Egr-1启动子基因调控FLT3配基基因表达的实验研究
作者：杜楠 裴雪涛 罗成基 李梁 冯凯 白慈贤 孙兵 赵鹏
单位：杜楠(100034 北京，解放军304医院血液肿瘤科)；裴雪涛(北京放射医学研究所)；罗成基(第三军医大学复合伤研究所)；李梁(北京放射医学研究所)；冯凯(北京放射医学研究所)；白慈贤(北京放射医学研究所)；孙兵(北京放射医学研究所)；赵鹏(第三军医大学复合伤研究所)
关键词：辐射；Egr-1；启动子；FLT3配基；基因治疗
中华放射医学与防护杂志000502 【摘要】 目的 探索辐射诱导基因调控元件启动的造血生长因子表达及其对造血的保护作用。方法 本实验将携带Egr-1调控序列的FLT3配基(FL)和EGFP基因双顺反子载体(Egr-EF)转染骨髓基质细胞系HFCL，采用流式细胞仪、RT-PCR、ELISA及细胞增殖法等观察细胞受照后Egr-1调控元件诱导的FL表达及促进造血细胞的增殖作用。结果 在转染细胞HFCL/EF细胞中证实有外源性基因的整合和表达，在2.5 Gy辐射后16 h的细胞培养上清液中表明FL含量较照射前明显增高((P<0.01)，)；辐射后10 d HFCL/EF培养上清液对CD34+造血祖细胞的作用较辐射前具有明显的扩增作用((P<0.01)，)。结论 在辐射后Egr-1启动子调控的FL基因表达明显增高并具有保护造血作用。
, 百拇医药
Studies on the expression of hematopoietic growth factors regulated by Egr-1 promoter
DU Nan,PEI Xuetao,LUO Chengji, et al.
(the Third Mititary Medical University,Chongqing 400038,China)
【Abstract】 Objective To explore the regulatory effects of radiation-inducible gene on the expression of FLT3 ligand genes. Methods The human EL cDNA and EGFP cDNA were linked together with IRES and then inserted into the expression vector pCI-Egr-1, which was constructed by substituting CMV promoter in pCI-neo with the Egr-1 promoter(Egr-EF).The vector was transferred into human bone marrow stromal cell line HFCL by lipofectinTM.The cells were exposed to γ-radiation from 60Co source at 0.5-20Gy.The contents of green fluorescence in HFCL/EF cells were detected with FACS.The expression of FL in HFCL/EF cells was confirmed with RT-PCR and ELISA respectively.The effects of FL in HFCL/EF cultural supernatants on expansion of CD34+ cells were also studied. Results The amounts of secreted FL in serum-free supernatants of Egr-EF were significantly higher than in the control group.EGFP and FL cDNA were successfully integrated and expressed in the cells,which were confirmed by FACS,RT-PCR and ELISA analysis.On day 10 of culture the number of CD34+ cells was significantly higher than that of the non-radiation group. Conclusion These in vitro data provide an experimental basis for the in vivo use of gene therapy of hematopoietic growth factor gene regulated by Egr-1 promoter to protect hematopoiesis from radiation injury.
