部分组成(两者分别为61.7%和38.3%)。③缺失突变可以发生于HPRT基因的每个外显子，但诱发突变中绝大多数是多个外显子的连锁缺失(97.9%)。结论γ射线诱发HPRT基因突变图谱与自发突变不一样，其易发生较大遗传结构改变的特点与作用机理有关。
, 百拇医药
Molecular analysis of 60Co gamma-ray-induced mutation at HPRT locus in human promyelocytic leukemia cells
LIU Shengxue,CAO Jia, AN Hui,et al.
(Department of Molecular Toxicology,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)
【Abstract】 Objective To explore the spectra and mechanism of human HPRT gene mutation induced by 60Co γ-rays and its relation with anti-tumor effect of radiation. Methods Single cell clone culturing,two-way screening count,multiplex PCR amplification and electrophoresis technique were used. Results (1)When doses were increasing,cell plating efficiency reduced and mutation frequency increased.(2)The most frequent spontaneous mutations were point mutation (92.3%) and gamma-ray-induced mutation,including mainly partial deletion and point mutation(61.7% and 38.3%,respectively).(3)There were deletion mutations in all 9 exons of HPRT gene and the most of gamma-ray-induced mutations were chain deletion with multiplex exons (97.9%). Conclusion The spectra of spontaneous and gamma-ray-induced mutants were different.The bigger changes in genetic structure are related to the anti-tumor mechanism of radiation.
, 百拇医药
【Key words】 HPRT gene; 60Co γ-rays; Mutagenesis; Multiplex PCR
电离辐射的致突变效应已经有大量的研究报道，但有关此类突变发生的细微DNA结构改变以及相对应的分子机理还了解得较少。次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase,HPRT)基因定位于X性染色体上，它是细胞存活非必需基因，突变型与野生型细胞均可进行筛选，由于具有以上特点而成为研究电离辐射致突变的较为理想的生物标记，但传统的HPRT基因突变检测方法(如Southern印迹法等)不仅费时费力，而且假阳性较高，近来PCR技术的迅猛发展，使得采用多重PCR方法检测HPRT基因突变成为可能[1，2]。本研究用不同剂量60Co γ射线照射人白血病细胞后，筛选出HPRT基因突变克隆，用多重PCR技术分析HPRT基因突变图谱，为探讨电离辐射致突变的分子机理以及与辐射抗肿瘤的关系提供一定的线索。
, 百拇医药
材料和方法
1.细胞株：HL-60细胞属人急性早幼粒白血病细胞株，细胞核型46(43～48)，倍增时间12～16 h。实验前用1% HAT培养基(内含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷)除去自发突变。
2.细胞毒性与突变频率的测定：将指数生长期的细胞分别进行0、0.5、1、2、4和6 Gy剂量的γ射线照射，吸收剂量率0.5～1.2 Gy/min。具体测定方法见文献[3]。
3.突变细胞的扩增与DNA提取：从阳性微孔中把单个克隆依次转入24孔培养板和培养瓶中扩增，最后以常规方法分离提取细胞DNA。
4.PCR引物的设计、合成与鉴定：引物序列参考了已有的研究报道[4]，运用计算机设计HPRT基因9个外显子相对应的8对引物。引物合成与鉴定由北京贝克曼示范实验室，美国赛百盛公司和中国科学院上海细胞生物所共同完成。
, 百拇医药
5.DNA多重PCR反应：取上面提取的细胞DNA 0.5～2.0 μl，加入50 pmol引物，50 μl反应液中含50 mmol/L KCl,10 mmol/L Tris-HCL(pH 8.8)，0.3～1.05 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs,2.5 U TaqDNA 聚合酶。多重PCR反应条件是98℃预变性7 min后，94 ℃ 1.5 min，52℃ 1.5 min，72℃ 2.0 min,循环40次；外显子1扩增条件是95 ℃ 0.5 min，64℃ 1.0 min，72℃ 1.0 min,循环30次，最后一个PCR循环完成后，继续在72 ℃延伸5 min。扩增完成后，取10 μl反应液在3%琼脂糖凝胶或5%聚丙烯酰胺凝胶中电泳。
6.统计学处理：文中数据采用t检验进行统计学处理。
结 果
1.γ射线对HL-60细胞的毒性及致突变性的测定
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随着γ射线照射剂量的增加，细胞死亡数量相应地增加，细胞接种存活率下降；同时，细胞发生突变的数目相应地增多，突变频率升高，具体数据见表1。
