血小板第4因子对小鼠骨髓造血细胞辐射损伤保护机理的研究
作者：杨岚 朱柏贵 田琼 张绍章 张发科 孙秉中
单位：杨岚(710032 西安，第四军医大学血液科)；朱柏贵(江苏省武警医院)；田琼(放射医学教研室)；张绍章(放射医学教研室)；张发科(放射医学教研室)；孙秉中(710032 西安，第四军医大学血液科)
关键词：
中华放射医学与防护杂志000514 血小板第4因子(PF4)是一种肝素结合多肽，具有中和肝素、炎症的趋化、抑制血管形成和抑制巨核细胞生长的功能[1]，属于造血生长负性调节因子。近年的研究表明，PF4能可逆的抑制造血干细胞、祖细胞的生长[2，3]，并因此而保护骨髓造血干祖细胞免受细胞毒剂的损伤[4]。目前，尚未见到PF4减少哺乳动物对辐射的敏感性、保护正常造血干祖细胞的报道。本实验旨在探讨PF4对急性辐射损伤小鼠骨髓细胞保护的作用机理。
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一、材料和方法
1.实验动物：BALB/c小鼠70只，雄性，体重(19～21)g，鼠龄10～12周，由本校实验动物中心提供，在标准条件下喂养。
2.照射条件：60Coγ射线一次全身均匀照射，吸收剂量为7.5 Gy，吸收剂量率为1.67 Gy/min。
3.试剂：PF4由上海贝特生物技术有限公司提供，用双蒸水稀释成工作液，置4℃冰箱保存备用，稀释浓度为100 μg/ml。
4.方法：70只BALB/c小鼠分为两个实验大组。所有小鼠均接受PF4或PBS 2次腹腔注射(ip)，间隔6 h，第2次注射后20 h，给予7.5 Gy60Coγ射线全身照射。
(1)实验1：将40只BALB/c小鼠随机分为4组，每组10只。照射对照组：PBS 17 ml*kg-1.次-1，PF4 20 μg组：PF4 20 μg.kg-1.次-1，PF4 40 μg组：PF4 40μg.kg-1.次-1，PF4 60 μg组： PF4 60 μg.kg-1.次-1。照射后30 d内，每天记录动物死亡情况。
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(2)实验2：将30只BALB/c小鼠随机分为3组，每组10只。照射组：PBS 17 ml*kg-1.次-1，PF4+照射组：PF4 20 μg.kg-1.次-1，对照组：不接受ip及照射。照后8 d，每组小鼠经颈椎脱臼法处死，取出股骨，剔除肌肉和结缔组织，剪开股骨两头，用RPMI 1640培养液冲洗出骨髓细胞，1500 r/min离心10 min，去上清，沉淀细胞用培养液洗涤2次，将细胞悬浮在新鲜的培养液中待用，计数股骨骨髓有核细胞数(BMC)。用紫外分光光度计和流式细胞分析术测定其DNA含量及细胞周期变化和细胞死亡(包括凋亡)情况，以双层琼脂培养法测定粒-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)的形成能力，取出脾脏并浸泡在Bouin′s液中24 h，观察脾结节形成率。
5.统计学处理：数据以
±s表示，存活率用χ2检验，组间比较用t检验。
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二、结果
1.PF4对受60Coγ射线照射小鼠存活的影响(见表1)。
表1 不同PF4剂量对7.5 Gy60Coγ射线全身照射
小鼠存活的影响 组别
PF4剂量
(μg.kg-1.次-1)
存活数
(只)
存活率/
30天(%)
, 百拇医药
平均存活日
(
±s)
照射
0.0
0
0
12.4±6.6
PF4+照射1
20.0
5
50**
25.8±6.1
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PF4+照射2
40.0
6
60**
24.2±7.7
PF4+照射3
60.0
6
60**
23.0±9.8
注：n=10； 与照射组比较， **P<0.01
, 百拇医药 实验小鼠接受7.5 Gy的60Coγ射线全身照射后，观察30 d，照射前未接受PF4处理的小鼠，全部死亡，存活率为0。照射前接受PF4不同剂量处理的3组小鼠，20μg.kg-1组死亡5例，存活率50%，40 μg.kg-1和60 μg.kg-1组分别死亡4例，存活率均为60%。未接受PF4处理组与接受PF4不同剂量处理的3组成活率相比较，明显减低，差异均有显著性(P<0.01)，接受PF4不同剂量处理的3组之间存活率比较差异均无显著性(P>0.05)。
2.PF4对小鼠骨髓BMC数、DNA含量、CFU-GM的影响