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【Key words】 Radiation; Egr-1; Promoter; FLT3 ligand; Gene therapy
电离辐射可诱导细胞中早期生长反应(eaerly growth response,EGR-1)基因表达[1],Egr-1基因启动子对辐射极为敏感，它含有6个CArG辐射敏感元件，电离辐射通过CArG元件诱导Egr-1的表达。最近Weichselbaum等[2]将该启动子诱导的基因疗法与放射治疗结合起来(gene-radiotherapy)，证明用特异的辐射诱导元件Egr-1启动子经辐射可诱导下游基因超强表达。现已证明辐射早期应用造血生长因子具有抗辐射及促进造血恢复作用，FL(FLT3 Ligand)是作用于早期造血祖细胞的细胞因子[3]，其抗辐射作用较其它细胞因子更强，该实验采用Egr-1调控序列启动造血因子基因(FL)的表达载体导入骨髓基质细胞，经辐射诱导Egr-1启动子下游造血因子基因表达，以促进造血恢复的抗辐射作用。
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材料和方法
1.重组载体的构建：将FL cDNA (pUC18/FL由Indiana大学Dr Wang LS提供)和pEGFP-N1用IRES(pIRES)连接，再重组于携带Egr-1调控元件的pCIneo载体上(北京放射医学研究所吕星博士惠赠)[4]，然后，构建成pCIneo-Egr-1-EGFP-IRES-FL载体(Egr-EF)及各对照组载体。
2.细胞培养及转染：人骨髓基质细胞系HFCL[5]用含10%小牛血清的DMEM培养，经脂质体介导DNA转染，用G418选择阳性克隆称为HFCL/EF。采用免疫磁珠法(MACS，Miltenti Biotec Germany)分离CD34+细胞[6]，在含20%FCS、50 ng/ml SCF\,2 ng/ml IL-3及20 ng/ml IL-6的IMDM (GIBCO)培养基中，均在37℃及体积分数为5% CO2条件下。
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3.EGFP报告基因的表达：将HFCL/EF细胞接受0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0、10.0、20.0 Gy 60Co照射，16 h后，在倒置荧光显微镜下观察，然后用流式细胞仪分析。
4.RT-PCR检测[7]FL mRNA表达：取HFCL/EF细胞，用基因组DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒使用说明方法分别提取基因组DNA和总RNA。按FL及β-actin基因序列合成引物。FL的PCR产物为225bp,P1 5'-CTT GGA CCC AGC GAC AGT CTT G-3',P2 5'TGT TGC TGA GCT CGG GAC TC-3';β-actin引物的PCR产物为249 bp,P1 5'AAG GCC AAC CGC GAG AAG AT3',P2 5'TCG GTG AGG ATC TTC ATG GAG3';RT-PCR用cDNA合成试剂盒及方法合成cDNA，再用上述引物进行PCR，94℃，60 s，68℃ 60 s，72℃ 120 s共30次循环。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳。
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5.FL表达量检测：取经2.5 Gy辐射后消化的培养细胞，按1×105细胞接种于6孔培养板，待细胞贴壁后，用PBS洗涤3次，用无血清IMDM培养每8 h换液并收集细胞培养上清液，每种样品重复3孔，作时间曲线图，用人FL多抗(Santa Cruz公司)按产品说明常规测定FL含量。
6.2.5 Gy照后细胞培养上清液对脐血CD34+细胞的体外扩增：培养体系中含30%的2.5 Gy照后16 h的转染细胞培养上清、12.5%HS、12.5%FCS、5×10-6mol/L氢化可的松、CD34+细胞5×103/孔及其它细胞因子(SCF 50 ng/ml+IL-3 20 ng/ml+IL-6 20 ng/ml)，阳性对照为标准品FL(Immunex)40 ng/ml及无培养上清的上述体系，对照组为未照射或无细胞因子的上述培养条件，10 d后，用流式细胞仪或倒置荧光显微镜分析CD34+细胞数量。
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7.HFCL/EF对2.0 Gy辐射后骨髓细胞的影响：取正常人肋骨骨髓分离单个核细胞(MNC)，制备5×106/ml细胞悬液，加入12孔板中，分别加入MNC(1×104/孔)和HFCL/EF(1×103/孔)，其它培养体系同6，给予2.5 Gy 60Co照射，常规培养7天计数每孔非粘附细胞。
结 果
1.载体的构建及转染骨髓基质细胞：构建过程见图1。经限制性内切酶分析鉴定证明Egr-1基因调控序列连接双顺反子EGFP cDNA和FL cDNA于pCIneo载体上，并筛选出正向重组子。然后将其用脂质体转染骨髓基质细胞系HFCL，经G418抗性筛选及用FL定量分析，挑选出一个表达FL的阳性细胞克隆No.4(称为HFCL/EF)。