表1 γ射线剂量与HL-60细胞接种存活率、克隆效率以及突变频率之间的关系 吸收剂量
(Gy)
接种存活率
(%)
克隆效率
(%)
突变频率
(×10-6)
0
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94.45
85.6
9.17
0.5
91.63
146.0
12.30
1.0
69.31
186.0
18.30
2.0
, 百拇医药
55.34*
108.2
23.20*
4.0
39.94**
69.0
73.00
6.0
13.04**
14.8
—
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注：与对照组比，*P<0.05，P<0.01；—：细胞死亡数量太大，无法接种 2.多重PCR分析
由于外显子7与8只间隔163 bp，所以二者共用一对引物，以379 bp大小的片断一起被扩增合成。有外显子1引物对参与的多重PCR反应总是出现假信号，难以避免，因此实际操作中只有外显子2、5、6、7/8和外显子3、4、9可以参与两个多重PCR反应，而外显子1只能单独扩增合成。
3.HPRT基因分子突变谱
表2列出了自发突变与γ射线诱发突变的HPRT位点的变化情况。外显子突变体的电泳图谱主要分为3种类型：包含点突变的“正常型”，全部缺失型与部分缺失型。1.0～4.0 Gy剂量组γ射线诱导HL-60细胞产生的突变谱与自发突变谱之间有明显的差异(P<0.05)，二者的主要区别有2点：第一，自发突变无外显子全部缺失型，而γ射线诱发突变有；第二，缺失型突变所占的比例不一样，诱发突变显示缺失型突变的比例为28.6%～76.5%，而自发突变只有7.7%。
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表2 γ射线诱发突变与自发突变分子图谱的比较 处理因素
突变
克隆数
外显子缺失数目
缺失比例
(%)
点突变比例
全部缺失
部分缺失
数
(%)
数
(%)
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数
(%)
自发突变
13
0
0
1
7.7
7.7
12
92.3
γ射线(Gy)
0.5
, http://www.100md.com 7
1
14.3
1
14.3
28.6
5
71.4
1.0
13
3
23.1
5
38.5
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61.5**
5
38.5**
2.0
10
3
30.0*
3
30.0
60.0**
4
40.0**
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4.0
17
7
41.2**
6
35.3
76.5**
4
23.5**
注：与自发突变比，*P<0.05，**P<0.01 4.缺失位点的分布
比较各个HPRT基因缺失突变位点在9个外显子的分布情况，每个外显子的绝对突变发生次数大体相当，不存在明显的“热点”。但是如果把整个HPRT基因全长等分为3个部分，那么缺失突变位点在整个DNA序列中有明显的区域分布特点，每千个碱基对DNA中，3’末端出现缺失突变位点的数目是5’末端的2.15倍。本实验中60个突变体HPRT基因上9个外显子的缺失分布归纳于图1(不同剂量统计在一起)。从图上可以看出，缺失突变可以发生于HPRT基因的每个外显子；γ射线诱发突变中单个外显子缺失发生的比例很小，只占2.1%，而绝大多数是多个相邻外显子连锁缺失(97.9%)，特别是在高剂量组表现得尤为突出。
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图1 人类HPRT基因9个外显子
缺失发生的分布图谱
黑色框表示外显子的缺失
讨 论
人和啮齿类动物的HPRT参与细胞内嘌呤核苷酸生物合成的补救途径，它可以一些嘌呤类似物(如6-TG等)为底物，生成对应的毒性产物掺入到DNA中而引起细胞死亡。因此，在含6-TG的培养基中，HPRT活力正常的细胞将不能存活，而HPRT基因突变细胞可以生长[5]。本实验采用HL-60细胞HPRT位点正向突变试验检测到γ射线的细胞毒性和致突变性，二者呈反向关系，而γ射线对细胞克隆效率的影响是反常的，小剂量升高而大剂量降低，原因不明。
以前对HPRT基因突变的分析采用DNA杂交方法，近来PCR技术应用于基因突变的研究，提高了基因突变分析的精确度[6]。本实验中采用的多重PCR技术由于引物对较多，易造成反应体系难于控制与优化，以及突变体可能发生外显子内部的插入与缺失，所以此技术也不是引物对“越多越好”；而且产物分子量大小也应拉开一定的距离，这样才不易发生假阳性和假阴性结果。因此本实验中的8对引物共分为3组。
, 百拇医药
目前已证明，属于电离辐射的γ射线可引起严重的细胞DNA损伤，主要表现为各种染色体畸变、基因突变、高频率的基因重组以及细胞凋亡等。在本实验中，结果也提示γ射线诱导HPRT基因突变有较大的遗传结构改变。目前认为，电离辐射引起HPRT基因突变的发生不是由于转录被阻断，而是真正的突变，其产生的突变是不可逆的，这是电离辐射引起较大的基因损伤所致。由于这种不可逆性，使HPRT基因突变长期存在体内。还有，由于细胞本身的动力学所致，部分突变细胞丢失。因此HPRT基因突变有时不能真正地反映受照剂量，使得HPRT基因分析用于群体优于个体[7]。
现有资料提示，对于电离辐射诱导HPRT基因突变是否有“热点”的问题存在争议。一部分人认为HPRT基因的断裂位点偏向于3’末端，而另一部分学者认为突变位点在各个外显子似乎是随机分布的。本研究的结果表明，由于外显子在基因DNA结构上的不均匀分布(偏向于3’末端)，因此这种“争议”不是来源于实验结果的不同，而是比较方法的不同造成的，对于这个突变“热点”问题以及相关分子机理下结论还为时过早，有待进一步深入研究揭示。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970650)
参考文献
1，徐永忠.HPRT基因突变分析技术及其在放射生物学中的应用.国外医学放射医学核医学分册，1997，21：137-140.