7.5 Gy 60Coγ射线全身照射后第8天，照射组与PF4处理组BMC数目、DNA含量均明显减少，但照射组更明显，二者相比差异有非常显著性(P<0.01)，PF4处理组CFU-GM较照射组显著增高，且较对照组也明显增高，分别与二者比较P<0.01和P<0.05(见表2)。
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表2 小鼠7.5 Gyγ射线照射第8天骨髓BMC数、DNA含量、CFU-GM集落/股骨的变化(±s) 组别
BMC数(×109/L)
DNA含量(A)
CFU-GM(集落)
照射
4.69±0.87
0.0814±0.00015
3.28±2.36
PF4+照射
, 百拇医药
31.25±6.57**
0.2550±0.00027**
89.57±13.15**
正常对照
175.00±12.96
0.8396±0.05356
74.14±11.81
注：n=10；与照射组比较，**P<0.01 3.PF4对内源性脾结节形成的影响
小鼠照射后第8天的脾结节，PF4处理组为6.25个/小鼠，照射组为1.50个/小鼠，PF4处理组较照射组明显增高，二者比较差异有非常显著性(P<0.01)。
, 百拇医药
4.流式细胞分析术分析PF4对BMC周期的影响
用流式细胞仪分别测定照后第8天，照射组、PF4处理组及对照组细胞周期分布，各期所占的比例(见表3)。PF4处理组细胞体积无增大，分布较集中，坏死细胞0.5%，G1期较照射组增高，与正常对照组相似。照射组较PF4处理组细胞体积增大，分布弥散，出现了异常增高的坏死、凋亡峰，比例达63.8%，正常细胞明显减少，为23.8%(见图1，表3)，其S期及G1期比例相对增高。
图1 流式细胞术分析PF4对照射小鼠第8天BMC影响分析图
表3 流式细胞术测定受照小鼠第8天BMC周期分布(%) 组别
G0/G1
, 百拇医药
S
G2/M
死亡细胞
照射
74.0
19.6
6.4
63.8
PF4+照射
83.6
13.5
2.9
0.5
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正常对照
83.9
13.8
2.4
0.2
注：n=10 三、讨论
PF4是血小板α颗粒释放的一种特异性蛋白，近年的研究表明，其对造血干祖细胞可逆性的抑制作用，主要是通过抑制DNA的合成，使细胞增殖周期阻滞于S期而实现的[5]。
造血细胞是一增殖活跃的细胞群，首当其冲受射线损伤。辐射损伤后，造血功能障碍的主要原因之一就是射线杀伤了赖以维持造血功能的造血干细胞，而造血干细胞的损伤是决定机体死亡的关键因素。本实验中，照前20 h应用PF4能提高小鼠30 d的存活率及平均存活天数，经PF4预处理后，受照小鼠内源性脾结节和BMC数及其DNA含量较照射组均明显增多，提示PF4可保护受照小鼠造血干祖细胞。其机制可能是预处理组小鼠的造血干祖细胞，被阻滞于S期，而S期细胞对辐射最不敏感，降低了它们对辐射的敏感性，从而达到保护作用。
, 百拇医药
电离辐射对具有增殖能力的细胞主要效应是推迟核分裂，其中以G2期阻滞为主。当照射剂量一定时，有丝分裂延迟依赖于照射时细胞所处的周期时相[6]。本实验流式细胞术分析结果表明，小鼠接受7.5 Gy 60Co γ射线照射第8天，BMC的S期延迟，G2+M期阻滞；PF4组无S期延迟及G2+M期阻滞，G1期也较照射组增高，与正常对照组各时相基本一致，提示其BMC周期进程较照射组快。这可能与细胞各周期时相的放射敏感性不同有关，其中，G2+M期对射线最敏感，而S期抗辐射性最强[7]。在照射组，BM细胞死亡达63.8%，其残存细胞中的G2+M期细胞，于照射后发生G2期阻滞。经PF4处理后，小鼠BM干祖细胞同步化阻滞于S期，因此照射时未发生G2阻滞，反而加速了其细胞周期进程，这反映PF4能促进照射后干祖细胞进入细胞周期。另外，照射后第8天，PF4对BM细胞可逆性的抑制作用已解除，阻滞于S期的干祖细胞也迅速进入了细胞周期并增殖分化，从细胞培养中可以看出，预处理组小鼠CFU-GM集落较照射组显著增多，且较正常对照组也明显增多。
, 百拇医药
上述结果表明小鼠经PF4预处理后，其骨髓细胞对辐射具有较大的耐受性，这一作用可望达到临床肿瘤放、化疗或核泄漏事故引起辐射时保护造血干祖细胞的目的。
参考文献
1，Han ZC,Sensé be L,Abgrall JF,et al.Platelet factor 4 inhibits human megakaryocytopoiesis in vitro.Blood,1991,75:1234-1239.
