辐射诱导基因的寻找及功能研究
作者：铁轶 罗瑛 隋建丽 周平坤
单位：(100850 北京放射医学研究所)
关键词：
中华放射医学与防护杂志000636 辐射诱导基因的启动与表达引起细胞辐射反应，若DNA损伤后，细胞中的感应分子作用于辐射诱导基因或其产物，从而进行周期调控，启动损伤修复或细胞凋亡。对辐射诱导基因的研究，有利于揭示细胞辐射反应的分子生物学机理，对细胞增殖、周期调控、癌变等的研究也提供了新的途径。随着人类基因组计划的日趋完成和蛋白组计划的提出和蓬勃兴起，在辐射诱导新基因的寻找、定位及其功能研究方面涌现出了许多新技术、新方法。本文作者对近年来的一些方法和技术作一综述。
一、辐射诱导基因的寻找与识别
1.以差异显示为基础的方法：有DDRT-PCR[1]、RNA fingerprinting by arbitrorily primer PCR (RAP)、Two-Step RAP、cDNA消减杂交[2]、代表性差别筛选法(RDA)[3]等，用来检测表达上变化的基因。抑制消减杂交法(SSH)[4]是新近发展起来的高效快速的寻找差异基因的新方法，具有平衡差异显示和高效减数杂交的优点。我们目前利用这种方法在辐射细胞的cDNA两端接上不同接头，经过两轮杂交、两轮PCR扩增，这时只有两端带有不同接头的差异片段才能指数性扩增，克隆了低剂量辐射诱导的EST库，从而获得辐射诱导表达的差异EST库。
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2.由基因产物入手，酵母双杂交[5]系统的提出和发展，可用于寻找未知辐射诱导蛋白的基因。跨种序列同源性[6]，利用基因特点，用可与别种DNA杂交的克隆常含有编码序列，来克隆辐射相关基因；寻找CpG岛[7]的方法，利用CpG岛附近多存在功能基因的特点，以其两侧的DNA序列为探针筛选cDNA文库或作Northern杂交来获取基因。
3.用复杂的探针筛选cDNA文库、Northern杂交法[8]、杂交筛选法可从特定的基因组区域中寻找基因。DNA chip的发展可将全部cDNA集中在一块1 cm2的芯片上，杂交信号用计算机自动处理可提高效率。
4.显微切割法：如果知道目的基因的染色体定位以及有显微镜切割仪可用它克隆特定染色体区域的基因。
5.采用定位候选策略对辐射诱导基因定位后分析其与辐射效应的关系，找出候选基因，再进一步筛选出辐射诱导基因。
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二、基因定位
人类基因组遗传图、物理遗传图的顺利完成为分离和鉴定单个基因或某些感兴趣的基因片段及基因定位打下基础，各种遗传标记物系统的相继出现，则是这些方法在技术上得以发展的关键。
目前有3代DNA标记物系统：RFLPs,VNTRs(Variable Number of Tandem Repeats),SPN(single nucletide polymorphysms)。
目前基因定位的原理和方法主要有下述几种。
1.原位杂交：利用探针作染色体原位杂交，从而确定某一基因或DNA序列与染色体上可见界标之间的相对位置和距离，由于染色体显带等技术条件的限制，分辨力相对较低。原位PCR是结合了原位杂交和PCR技术建立起来的基因定位方法，可进行定性、定位及相对定量分析，比原位杂交敏感而专一[9]。
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2.放射杂交法：利用高剂量的X射线将候选染色体打断成若干片段，再与仓鼠细胞形成杂交克隆，基于人类染色体上的位标相距越近其断裂频率越低的原理，通过Southern杂交和PCR方法研究杂种克隆中人基因组DNA位标的分布，利用统计学的手段计算染色体位标断裂分离频率便可以推出位标之间的距离和在染色体上的排列。
3.连锁分析基因定位是基于遗传学原理的统计学分析进行的。遗传图和物理图的发展为这种分析工作提供了基础，而PCR等分子生物学技术的发明以及计算机、自动测序仪等技术的使用，目前已使这一技术达到自动化的程度。
4.连锁不平衡分析[10]：来自同一祖先(IBD)的致病突变基因，在经历多代减数分裂后，与致病基因连锁的旁侧标记会因多次重组而逐渐与致病基因间趋于平衡。利用这种原理，根据单体型的改变，就可以找到与目的基因紧密连锁的标记物，从而将该基因定位。如果有足够密度的标记物来建立单体型，这一方法还可以用于在群体基础上的基因直接定位。