2，Min SP,Tracy H,Armin J,et al.Molecular analysis of gamma-ray-induced mutations at the hprt locus in primary human skin fibroblasts by multiplex polymerase chain reaction.Radiat Res,1995,141:11-18.
3，刘胜学，曹佳，安辉，等.昆明山海棠对人白血病细胞HPRT位点的影响.第三军医大学学报，1999，21：113-115.
, http://www.100md.com
4，Wei SJC,Chang RL,Cui XX,et al.Dose-dependent differences in the mutational profiles of (-)-(IR,2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-1,2-epoxy-1,2,3,4-tetrahydrobeuzo ICI phenanthrene and its less carcinogenic enantiomer.Cancer Res,1996,56:3695-3703.
5，刘毓谷.卫生毒理学基础.第2版.北京：人民卫生出版社，1994.107-108.
6，王惠琛，邢瑞云，夏寿萱.用多引物PCR分析γ射线引起人外周血淋巴细胞HPRT基因突变.生物化学杂志，1996，12：131-136.
7，Keiji S,Tom KH.Mutation induction in γ-irradiated primary human bronchial epithelial cells and molecular analysis of the HPRT- mutants.Mutat Res,1996,349:33-41.
(收稿日期:1999-08-02), 百拇医药
单位：400038 重庆，第三军医大学预防医学系分子毒理室
关键词：HPRT基因；60Co；γ射线；致突变作用；多重PCR
中华放射医学与防护杂志000401 【摘要】 目的 探讨60Co γ射线诱导人HPRT基因突变的分子图谱和发生机理，以及与辐射抗肿瘤的关系。方法 采用单细胞克隆培养、双向筛选计数、多重PCR扩增和电泳分析等方法。结果①随着辐射剂量的增加，细胞接种存活率下降，突变频率升高。②自发突变中92.3%是点突变，而γ射线诱发突变主要由缺失与点突变两部分组成(两者分别为61.7%和38.3%)。③缺失突变可以发生于HPRT基因的每个外显子，但诱发突变中绝大多数是多个外显子的连锁缺失(97.9%)。结论γ射线诱发HPRT基因突变图谱与自发突变不一样，其易发生较大遗传结构改变的特点与作用机理有关。
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Molecular analysis of 60Co gamma-ray-induced mutation at HPRT locus in human promyelocytic leukemia cells
LIU Shengxue,CAO Jia, AN Hui,et al.
(Department of Molecular Toxicology,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)
【Abstract】 Objective To explore the spectra and mechanism of human HPRT gene mutation induced by 60Co γ-rays and its relation with anti-tumor effect of radiation. Methods Single cell clone culturing,two-way screening count,multiplex PCR amplification and electrophoresis technique were used. Results (1)When doses were increasing,cell plating efficiency reduced and mutation frequency increased.(2)The most frequent spontaneous mutations were point mutation (92.3%) and gamma-ray-induced mutation,including mainly partial deletion and point mutation(61.7% and 38.3%,respectively).(3)There were deletion mutations in all 9 exons of HPRT gene and the most of gamma-ray-induced mutations were chain deletion with multiplex exons (97.9%). Conclusion The spectra of spontaneous and gamma-ray-induced mutants were different.The bigger changes in genetic structure are related to the anti-tumor mechanism of radiation.