2，Xi XD,Chen JP,Fournier S,et al.Direct and reversible inhibition of platelet factor 4 on megakaryocyte development from CD34+ cord blood cells:comparative studies with transforming growth factor β 1.Br J Haemetol,1996,93:265-272.
, 百拇医药
3，Lecomte-Raclet L,Alemany M,Grand AS,et al.New insights into the negative regulation of hematopoiesis by chemokine platelet factor 4 and related peptides.Blood,1998,91:2772-2780.
4，Han ZC,Lu M,Li J,et al.Platelet factor 4 and other CXC chemokines supprot the survival of normal hematopoietic cells and reduce the chemosensitivity of cell to cytoxic agents.Blood,1997,89:2328-2335.
5，韩忠朝，张学军，奚晓东，等.PF4保护造血前体细胞及其作用机制的研究.实验生物学报，1996，28：415-425.
6，叶飞，刘树铮.不同剂量X射线对同步化HeLaS3细胞周期的影响.中华放射医学与防护杂志，1999，19：381-384.
7，刘及，主编.辐射血液学.北京：原子能出版社，1991.12-38.
(收稿日期:2000-01-18), 百拇医药
单位：杨岚(710032 西安，第四军医大学血液科)；朱柏贵(江苏省武警医院)；田琼(放射医学教研室)；张绍章(放射医学教研室)；张发科(放射医学教研室)；孙秉中(710032 西安，第四军医大学血液科)
关键词：
中华放射医学与防护杂志000514 血小板第4因子(PF4)是一种肝素结合多肽，具有中和肝素、炎症的趋化、抑制血管形成和抑制巨核细胞生长的功能[1]，属于造血生长负性调节因子。近年的研究表明，PF4能可逆的抑制造血干细胞、祖细胞的生长[2，3]，并因此而保护骨髓造血干祖细胞免受细胞毒剂的损伤[4]。目前，尚未见到PF4减少哺乳动物对辐射的敏感性、保护正常造血干祖细胞的报道。本实验旨在探讨PF4对急性辐射损伤小鼠骨髓细胞保护的作用机理。
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一、材料和方法
1.实验动物：BALB/c小鼠70只，雄性，体重(19～21)g，鼠龄10～12周，由本校实验动物中心提供，在标准条件下喂养。
2.照射条件：60Coγ射线一次全身均匀照射，吸收剂量为7.5 Gy，吸收剂量率为1.67 Gy/min。
3.试剂：PF4由上海贝特生物技术有限公司提供，用双蒸水稀释成工作液，置4℃冰箱保存备用，稀释浓度为100 μg/ml。
4.方法：70只BALB/c小鼠分为两个实验大组。所有小鼠均接受PF4或PBS 2次腹腔注射(ip)，间隔6 h，第2次注射后20 h，给予7.5 Gy60Coγ射线全身照射。
(1)实验1：将40只BALB/c小鼠随机分为4组，每组10只。照射对照组：PBS 17 ml*kg-1.次-1，PF4 20 μg组：PF4 20 μg.kg-1.次-1，PF4 40 μg组：PF4 40μg.kg-1.次-1，PF4 60 μg组： PF4 60 μg.kg-1.次-1。照射后30 d内，每天记录动物死亡情况。
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(2)实验2：将30只BALB/c小鼠随机分为3组，每组10只。照射组：PBS 17 ml*kg-1.次-1，PF4+照射组：PF4 20 μg.kg-1.次-1，对照组：不接受ip及照射。照后8 d，每组小鼠经颈椎脱臼法处死，取出股骨，剔除肌肉和结缔组织，剪开股骨两头，用RPMI 1640培养液冲洗出骨髓细胞，1500 r/min离心10 min，去上清，沉淀细胞用培养液洗涤2次，将细胞悬浮在新鲜的培养液中待用，计数股骨骨髓有核细胞数(BMC)。用紫外分光光度计和流式细胞分析术测定其DNA含量及细胞周期变化和细胞死亡(包括凋亡)情况，以双层琼脂培养法测定粒-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)的形成能力，取出脾脏并浸泡在Bouin′s液中24 h，观察脾结节形成率。