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三、辐射诱导基因功能鉴定
基因功能的研究应与基因的来源联系起来，与得到新基因的方法和途径结合起来。与辐射诱导相关的，可以对其进行辐射条件下的基因突变、DNA损伤的检测(单细胞凝胶电泳)、细胞凋亡(DNA ladder)等相关的表现型进行分析，大致上可以从以下几个方面进行。
1.对基因序列利用生物信息学，用特定的软件工具扫描原始序列，寻找可能的基因或ESTs。运用特定软件对基因编码蛋白进行功能与3D结构分析[11]。
2.利用基因产物进行功能研究：利用分子生物学技术进行基因的体外转录和翻译，分析产生蛋白的特性(分子量等，用放射免疫法、免疫共沉降法等找寻其上、下游作用蛋白)，或利用此融合蛋白制备其抗体，分离纯化所编码的蛋白。将重组基因利用ES细胞构建转基因动物进行蛋白功能的鉴定可以更加接近人类基因的表达情况。利用酵母双杂合系统筛选cDNA文库，可以得到与其相互作用的蛋白，通过分析此蛋白的作用，也是对目的蛋白功能的有益补充。
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3.通过抑制基因的表达分析基因功能：利用反义技术设计与基因调控区或起始翻译区互补的寡核苷酸，抑制基因表达，研究生物活性较正常情况的辐射反应改变从而确定基因功能。
4.通过基因的缺失、突变研究基因的功能：基因打靶用活细胞与染色体DNA可与外源性DNA同源序列发生同源重组的性质，定点突变基因或在实验动物中寻找它的同源基因进行“基因敲除”，观察实验动物的生物学改变从而研究基因功能。基于PCR的定点突变方法，主要是设计特定突变引物，如重叠PCR技术；还有人利用质粒为模板载体，创建了一步法重叠PCR致突变的技术。
5.研究蛋白质与特异DNA之间的相互作用：酵母单杂交系统只有待研究蛋白质具有结合启动子中的特异DNA序列活性时，报告基因才能转录[12]；在DNA与蛋白质交互作用的研究中，可应用代表性序列分析法确定其交互作用的位点；DNA亲和层析法，凝胶滞留法可用来分析与DNA相互作用的蛋白分子。
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6.用S1核酸酶方法测定蛋白基因转录起始点[13]：蛋白基因的组织特异性表达可通过Northern杂交实现；mRNA水平上基因表达的分析还可用RNA酶保护分析法，有时用免疫荧光染色、原位杂交等研究其在细胞内的表达状况；Nuclease run on array可用来证明基因的表达调控发生在转录水平。分离两种状态下的同种细胞核，用32P标记的UTP与ATP、CTP、GTP进行体外转录，降解DNA后，分离所有RNA与特异结合在膜上的DNA进行杂交，分析信号强弱，判断是否因转录不同而有不同。
基因表达的系列分析法(serial analysis of gene expression,SAGE)[14]，它用9～10 bp的序列(标签序列)代表特定基因，将它们串起来克隆测序，从而显示哪些基因在该组织中表达，并依据标签序列出现的次数显示它们表达水平的高低。2D凝胶电泳的出现、质谱仪的应用可以得到正常和辐射条件下凝胶斑点变化的情况，再进一步鉴定这些斑点可研究编码其基因的功能。
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展望人类蛋白组计划、疾病相关基因研究的展开，从DNA序列到生物学功能、从基因到基因组生物学及从基因组到蛋白质组的后基因组研究的动议被适时提出并付诸实施，推动了辐射生物学的研究；更好的研究方法、策略和技术的产生，能够更加促进人类基因组蛋白组计划的研究及辐射反应相关基因的研究，揭示细胞生长、增殖、细胞周期调控、癌变等问题的分子生物学机理，必将有利于人类的生存和发展。
参考文献
[1]Liang P,Pardee AB.Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the PCR.Science,1992,257,967-970.