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【Key words】 HPRT gene; 60Co γ-rays; Mutagenesis; Multiplex PCR
电离辐射的致突变效应已经有大量的研究报道，但有关此类突变发生的细微DNA结构改变以及相对应的分子机理还了解得较少。次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase,HPRT)基因定位于X性染色体上，它是细胞存活非必需基因，突变型与野生型细胞均可进行筛选，由于具有以上特点而成为研究电离辐射致突变的较为理想的生物标记，但传统的HPRT基因突变检测方法(如Southern印迹法等)不仅费时费力，而且假阳性较高，近来PCR技术的迅猛发展，使得采用多重PCR方法检测HPRT基因突变成为可能[1，2]。本研究用不同剂量60Co γ射线照射人白血病细胞后，筛选出HPRT基因突变克隆，用多重PCR技术分析HPRT基因突变图谱，为探讨电离辐射致突变的分子机理以及与辐射抗肿瘤的关系提供一定的线索。
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材料和方法
1.细胞株：HL-60细胞属人急性早幼粒白血病细胞株，细胞核型46(43～48)，倍增时间12～16 h。实验前用1% HAT培养基(内含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷)除去自发突变。
2.细胞毒性与突变频率的测定：将指数生长期的细胞分别进行0、0.5、1、2、4和6 Gy剂量的γ射线照射，吸收剂量率0.5～1.2 Gy/min。具体测定方法见文献[3]。
3.突变细胞的扩增与DNA提取：从阳性微孔中把单个克隆依次转入24孔培养板和培养瓶中扩增，最后以常规方法分离提取细胞DNA。
4.PCR引物的设计、合成与鉴定：引物序列参考了已有的研究报道[4]，运用计算机设计HPRT基因9个外显子相对应的8对引物。引物合成与鉴定由北京贝克曼示范实验室，美国赛百盛公司和中国科学院上海细胞生物所共同完成。
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5.DNA多重PCR反应：取上面提取的细胞DNA 0.5～2.0 μl，加入50 pmol引物，50 μl反应液中含50 mmol/L KCl,10 mmol/L Tris-HCL(pH 8.8)，0.3～1.05 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs,2.5 U TaqDNA 聚合酶。多重PCR反应条件是98℃预变性7 min后，94 ℃ 1.5 min，52℃ 1.5 min，72℃ 2.0 min,循环40次；外显子1扩增条件是95 ℃ 0.5 min，64℃ 1.0 min，72℃ 1.0 min,循环30次，最后一个PCR循环完成后，继续在72 ℃延伸5 min。扩增完成后，取10 μl反应液在3%琼脂糖凝胶或5%聚丙烯酰胺凝胶中电泳。
6.统计学处理：文中数据采用t检验进行统计学处理。
结 果
1.γ射线对HL-60细胞的毒性及致突变性的测定
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随着γ射线照射剂量的增加，细胞死亡数量相应地增加，细胞接种存活率下降；同时，细胞发生突变的数目相应地增多，突变频率升高，具体数据见表1。
表1 γ射线剂量与HL-60细胞接种存活率、克隆效率以及突变频率之间的关系 吸收剂量
(Gy)
接种存活率
(%)
克隆效率
(%)
突变频率
(×10-6)
0
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94.45
85.6
9.17
0.5
91.63
146.0
12.30
1.0
69.31
186.0
18.30
2.0
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55.34*
108.2
23.20*
4.0
39.94**
69.0
73.00
6.0
13.04**
14.8
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注：与对照组比，*P<0.05，P<0.01；—：细胞死亡数量太大，无法接种 2.多重PCR分析
由于外显子7与8只间隔163 bp，所以二者共用一对引物，以379 bp大小的片断一起被扩增合成。有外显子1引物对参与的多重PCR反应总是出现假信号，难以避免，因此实际操作中只有外显子2、5、6、7/8和外显子3、4、9可以参与两个多重PCR反应，而外显子1只能单独扩增合成。
3.HPRT基因分子突变谱
表2列出了自发突变与γ射线诱发突变的HPRT位点的变化情况。外显子突变体的电泳图谱主要分为3种类型：包含点突变的“正常型”，全部缺失型与部分缺失型。1.0～4.0 Gy剂量组γ射线诱导HL-60细胞产生的突变谱与自发突变谱之间有明显的差异(P<0.05)，二者的主要区别有2点：第一，自发突变无外显子全部缺失型，而γ射线诱发突变有；第二，缺失型突变所占的比例不一样，诱发突变显示缺失型突变的比例为28.6%～76.5%，而自发突变只有7.7%。
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表2 γ射线诱发突变与自发突变分子图谱的比较 处理因素
突变
克隆数
外显子缺失数目
缺失比例
(%)
点突变比例
全部缺失
部分缺失
数
(%)
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(%)