5.统计学处理：数据以
±s表示，存活率用χ2检验，组间比较用t检验。, http://www.100md.com
二、结果
1.PF4对受60Coγ射线照射小鼠存活的影响(见表1)。
表1 不同PF4剂量对7.5 Gy60Coγ射线全身照射
小鼠存活的影响 组别
PF4剂量
(μg.kg-1.次-1)
存活数
(只)
存活率/
30天(%)
, 百拇医药
平均存活日
(
±s)照射
0.0
0
0
12.4±6.6
PF4+照射1
20.0
5
50**
25.8±6.1
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PF4+照射2
40.0
6
60**
24.2±7.7
PF4+照射3
60.0
6
60**
23.0±9.8
注：n=10； 与照射组比较， **P<0.01
, 百拇医药 实验小鼠接受7.5 Gy的60Coγ射线全身照射后，观察30 d，照射前未接受PF4处理的小鼠，全部死亡，存活率为0。照射前接受PF4不同剂量处理的3组小鼠，20μg.kg-1组死亡5例，存活率50%，40 μg.kg-1和60 μg.kg-1组分别死亡4例，存活率均为60%。未接受PF4处理组与接受PF4不同剂量处理的3组成活率相比较，明显减低，差异均有显著性(P<0.01)，接受PF4不同剂量处理的3组之间存活率比较差异均无显著性(P>0.05)。
2.PF4对小鼠骨髓BMC数、DNA含量、CFU-GM的影响
7.5 Gy 60Coγ射线全身照射后第8天，照射组与PF4处理组BMC数目、DNA含量均明显减少，但照射组更明显，二者相比差异有非常显著性(P<0.01)，PF4处理组CFU-GM较照射组显著增高，且较对照组也明显增高，分别与二者比较P<0.01和P<0.05(见表2)。
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表2 小鼠7.5 Gyγ射线照射第8天骨髓BMC数、DNA含量、CFU-GM集落/股骨的变化(
±s) 组别BMC数(×109/L)
DNA含量(A)
CFU-GM(集落)
照射
4.69±0.87
0.0814±0.00015
3.28±2.36
PF4+照射
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31.25±6.57**
0.2550±0.00027**
89.57±13.15**
正常对照
175.00±12.96
0.8396±0.05356
74.14±11.81
注：n=10；与照射组比较，**P<0.01 3.PF4对内源性脾结节形成的影响
小鼠照射后第8天的脾结节，PF4处理组为6.25个/小鼠，照射组为1.50个/小鼠，PF4处理组较照射组明显增高，二者比较差异有非常显著性(P<0.01)。
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4.流式细胞分析术分析PF4对BMC周期的影响
用流式细胞仪分别测定照后第8天，照射组、PF4处理组及对照组细胞周期分布，各期所占的比例(见表3)。PF4处理组细胞体积无增大，分布较集中，坏死细胞0.5%，G1期较照射组增高，与正常对照组相似。照射组较PF4处理组细胞体积增大，分布弥散，出现了异常增高的坏死、凋亡峰，比例达63.8%，正常细胞明显减少，为23.8%(见图1，表3)，其S期及G1期比例相对增高。
图1 流式细胞术分析PF4对照射小鼠第8天BMC影响分析图
表3 流式细胞术测定受照小鼠第8天BMC周期分布(%) 组别
G0/G1
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S
G2/M
死亡细胞
照射
74.0
19.6
6.4
63.8
PF4+照射
83.6
13.5
2.9
0.5
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正常对照
83.9
13.8
2.4
0.2
注：n=10 三、讨论
PF4是血小板α颗粒释放的一种特异性蛋白，近年的研究表明，其对造血干祖细胞可逆性的抑制作用，主要是通过抑制DNA的合成，使细胞增殖周期阻滞于S期而实现的[5]。