2.流式细胞仪检测HFCL/EF细胞辐射后绿色荧光蛋白的诱导表达：如图2所示，HFCL/EF细胞经辐射后，绿色荧光强度增加，尤其是在2～10 Gy之间明显提高，表明Egr-1启动子具有诱导下游基因表达的作用。
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图1 Egr-1调控的EGFP和FL cDNA双顺反子表达载体的构建
3.FL的含量检测：用ELISA检测转染细胞培养上清液FL水平，结果显示HFCL/EF培养上清液FL含量为214.45±35.61 ng/ml，照后16 h增至805.46±107.21 ng/ml，并且随着时间延长表达量减弱(见图3)，提示这种表达的时相性并具有辐射敏感性。
图2 FACS检测HFCL/EF细胞在不同辐射计量
图3 电离辐射激活Egr-1启动子诱导FL表达的时间曲线 4.照后HFCL/EF培养上清液对CD34+细胞增殖的影响：如图4流式细胞仪(FACS)分析，结果表明：FL与其他细胞因子联合应用具有短时间内可扩增早期造血祖细胞的作用[(208.34±15.65)×103/ml]，而HFCL/EF细胞经照射后其培养上清也具有扩增祖细胞的作用[(173.09±11.58)×103/ml]，较辐射前[(68.04±13.73)×103/ml]具有明显增强(P<0.05)。
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图4 流式细胞仪分析用辐射后HFCL/EF上清液培养CD34+细胞群的变化
a.经MACS分离脐血CD34+细胞的表面特征。b.HFCL/EF上清液培养10 d CD34+细胞群的变化。
c.HFCL上清液培养的CD+细胞群的变化。d.脐血细胞MACS分离前细胞群特征
5.照射的HFCL/EF细胞对骨髓有核细胞数量的影响：结果表明HFCL/EF与骨髓有核细胞共培养后，经辐射含有Egr-1启动子的HFCL/EF细胞较未含有该启动子的细胞对经2.5 Gy辐射的造血细胞具有促进其恢复和增殖的作用[HFCL/EF组为(256.12±46.43)×104细胞/孔，HFCL组为(43.21±6.73)×104细胞/孔，P<0.05]。
6.RT-PCR检测HFCL/EF细胞FL mRNA表达：用RT-PCR方法检测FL基因转移细胞的mRNA转录，如图5所示，可见增强的FL mRNA表达。
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讨 论
造血干/祖细胞属于更新活跃、增殖旺盛的细胞，具有很高的辐射敏感性，电离辐射所致造血损伤的主要环节是造血祖细胞增殖能力的丧失或抑制。FL(FLT3 Ligand)是最近发现的一种主要促进早期造血干/祖细胞增殖的细胞因子，是一种早期造血的关键性调节因子，与SCF有许多相同之处，随后发现FL与其他细胞因子相比具有更强的辐射后造血保护作用及更广阔的临床应用前景[3]。然而它存在半衰期短，需大量、反复、长期应用才有效，且有一定的副作用等限制使用的因素，而造血因子基因疗法具有促进造血重建的作用且克服上述缺点。Egr-1基因是辐射早期对细胞起调控作用的转录因子，其调控序列可直接感受氧自由基或电离辐射等刺激而诱导下游基因表达。Manome等[8]研究发现在靶细胞或靶组织中的Egr-1调控序列经辐射后，其下游基因产物呈空间和时间性表达[9]，如果说在特定组织内的基因转移只提供一个表达产物的粗略范围，那么电离辐射技术使得Egr-1调控的基因表达更加精确[10]。本实验将双顺反子EGFP/FL cDNA插入携带Egr-1启动子的真核表达载体pCIneo的多克隆酶切位点上，利用微小RNA病毒的内核糖体进入位点(IRES)构建的双顺反子载体则能将多个基因在单一启动子控制下转录形成单一mRNA，因而避免了在转录调控水平对基因表达的影响，该实验将Egr-EF导入骨髓基质细胞系HFCL，在HFCL/EF细胞中表达的绿色荧光蛋白证明了外源基因的整合并确定其对不同辐射剂量的敏感性，从RT-PCR及ELISA分析证明双顺反子能很好地表达两个基因且具有时相性，其表达水平并不低于单个基因的载体，而且它将为研究多个因子协同作用提供一个简单而有效的载体。在体外HFCL/EF经辐射后FL水平均明显升高，并用该细胞培养上清结合其它因子对CD34+细胞有明显扩增作用，提示Egr-1启动子的确可诱导FL超强表达，为进一步模拟造血微环境，将转双顺反子的基质细胞与共培养的骨髓有核细胞同时照射，表明超表达细胞因子的基质细胞对造血细胞具有保护作用，由此提示Egr-1启动的造血因子基因疗法具有抗辐射促进造血恢复的作用。
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图5 RT-PCR检测HFCL/EF细胞中FL mRNA表达
1.Marker15000+2000;2.FHCL细胞β-actin表达；
3.HFCL/EF细胞FL和β-actin mRNA表达