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(%)
自发突变
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γ射线(Gy)
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注：与自发突变比，*P<0.05，**P<0.01 4.缺失位点的分布
比较各个HPRT基因缺失突变位点在9个外显子的分布情况，每个外显子的绝对突变发生次数大体相当，不存在明显的“热点”。但是如果把整个HPRT基因全长等分为3个部分，那么缺失突变位点在整个DNA序列中有明显的区域分布特点，每千个碱基对DNA中，3’末端出现缺失突变位点的数目是5’末端的2.15倍。本实验中60个突变体HPRT基因上9个外显子的缺失分布归纳于图1(不同剂量统计在一起)。从图上可以看出，缺失突变可以发生于HPRT基因的每个外显子；γ射线诱发突变中单个外显子缺失发生的比例很小，只占2.1%，而绝大多数是多个相邻外显子连锁缺失(97.9%)，特别是在高剂量组表现得尤为突出。
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图1 人类HPRT基因9个外显子
缺失发生的分布图谱
黑色框表示外显子的缺失
讨 论
人和啮齿类动物的HPRT参与细胞内嘌呤核苷酸生物合成的补救途径，它可以一些嘌呤类似物(如6-TG等)为底物，生成对应的毒性产物掺入到DNA中而引起细胞死亡。因此，在含6-TG的培养基中，HPRT活力正常的细胞将不能存活，而HPRT基因突变细胞可以生长[5]。本实验采用HL-60细胞HPRT位点正向突变试验检测到γ射线的细胞毒性和致突变性，二者呈反向关系，而γ射线对细胞克隆效率的影响是反常的，小剂量升高而大剂量降低，原因不明。
以前对HPRT基因突变的分析采用DNA杂交方法，近来PCR技术应用于基因突变的研究，提高了基因突变分析的精确度[6]。本实验中采用的多重PCR技术由于引物对较多，易造成反应体系难于控制与优化，以及突变体可能发生外显子内部的插入与缺失，所以此技术也不是引物对“越多越好”；而且产物分子量大小也应拉开一定的距离，这样才不易发生假阳性和假阴性结果。因此本实验中的8对引物共分为3组。
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目前已证明，属于电离辐射的γ射线可引起严重的细胞DNA损伤，主要表现为各种染色体畸变、基因突变、高频率的基因重组以及细胞凋亡等。在本实验中，结果也提示γ射线诱导HPRT基因突变有较大的遗传结构改变。目前认为，电离辐射引起HPRT基因突变的发生不是由于转录被阻断，而是真正的突变，其产生的突变是不可逆的，这是电离辐射引起较大的基因损伤所致。由于这种不可逆性，使HPRT基因突变长期存在体内。还有，由于细胞本身的动力学所致，部分突变细胞丢失。因此HPRT基因突变有时不能真正地反映受照剂量，使得HPRT基因分析用于群体优于个体[7]。
现有资料提示，对于电离辐射诱导HPRT基因突变是否有“热点”的问题存在争议。一部分人认为HPRT基因的断裂位点偏向于3’末端，而另一部分学者认为突变位点在各个外显子似乎是随机分布的。本研究的结果表明，由于外显子在基因DNA结构上的不均匀分布(偏向于3’末端)，因此这种“争议”不是来源于实验结果的不同，而是比较方法的不同造成的，对于这个突变“热点”问题以及相关分子机理下结论还为时过早，有待进一步深入研究揭示。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970650)
参考文献
1，徐永忠.HPRT基因突变分析技术及其在放射生物学中的应用.国外医学放射医学核医学分册，1997，21：137-140.
2，Min SP,Tracy H,Armin J,et al.Molecular analysis of gamma-ray-induced mutations at the hprt locus in primary human skin fibroblasts by multiplex polymerase chain reaction.Radiat Res,1995,141:11-18.
3，刘胜学，曹佳，安辉，等.昆明山海棠对人白血病细胞HPRT位点的影响.第三军医大学学报，1999，21：113-115.
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4，Wei SJC,Chang RL,Cui XX,et al.Dose-dependent differences in the mutational profiles of (-)-(IR,2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-1,2-epoxy-1,2,3,4-tetrahydrobeuzo ICI phenanthrene and its less carcinogenic enantiomer.Cancer Res,1996,56:3695-3703.
5，刘毓谷.卫生毒理学基础.第2版.北京：人民卫生出版社，1994.107-108.
6，王惠琛，邢瑞云，夏寿萱.用多引物PCR分析γ射线引起人外周血淋巴细胞HPRT基因突变.生物化学杂志，1996，12：131-136.
7，Keiji S,Tom KH.Mutation induction in γ-irradiated primary human bronchial epithelial cells and molecular analysis of the HPRT- mutants.Mutat Res,1996,349:33-41.
(收稿日期:1999-08-02), 百拇医药