造血细胞是一增殖活跃的细胞群，首当其冲受射线损伤。辐射损伤后，造血功能障碍的主要原因之一就是射线杀伤了赖以维持造血功能的造血干细胞，而造血干细胞的损伤是决定机体死亡的关键因素。本实验中，照前20 h应用PF4能提高小鼠30 d的存活率及平均存活天数，经PF4预处理后，受照小鼠内源性脾结节和BMC数及其DNA含量较照射组均明显增多，提示PF4可保护受照小鼠造血干祖细胞。其机制可能是预处理组小鼠的造血干祖细胞，被阻滞于S期，而S期细胞对辐射最不敏感，降低了它们对辐射的敏感性，从而达到保护作用。
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电离辐射对具有增殖能力的细胞主要效应是推迟核分裂，其中以G2期阻滞为主。当照射剂量一定时，有丝分裂延迟依赖于照射时细胞所处的周期时相[6]。本实验流式细胞术分析结果表明，小鼠接受7.5 Gy 60Co γ射线照射第8天，BMC的S期延迟，G2+M期阻滞；PF4组无S期延迟及G2+M期阻滞，G1期也较照射组增高，与正常对照组各时相基本一致，提示其BMC周期进程较照射组快。这可能与细胞各周期时相的放射敏感性不同有关，其中，G2+M期对射线最敏感，而S期抗辐射性最强[7]。在照射组，BM细胞死亡达63.8%，其残存细胞中的G2+M期细胞，于照射后发生G2期阻滞。经PF4处理后，小鼠BM干祖细胞同步化阻滞于S期，因此照射时未发生G2阻滞，反而加速了其细胞周期进程，这反映PF4能促进照射后干祖细胞进入细胞周期。另外，照射后第8天，PF4对BM细胞可逆性的抑制作用已解除，阻滞于S期的干祖细胞也迅速进入了细胞周期并增殖分化，从细胞培养中可以看出，预处理组小鼠CFU-GM集落较照射组显著增多，且较正常对照组也明显增多。
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上述结果表明小鼠经PF4预处理后，其骨髓细胞对辐射具有较大的耐受性，这一作用可望达到临床肿瘤放、化疗或核泄漏事故引起辐射时保护造血干祖细胞的目的。
参考文献
1，Han ZC,Sensé be L,Abgrall JF,et al.Platelet factor 4 inhibits human megakaryocytopoiesis in vitro.Blood,1991,75:1234-1239.
2，Xi XD,Chen JP,Fournier S,et al.Direct and reversible inhibition of platelet factor 4 on megakaryocyte development from CD34+ cord blood cells:comparative studies with transforming growth factor β 1.Br J Haemetol,1996,93:265-272.
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3，Lecomte-Raclet L,Alemany M,Grand AS,et al.New insights into the negative regulation of hematopoiesis by chemokine platelet factor 4 and related peptides.Blood,1998,91:2772-2780.
4，Han ZC,Lu M,Li J,et al.Platelet factor 4 and other CXC chemokines supprot the survival of normal hematopoietic cells and reduce the chemosensitivity of cell to cytoxic agents.Blood,1997,89:2328-2335.
5，韩忠朝，张学军，奚晓东，等.PF4保护造血前体细胞及其作用机制的研究.实验生物学报，1996，28：415-425.
6，叶飞，刘树铮.不同剂量X射线对同步化HeLaS3细胞周期的影响.中华放射医学与防护杂志，1999，19：381-384.
7，刘及，主编.辐射血液学.北京：原子能出版社，1991.12-38.
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