[2]Lamar E E,Palmer E.Y-encoded,species-specific DNA in mice evidence that the Y chromosome exists in two polymorphic forms in inbred strains.Cell,1984,37:171.
, 百拇医药
[3]Hubank M,Schatz D G.Identifing differences in mRNA expression by representational difference analysis of cDNA.Nucleic Acids Res,1994,22:5640-5648.
[4]Stein OD,Thies W,Hofmann M.A high throughput screening for rarely transcribed differentially expressed genes.Nucleic Acids Res,1997,25:2598-2602.
[5]Ulmer JB,Donnelly JJ,Parker SE,et al.Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein.Science,1993,259:1745.
, http://www.100md.com
[6]Welsh J,Chada K,Dalal SS,et al.Arbitrarily primed PCR finger printing of RNA.Nucleic Acids Res,1992,20:4965.
[7]Patel K,Cox R,Shipley J,et al,A novel and rapid method for isolating sequences adjacent to rare cutting sites and their use in physical mapping.Nucleie Acids Res,1991,19:4371.
[8]Rommens JM,Iannuzzi MC,Kerem BS,et al,Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping.Science,1989,245:1059.
, 百拇医药
[9]Hasse A,Retzel E,Stakus K.Amplification and detection of lentiviral DNA inside cells.Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:4971.
[10]Kerem B,Johanna M,Rommens,et al.Identification of the cystic fibrosis gene:genetic analysis.Science,1989,245:1073.
[11]Schuler GD,Boguski MS,Stewart EA,et al.A gene map of the human genome.Science,1996,274:540.
[12]Inouye C,Remondelli P,karin M.Isolation of a cDNA encoding a metal response element binding protein using a novel expression cloning procedure:the one hybrid system.DNA Cell Biol,1994,13:731.
[13]Liu Xianglin,Tong Tanjun,Shao wei,et al.S1 nuclease mapping initiation site in the α-A-crystallin 616 gene.细胞生物学杂志，1996，18：141-143.
[14]Velculescu VE,Zhang lin,Vogelstein B,et al.Serial analysis of gene expression.Science,1995,270:484.
(收稿日期:1999-09-06), http://www.100md.com
单位：(100850 北京放射医学研究所)
关键词：
中华放射医学与防护杂志000636 辐射诱导基因的启动与表达引起细胞辐射反应，若DNA损伤后，细胞中的感应分子作用于辐射诱导基因或其产物，从而进行周期调控，启动损伤修复或细胞凋亡。对辐射诱导基因的研究，有利于揭示细胞辐射反应的分子生物学机理，对细胞增殖、周期调控、癌变等的研究也提供了新的途径。随着人类基因组计划的日趋完成和蛋白组计划的提出和蓬勃兴起，在辐射诱导新基因的寻找、定位及其功能研究方面涌现出了许多新技术、新方法。本文作者对近年来的一些方法和技术作一综述。
一、辐射诱导基因的寻找与识别
1.以差异显示为基础的方法：有DDRT-PCR[1]、RNA fingerprinting by arbitrorily primer PCR (RAP)、Two-Step RAP、cDNA消减杂交[2]、代表性差别筛选法(RDA)[3]等，用来检测表达上变化的基因。抑制消减杂交法(SSH)[4]是新近发展起来的高效快速的寻找差异基因的新方法，具有平衡差异显示和高效减数杂交的优点。我们目前利用这种方法在辐射细胞的cDNA两端接上不同接头，经过两轮杂交、两轮PCR扩增，这时只有两端带有不同接头的差异片段才能指数性扩增，克隆了低剂量辐射诱导的EST库，从而获得辐射诱导表达的差异EST库。
