血小板第4因子对小鼠急性放射损伤的防护作用与机理
作者：田琼 杨岚 张发科 朱柏贵 张绍章
单位：田琼(710033 西安，第四军医大学基础部教学实验中心)；张绍章(预防医学系放射医学教研室)；张发科(预防医学系放射医学教研室)；杨岚 朱柏贵(西京医院血液科)
关键词：血小板4因子； 辐射损伤； 辐射防护
血小板第4因子对小鼠急性放射损伤 的防护作用与机理 【摘要】 目的 探讨血小板第4因子(PF4)对小鼠7.5 Gy γ射线全身照射所致急性放射损伤的防护作用及机理。方法 小鼠照射前20 h于腹腔内注射PF4两次，间隔6 h，每次剂量20～60 μg/kg。观察动物的30 d存活情况及几种造血指标。结果 30 d存活率对照组和防护组分别为0%和50%～60%(P<0.01)；防护组的CFU-GM集落形成数、骨髓细胞DNA含量、骨髓有核细胞数、脾结节形成数、脾体比、胸体比等均较照射对照组增加，经统计学处理差异有显著性(P<0.05)或有非常显著性(P<0.01)。结论 PF4对小鼠急性放射损伤有防护作用，其机理可能同它保护和促进造血功能恢复有关。
, 百拇医药
Protective effect of platelet factor 4 on acute hematopoietic radiation injury in mice and its mechanism
TIAN Qiong,YANG Lan,ZHANG Fake,et al.
(Center of Teaching & Experiments,Fourth Military Medical University,Xi'an 710033,China)
【Abstract】 Objective To investigate the protective effect and mechanism of platelet factor 4(PF4)on irradiated mice. Methods One hundred male mice were randomized to several groups and exposed whole-bodily to 7.5 Gy60Co γ-rays.The mice were treated with injections of PF4(20 μg/kg to 60 μg/kg)twice at an interval of 6 h and 20 h,after the second injection they were irradiated.The 30-day survival rated were recorded. Results The 30-day survival rate and the mean survival days,bone marrow cellularity.DNA content of bone marrow cells,number of CFU-GM on agar culture,peripheral blood cells,spleen/body weight ratio and number of spleen colonie were all significantly higher in the PF4 treated groups than in the corresponding irradiated controls (P<0.01). Conclusion PF4 has beneficial protective effect on irradiated mice.Its mechanism could be relatied to protection of hematopoietic cells and acceleration of their recovery.
, 百拇医药
【Key words】 Platelete factor 4; Radiation injury; Radioprotection
血小板第4因子(PF4)既是巨核细胞生成的抑制剂[1]，又是骨髓细胞调节的负调节因子[2]。近来有人报道[3]小鼠经PF4处理后，可减轻5-FU对造血的损伤。本文旨在用γ射线代替5-FU的作用，以探索PF4对小鼠急性放射损伤的防护作用及机理，为PF-4的临床实际应用提供依据。
材料和方法
1.动物：BALB/c 小鼠100只，雄性，体重(19～21) g，日龄70～80 d，由本校动物实验中心提供。
2.照射条件：60Co γ射线全身照射，吸收剂量7.5 Gy，吸收剂量率为1.75 Gy/min。
, 百拇医药
3.药物： PF4购自上海贝尔公司(法国)，系100 μg/ml甘氨酸缓冲液冻干品用1 ml双蒸水溶解，-20 ℃贮存，临用时用磷酸缓冲液(PBS)稀释至2.4 μg/ml。
4.方法：100只小鼠分为两个实验大组。
实验1：观察PF4对小鼠7.5 Gy γ射线照射的防护作用。小鼠40只，随机分为照射对照组、防护1、防护2和防护3组，照射前16 h和20 h各腹腔注射1次PF4，剂量按小鼠体重分别为20 μg/kg、40 μg/kg和60 μg/kg，照射对照组注射等量的PBS缓冲液。照射后30 d内，每日记录动物死亡情况，计算30 d存活率和死亡动物平均存活天数。
实验2：观察PF4对受7.5 Gy γ射线照射小鼠造血组织的保护作用。小鼠60只，随机分为正常对照组、照射对照组和防护组。防护组照射前按实验1方法注射PF4，剂量为40 μg/kg，其余两组注射等量的PBS缓冲液。照射后眼静脉取血，进行WBC、RBC和PLT计数，后处死动物，取出股骨，以1640培养液冲出细胞，检测骨髓细胞总数(cellularity)，并用紫外分光光度计测定其DNA含量(A)，以双层琼脂培养法测定粒-巨嗜细胞系统集落形成数(CFU-GM)；取脾脏和胸腺称重，计算脾体比(spleen vs body weight ratio)和胸体比(thymus vs body weight ratio)，并将脾脏浸泡在Bouin氏液中24 h，观察脾结节形成数(spleen colony count)。
, 百拇医药
5.统计处理：数据以
±s表示，显著性差异采用χ2检验或小样本t检验。
结 果
1.对受照射小鼠存活的影响：实验结果表明：PF4能显著地提高受照小鼠的30 d存活率(P<0.01)，并延长了死亡动物的存活时间(表1)。
表1 PF4对小鼠受7.5 Gy γ射线照射
后30 d存活的影响(±s)
, http://www.100md.com
组别
动物存活数
动物存活率
(%)
平均存活时间
(d)
照射对照
0
0
12.2±6.5
防护：1组
5
50
, http://www.100md.com