根据Egr-1基因调控元件的特性，可以看出首先Egr-1启动子的诱导因素即辐射本身具有治疗肿瘤作用，但对机体造血组织是损伤因素，然而Egr-1调控元件启动的基因表达产物则是利用辐射诱导敏感性针对辐射对造血的损伤因素起作用的；Egr-1启动子与一般启动子包括组织特异性启动子等有所不同，一般启动子诱导的基因表达呈组织性表达，常呈持续性表达，而Egr-1启动子受到辐射后早期诱导的下游基因表达为超强表达，表达量多而作用强，当辐射反应结束，基因的超强表达又随之减弱或终止，由此可消除这种过表达带来的副作用。这种基因调控的完成有望使人们一直疑虑的辐射保护作用很强的早期造血生长因子的临床应用变成现料。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39900040)；国家杰出青年自然科学基金资助项目(39825111)
参考文献
1，Datt R,Taneja N,Sukhatme VP,et al.Reactive oxygen intermediates target CC(A/T)6GG sequences to mediate activation of the early growth response transcription factor.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:2419-2422.
2，Weichselbaum RR,Hallahan DE,Beckett MA,et al.Gene therapy targeting by radiation preferentially radiosensitizes tumor cells.Cancer Res,1994,54:4266-4269.
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3，Gratwohl A,John L,Baldomero H,et al.FLT3 ligand provides hematopoietic protection from total body irradiation in rabbits.Blood,1998,92:765-769.
4，吕星，邢瑞云，孙志贤，等.Egr-1基因调控序列的克隆及其辐射诱导特性的鉴定.中国肿瘤生物治疗杂志，1998，5：16-19.
5，姜学英.骨髓基质细胞培养.见：郑德先，吴克复，褚建新主编.现代实验血液学研究方法与技术.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1999.25-26.
6，裴雪涛，王立生，徐黎，等.CD34+造血祖细胞的定向诱导分化研究.中华血液学杂志，1998，19：289-293.
, 百拇医药 7，F.奥斯伯著.颜子颖，王海林译.精编分子生物学实验指南.北京：科学出版社，1998.587-601.
8，Manome Y,Kunieda T,Wen PY,et al.Transgene expresion in malignant glioma using a replicative adenoviral vector containing the Egr-1 promoter:activation by ionizing radiation or uptake of radioactive iododeoxyuidine.Hum Gene Ther,1998,9:1409-1417.
9，Hallahan DE,Mauceri HJ,Seung LP,et al.Spatial and temporal control of gene therapy using ionizing radiation.Nature Med,1995,1:786-791.
10，Paillard F.The control of transgene expression with radiation.Hum Gene Ther,1998,9:1393-1394.
(收稿日期:1999-10-09), 百拇医药
单位：杜楠(100034 北京，解放军304医院血液肿瘤科)；裴雪涛(北京放射医学研究所)；罗成基(第三军医大学复合伤研究所)；李梁(北京放射医学研究所)；冯凯(北京放射医学研究所)；白慈贤(北京放射医学研究所)；孙兵(北京放射医学研究所)；赵鹏(第三军医大学复合伤研究所)
关键词：辐射；Egr-1；启动子；FLT3配基；基因治疗
中华放射医学与防护杂志000502 【摘要】 目的 探索辐射诱导基因调控元件启动的造血生长因子表达及其对造血的保护作用。方法 本实验将携带Egr-1调控序列的FLT3配基(FL)和EGFP基因双顺反子载体(Egr-EF)转染骨髓基质细胞系HFCL，采用流式细胞仪、RT-PCR、ELISA及细胞增殖法等观察细胞受照后Egr-1调控元件诱导的FL表达及促进造血细胞的增殖作用。结果 在转染细胞HFCL/EF细胞中证实有外源性基因的整合和表达，在2.5 Gy辐射后16 h的细胞培养上清液中表明FL含量较照射前明显增高((P<0.01)，)；辐射后10 d HFCL/EF培养上清液对CD34+造血祖细胞的作用较辐射前具有明显的扩增作用((P<0.01)，)。结论 在辐射后Egr-1启动子调控的FL基因表达明显增高并具有保护造血作用。
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Studies on the expression of hematopoietic growth factors regulated by Egr-1 promoter
DU Nan,PEI Xuetao,LUO Chengji, et al.