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2.由基因产物入手，酵母双杂交[5]系统的提出和发展，可用于寻找未知辐射诱导蛋白的基因。跨种序列同源性[6]，利用基因特点，用可与别种DNA杂交的克隆常含有编码序列，来克隆辐射相关基因；寻找CpG岛[7]的方法，利用CpG岛附近多存在功能基因的特点，以其两侧的DNA序列为探针筛选cDNA文库或作Northern杂交来获取基因。
3.用复杂的探针筛选cDNA文库、Northern杂交法[8]、杂交筛选法可从特定的基因组区域中寻找基因。DNA chip的发展可将全部cDNA集中在一块1 cm2的芯片上，杂交信号用计算机自动处理可提高效率。
4.显微切割法：如果知道目的基因的染色体定位以及有显微镜切割仪可用它克隆特定染色体区域的基因。
5.采用定位候选策略对辐射诱导基因定位后分析其与辐射效应的关系，找出候选基因，再进一步筛选出辐射诱导基因。
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二、基因定位
人类基因组遗传图、物理遗传图的顺利完成为分离和鉴定单个基因或某些感兴趣的基因片段及基因定位打下基础，各种遗传标记物系统的相继出现，则是这些方法在技术上得以发展的关键。
目前有3代DNA标记物系统：RFLPs,VNTRs(Variable Number of Tandem Repeats),SPN(single nucletide polymorphysms)。
目前基因定位的原理和方法主要有下述几种。
1.原位杂交：利用探针作染色体原位杂交，从而确定某一基因或DNA序列与染色体上可见界标之间的相对位置和距离，由于染色体显带等技术条件的限制，分辨力相对较低。原位PCR是结合了原位杂交和PCR技术建立起来的基因定位方法，可进行定性、定位及相对定量分析，比原位杂交敏感而专一[9]。
, http://www.100md.com
2.放射杂交法：利用高剂量的X射线将候选染色体打断成若干片段，再与仓鼠细胞形成杂交克隆，基于人类染色体上的位标相距越近其断裂频率越低的原理，通过Southern杂交和PCR方法研究杂种克隆中人基因组DNA位标的分布，利用统计学的手段计算染色体位标断裂分离频率便可以推出位标之间的距离和在染色体上的排列。
3.连锁分析基因定位是基于遗传学原理的统计学分析进行的。遗传图和物理图的发展为这种分析工作提供了基础，而PCR等分子生物学技术的发明以及计算机、自动测序仪等技术的使用，目前已使这一技术达到自动化的程度。
4.连锁不平衡分析[10]：来自同一祖先(IBD)的致病突变基因，在经历多代减数分裂后，与致病基因连锁的旁侧标记会因多次重组而逐渐与致病基因间趋于平衡。利用这种原理，根据单体型的改变，就可以找到与目的基因紧密连锁的标记物，从而将该基因定位。如果有足够密度的标记物来建立单体型，这一方法还可以用于在群体基础上的基因直接定位。
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三、辐射诱导基因功能鉴定
基因功能的研究应与基因的来源联系起来，与得到新基因的方法和途径结合起来。与辐射诱导相关的，可以对其进行辐射条件下的基因突变、DNA损伤的检测(单细胞凝胶电泳)、细胞凋亡(DNA ladder)等相关的表现型进行分析，大致上可以从以下几个方面进行。
1.对基因序列利用生物信息学，用特定的软件工具扫描原始序列，寻找可能的基因或ESTs。运用特定软件对基因编码蛋白进行功能与3D结构分析[11]。
2.利用基因产物进行功能研究：利用分子生物学技术进行基因的体外转录和翻译，分析产生蛋白的特性(分子量等，用放射免疫法、免疫共沉降法等找寻其上、下游作用蛋白)，或利用此融合蛋白制备其抗体，分离纯化所编码的蛋白。将重组基因利用ES细胞构建转基因动物进行蛋白功能的鉴定可以更加接近人类基因的表达情况。利用酵母双杂合系统筛选cDNA文库，可以得到与其相互作用的蛋白，通过分析此蛋白的作用，也是对目的蛋白功能的有益补充。
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3.通过抑制基因的表达分析基因功能：利用反义技术设计与基因调控区或起始翻译区互补的寡核苷酸，抑制基因表达，研究生物活性较正常情况的辐射反应改变从而确定基因功能。
4.通过基因的缺失、突变研究基因的功能：基因打靶用活细胞与染色体DNA可与外源性DNA同源序列发生同源重组的性质，定点突变基因或在实验动物中寻找它的同源基因进行“基因敲除”，观察实验动物的生物学改变从而研究基因功能。基于PCR的定点突变方法，主要是设计特定突变引物，如重叠PCR技术；还有人利用质粒为模板载体，创建了一步法重叠PCR致突变的技术。
5.研究蛋白质与特异DNA之间的相互作用：酵母单杂交系统只有待研究蛋白质具有结合启动子中的特异DNA序列活性时，报告基因才能转录[12]；在DNA与蛋白质交互作用的研究中，可应用代表性序列分析法确定其交互作用的位点；DNA亲和层析法，凝胶滞留法可用来分析与DNA相互作用的蛋白分子。