(the Third Mititary Medical University,Chongqing 400038,China)
【Abstract】 Objective To explore the regulatory effects of radiation-inducible gene on the expression of FLT3 ligand genes. Methods The human EL cDNA and EGFP cDNA were linked together with IRES and then inserted into the expression vector pCI-Egr-1, which was constructed by substituting CMV promoter in pCI-neo with the Egr-1 promoter(Egr-EF).The vector was transferred into human bone marrow stromal cell line HFCL by lipofectinTM.The cells were exposed to γ-radiation from 60Co source at 0.5-20Gy.The contents of green fluorescence in HFCL/EF cells were detected with FACS.The expression of FL in HFCL/EF cells was confirmed with RT-PCR and ELISA respectively.The effects of FL in HFCL/EF cultural supernatants on expansion of CD34+ cells were also studied. Results The amounts of secreted FL in serum-free supernatants of Egr-EF were significantly higher than in the control group.EGFP and FL cDNA were successfully integrated and expressed in the cells,which were confirmed by FACS,RT-PCR and ELISA analysis.On day 10 of culture the number of CD34+ cells was significantly higher than that of the non-radiation group. Conclusion These in vitro data provide an experimental basis for the in vivo use of gene therapy of hematopoietic growth factor gene regulated by Egr-1 promoter to protect hematopoiesis from radiation injury.
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【Key words】 Radiation; Egr-1; Promoter; FLT3 ligand; Gene therapy
电离辐射可诱导细胞中早期生长反应(eaerly growth response,EGR-1)基因表达[1],Egr-1基因启动子对辐射极为敏感，它含有6个CArG辐射敏感元件，电离辐射通过CArG元件诱导Egr-1的表达。最近Weichselbaum等[2]将该启动子诱导的基因疗法与放射治疗结合起来(gene-radiotherapy)，证明用特异的辐射诱导元件Egr-1启动子经辐射可诱导下游基因超强表达。现已证明辐射早期应用造血生长因子具有抗辐射及促进造血恢复作用，FL(FLT3 Ligand)是作用于早期造血祖细胞的细胞因子[3]，其抗辐射作用较其它细胞因子更强，该实验采用Egr-1调控序列启动造血因子基因(FL)的表达载体导入骨髓基质细胞，经辐射诱导Egr-1启动子下游造血因子基因表达，以促进造血恢复的抗辐射作用。
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材料和方法
1.重组载体的构建：将FL cDNA (pUC18/FL由Indiana大学Dr Wang LS提供)和pEGFP-N1用IRES(pIRES)连接，再重组于携带Egr-1调控元件的pCIneo载体上(北京放射医学研究所吕星博士惠赠)[4]，然后，构建成pCIneo-Egr-1-EGFP-IRES-FL载体(Egr-EF)及各对照组载体。
2.细胞培养及转染：人骨髓基质细胞系HFCL[5]用含10%小牛血清的DMEM培养，经脂质体介导DNA转染，用G418选择阳性克隆称为HFCL/EF。采用免疫磁珠法(MACS，Miltenti Biotec Germany)分离CD34+细胞[6]，在含20%FCS、50 ng/ml SCF\,2 ng/ml IL-3及20 ng/ml IL-6的IMDM (GIBCO)培养基中，均在37℃及体积分数为5% CO2条件下。
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3.EGFP报告基因的表达：将HFCL/EF细胞接受0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0、10.0、20.0 Gy 60Co照射，16 h后，在倒置荧光显微镜下观察，然后用流式细胞仪分析。
4.RT-PCR检测[7]FL mRNA表达：取HFCL/EF细胞，用基因组DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒使用说明方法分别提取基因组DNA和总RNA。按FL及β-actin基因序列合成引物。FL的PCR产物为225bp,P1 5'-CTT GGA CCC AGC GAC AGT CTT G-3',P2 5'TGT TGC TGA GCT CGG GAC TC-3';β-actin引物的PCR产物为249 bp,P1 5'AAG GCC AAC CGC GAG AAG AT3',P2 5'TCG GTG AGG ATC TTC ATG GAG3';RT-PCR用cDNA合成试剂盒及方法合成cDNA，再用上述引物进行PCR，94℃，60 s，68℃ 60 s，72℃ 120 s共30次循环。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳。
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5.FL表达量检测：取经2.5 Gy辐射后消化的培养细胞，按1×105细胞接种于6孔培养板，待细胞贴壁后，用PBS洗涤3次，用无血清IMDM培养每8 h换液并收集细胞培养上清液，每种样品重复3孔，作时间曲线图，用人FL多抗(Santa Cruz公司)按产品说明常规测定FL含量。
6.2.5 Gy照后细胞培养上清液对脐血CD34+细胞的体外扩增：培养体系中含30%的2.5 Gy照后16 h的转染细胞培养上清、12.5%HS、12.5%FCS、5×10-6mol/L氢化可的松、CD34+细胞5×103/孔及其它细胞因子(SCF 50 ng/ml+IL-3 20 ng/ml+IL-6 20 ng/ml)，阳性对照为标准品FL(Immunex)40 ng/ml及无培养上清的上述体系，对照组为未照射或无细胞因子的上述培养条件，10 d后，用流式细胞仪或倒置荧光显微镜分析CD34+细胞数量。
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7.HFCL/EF对2.0 Gy辐射后骨髓细胞的影响：取正常人肋骨骨髓分离单个核细胞(MNC)，制备5×106/ml细胞悬液，加入12孔板中，分别加入MNC(1×104/孔)和HFCL/EF(1×103/孔)，其它培养体系同6，给予2.5 Gy 60Co照射，常规培养7天计数每孔非粘附细胞。
结 果
1.载体的构建及转染骨髓基质细胞：构建过程见图1。经限制性内切酶分析鉴定证明Egr-1基因调控序列连接双顺反子EGFP cDNA和FL cDNA于pCIneo载体上，并筛选出正向重组子。然后将其用脂质体转染骨髓基质细胞系HFCL，经G418抗性筛选及用FL定量分析，挑选出一个表达FL的阳性细胞克隆No.4(称为HFCL/EF)。
2.流式细胞仪检测HFCL/EF细胞辐射后绿色荧光蛋白的诱导表达：如图2所示，HFCL/EF细胞经辐射后，绿色荧光强度增加，尤其是在2～10 Gy之间明显提高，表明Egr-1启动子具有诱导下游基因表达的作用。
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图1 Egr-1调控的EGFP和FL cDNA双顺反子表达载体的构建
3.FL的含量检测：用ELISA检测转染细胞培养上清液FL水平，结果显示HFCL/EF培养上清液FL含量为214.45±35.61 ng/ml，照后16 h增至805.46±107.21 ng/ml，并且随着时间延长表达量减弱(见图3)，提示这种表达的时相性并具有辐射敏感性。
图2 FACS检测HFCL/EF细胞在不同辐射计量
图3 电离辐射激活Egr-1启动子诱导FL表达的时间曲线 4.照后HFCL/EF培养上清液对CD34+细胞增殖的影响：如图4流式细胞仪(FACS)分析，结果表明：FL与其他细胞因子联合应用具有短时间内可扩增早期造血祖细胞的作用[(208.34±15.65)×103/ml]，而HFCL/EF细胞经照射后其培养上清也具有扩增祖细胞的作用[(173.09±11.58)×103/ml]，较辐射前[(68.04±13.73)×103/ml]具有明显增强(P<0.05)。