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6.用S1核酸酶方法测定蛋白基因转录起始点[13]：蛋白基因的组织特异性表达可通过Northern杂交实现；mRNA水平上基因表达的分析还可用RNA酶保护分析法，有时用免疫荧光染色、原位杂交等研究其在细胞内的表达状况；Nuclease run on array可用来证明基因的表达调控发生在转录水平。分离两种状态下的同种细胞核，用32P标记的UTP与ATP、CTP、GTP进行体外转录，降解DNA后，分离所有RNA与特异结合在膜上的DNA进行杂交，分析信号强弱，判断是否因转录不同而有不同。
基因表达的系列分析法(serial analysis of gene expression,SAGE)[14]，它用9～10 bp的序列(标签序列)代表特定基因，将它们串起来克隆测序，从而显示哪些基因在该组织中表达，并依据标签序列出现的次数显示它们表达水平的高低。2D凝胶电泳的出现、质谱仪的应用可以得到正常和辐射条件下凝胶斑点变化的情况，再进一步鉴定这些斑点可研究编码其基因的功能。
, 百拇医药
展望人类蛋白组计划、疾病相关基因研究的展开，从DNA序列到生物学功能、从基因到基因组生物学及从基因组到蛋白质组的后基因组研究的动议被适时提出并付诸实施，推动了辐射生物学的研究；更好的研究方法、策略和技术的产生，能够更加促进人类基因组蛋白组计划的研究及辐射反应相关基因的研究，揭示细胞生长、增殖、细胞周期调控、癌变等问题的分子生物学机理，必将有利于人类的生存和发展。
参考文献
[1]Liang P,Pardee AB.Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the PCR.Science,1992,257,967-970.
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[4]Stein OD,Thies W,Hofmann M.A high throughput screening for rarely transcribed differentially expressed genes.Nucleic Acids Res,1997,25:2598-2602.
[5]Ulmer JB,Donnelly JJ,Parker SE,et al.Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein.Science,1993,259:1745.
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[6]Welsh J,Chada K,Dalal SS,et al.Arbitrarily primed PCR finger printing of RNA.Nucleic Acids Res,1992,20:4965.
[7]Patel K,Cox R,Shipley J,et al,A novel and rapid method for isolating sequences adjacent to rare cutting sites and their use in physical mapping.Nucleie Acids Res,1991,19:4371.
[8]Rommens JM,Iannuzzi MC,Kerem BS,et al,Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping.Science,1989,245:1059.
, 百拇医药
[9]Hasse A,Retzel E,Stakus K.Amplification and detection of lentiviral DNA inside cells.Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:4971.
[10]Kerem B,Johanna M,Rommens,et al.Identification of the cystic fibrosis gene:genetic analysis.Science,1989,245:1073.
[11]Schuler GD,Boguski MS,Stewart EA,et al.A gene map of the human genome.Science,1996,274:540.
[12]Inouye C,Remondelli P,karin M.Isolation of a cDNA encoding a metal response element binding protein using a novel expression cloning procedure:the one hybrid system.DNA Cell Biol,1994,13:731.
[13]Liu Xianglin,Tong Tanjun,Shao wei,et al.S1 nuclease mapping initiation site in the α-A-crystallin 616 gene.细胞生物学杂志，1996，18：141-143.
[14]Velculescu VE,Zhang lin,Vogelstein B,et al.Serial analysis of gene expression.Science,1995,270:484.
(收稿日期:1999-09-06), http://www.100md.com