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图4 流式细胞仪分析用辐射后HFCL/EF上清液培养CD34+细胞群的变化
a.经MACS分离脐血CD34+细胞的表面特征。b.HFCL/EF上清液培养10 d CD34+细胞群的变化。
c.HFCL上清液培养的CD+细胞群的变化。d.脐血细胞MACS分离前细胞群特征
5.照射的HFCL/EF细胞对骨髓有核细胞数量的影响：结果表明HFCL/EF与骨髓有核细胞共培养后，经辐射含有Egr-1启动子的HFCL/EF细胞较未含有该启动子的细胞对经2.5 Gy辐射的造血细胞具有促进其恢复和增殖的作用[HFCL/EF组为(256.12±46.43)×104细胞/孔，HFCL组为(43.21±6.73)×104细胞/孔，P<0.05]。
6.RT-PCR检测HFCL/EF细胞FL mRNA表达：用RT-PCR方法检测FL基因转移细胞的mRNA转录，如图5所示，可见增强的FL mRNA表达。
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讨 论
造血干/祖细胞属于更新活跃、增殖旺盛的细胞，具有很高的辐射敏感性，电离辐射所致造血损伤的主要环节是造血祖细胞增殖能力的丧失或抑制。FL(FLT3 Ligand)是最近发现的一种主要促进早期造血干/祖细胞增殖的细胞因子，是一种早期造血的关键性调节因子，与SCF有许多相同之处，随后发现FL与其他细胞因子相比具有更强的辐射后造血保护作用及更广阔的临床应用前景[3]。然而它存在半衰期短，需大量、反复、长期应用才有效，且有一定的副作用等限制使用的因素，而造血因子基因疗法具有促进造血重建的作用且克服上述缺点。Egr-1基因是辐射早期对细胞起调控作用的转录因子，其调控序列可直接感受氧自由基或电离辐射等刺激而诱导下游基因表达。Manome等[8]研究发现在靶细胞或靶组织中的Egr-1调控序列经辐射后，其下游基因产物呈空间和时间性表达[9]，如果说在特定组织内的基因转移只提供一个表达产物的粗略范围，那么电离辐射技术使得Egr-1调控的基因表达更加精确[10]。本实验将双顺反子EGFP/FL cDNA插入携带Egr-1启动子的真核表达载体pCIneo的多克隆酶切位点上，利用微小RNA病毒的内核糖体进入位点(IRES)构建的双顺反子载体则能将多个基因在单一启动子控制下转录形成单一mRNA，因而避免了在转录调控水平对基因表达的影响，该实验将Egr-EF导入骨髓基质细胞系HFCL，在HFCL/EF细胞中表达的绿色荧光蛋白证明了外源基因的整合并确定其对不同辐射剂量的敏感性，从RT-PCR及ELISA分析证明双顺反子能很好地表达两个基因且具有时相性，其表达水平并不低于单个基因的载体，而且它将为研究多个因子协同作用提供一个简单而有效的载体。在体外HFCL/EF经辐射后FL水平均明显升高，并用该细胞培养上清结合其它因子对CD34+细胞有明显扩增作用，提示Egr-1启动子的确可诱导FL超强表达，为进一步模拟造血微环境，将转双顺反子的基质细胞与共培养的骨髓有核细胞同时照射，表明超表达细胞因子的基质细胞对造血细胞具有保护作用，由此提示Egr-1启动的造血因子基因疗法具有抗辐射促进造血恢复的作用。
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图5 RT-PCR检测HFCL/EF细胞中FL mRNA表达
1.Marker15000+2000;2.FHCL细胞β-actin表达；
3.HFCL/EF细胞FL和β-actin mRNA表达
根据Egr-1基因调控元件的特性，可以看出首先Egr-1启动子的诱导因素即辐射本身具有治疗肿瘤作用，但对机体造血组织是损伤因素，然而Egr-1调控元件启动的基因表达产物则是利用辐射诱导敏感性针对辐射对造血的损伤因素起作用的；Egr-1启动子与一般启动子包括组织特异性启动子等有所不同，一般启动子诱导的基因表达呈组织性表达，常呈持续性表达，而Egr-1启动子受到辐射后早期诱导的下游基因表达为超强表达，表达量多而作用强，当辐射反应结束，基因的超强表达又随之减弱或终止，由此可消除这种过表达带来的副作用。这种基因调控的完成有望使人们一直疑虑的辐射保护作用很强的早期造血生长因子的临床应用变成现料。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39900040)；国家杰出青年自然科学基金资助项目(39825111)
参考文献
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(收稿日期:1999-10-09), 百拇医药