18.0±4.8**
2组
6
60
15.0±3.4**
3组
6
60
14.5±6.6**
注：防护组与对照组比，**P<0.01
2.PF4对受照射小鼠造血的保护作用，结果见表2～表4。
, 百拇医药
表2 PF4对小鼠受7.5 Gy γ射线
照射后8 d股骨骨髓细胞的影响
组别
骨髓细胞
总数/106
骨髓细胞DNA
含量(A)
CFU-GM
集落/102
正常对照
18.87±2.14
, http://www.100md.com 0.895±0.260
170.65±47.18
照射对照
0.78±0.21
0.176±0.136
0.67±0.08
防护
2.85±1.94**
0.280±0.144**
20.46±1.84**
注：与照射对照组比，**P<0.01
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表2表明：PF4能非常有效地增加骨髓有核细胞数、骨髓细胞DNA含量和CFU-GM集落形成率(P<0.01)。
表3表明PF4能非常显著地增加脾结节数和脾体比(P<0.01)，显著地增加胸体比(P<0.05)。
表4表明PF4能使白细胞和血小板轻度增加，但与照射对照组相比，差异无显著性(P>0.05)，红细胞没有改变。
表3 PF4对小鼠受7.5 Gy γ射线照射
后8 d某些造血指标的影响
组别
胸体比
脾体比
脾结节数
, http://www.100md.com
正常对照
0.0017±0.0003
0.0039±0.0007
—
照射对照
0.0006±0.0001
0.0012±0.0001
0.73±0.32
防护
0.0013±0.0003*
0.0018±0.0001**
, http://www.100md.com
3.13±0.55**
注：与照射对照组比，*P<0.05 **P<0.01表4 PF4对小鼠受7.5 Gy γ
射线照射后8 d外周血象的影响
组别
WBC计数 /109.L-1
RBC计数/
1012.L-1
PLT计数
/109.L-1
, 百拇医药
正常对照
6.76±2.50
9.78±2.05
782.49±222.92
照射对照
2.99±4.35
9.66±0.52
79.10±81.80
防护
3.08±4.15
9.54±0.58
98.60±83.90
, http://www.100md.com
讨 论
1.PF4对小鼠的辐射防护作用。PF4是一个重要的巨核细胞/血小板特异α颗粒蛋白。近来有人报道[2]PF4是巨核细胞产生的负性自我调节剂，对化疗制剂的造血损伤有保护作用。据此，我们设想PF4为人体自身所具有物质，如果其对γ射线具有一定的防护作用，对造血组织具有一定保护效应，其理论和实际应用价值将是非常有意义的。
我们在实验中发现：小鼠受7.5 Gy γ射线全身照射前20 h于腹腔注射2次PF4，每次间隔6 h，剂量为20、40、60 μg/kg体重，3个剂量组分别提高动物30 d存活率50%和60%(P<0.01)，并能延长死亡动物存活时间，但因给药剂量点和动物数尚少，未观察到药物与防护间的量效关系。何者是PF4的最佳剂量、注射次数?仍需进一步研究。
2.PF4对小鼠的辐射防护作用的机理。小鼠受7.5 Gy照射后8 d，检测与造血有关的指标，包括CFU-GM集落形成数、骨髓细胞DNA含量、骨髓有核细胞数、脾结节形成数、脾体比、胸体比和外周血细胞数等均明显减少；而照射前20 h于腹腔注射2次PF4，每次间隔6 h，剂量为40 μg/kg体重，防护组的动物除外周血象变化不明显外，上述其它指标均明显增加，与照射对照组比较差异有显著性(P<0.05)或有非常显著性(P<0.01)，提示PF4对小鼠辐射防护作用的机理可能与它对保护和促进造血功能的恢复有关。已知细胞表面受体c-kit与干细胞因子(SCF)对维持血细胞的生成有重要的作用。文献报道[4]PF4抑制巨核细胞生成的机理可能是通过c-kit/SCF而产生。PF4是造血生长负性调节因子[2]，对造血细胞有可逆的抑制作用，能一过性降低造血细胞对化疗药物的敏感性，从而发挥它对“细胞毒”的造血保护作用[5]，其有关机理有待进一步深入研究。
, 百拇医药
由于辐射防护剂平时和战时可用于预防辐射损伤，还可用于宇航人员预防太空的宇宙射线伤害和减轻肿瘤放化疗的副作用，因此自40年代以来进行了大量的研究，但迄今在实际应用方面仍无理想的药物[6]，而PF4在血循环中自然存在，其血浆含量很低，有可能成为潜在的辐射防护药。
参考文献
[1]Han ZC,Sensebe L,Abgrall F,et al.Platelet factor 4 inhibits human megakaryocytopoietic in vitro.Blood,1991,75:1234-1239.
[2]Lecomte RL,Alemany M,Sequial LG, et al.New insights into the negative regulation of hematopoiesis by chemokine platelet factor 4 and related peptides.Blood,1998,91:2772-2780.
, 百拇医药
[3]Aidoudi S,Guigon M,Lebeurier I,et al.In vivo effect of platelet factor 4(PF4)and tetrapeptide AcSDKP on haemopoiesis of mice treated with 5-fluorouracil.Br J haemato,1996,94:443-448.
[4]顾学范，奚晓东，Jacqes PC,等.血小板第4因子抑制巨核细胞系膜结合型c-kit的表达.实验血液学杂志，1997，5：199-201.
[5]Aidoudi S,Lebeurier I,Amiral J,et al.A 13～14 terminal poptide related to PF4 accaleratic recovery of progenitor cells in vivo in mice treated with 5-fluorouracil.Int J haematol,1997,435-444.
[6]夏寿萱主编.放射生物学.北京：军事医学科学出版社，1998.261-263.
(收稿日期:1999-11-30), 百拇医药
单位：田琼(710033 西安，第四军医大学基础部教学实验中心)；张绍章(预防医学系放射医学教研室)；张发科(预防医学系放射医学教研室)；杨岚 朱柏贵(西京医院血液科)
关键词：血小板4因子； 辐射损伤； 辐射防护
血小板第4因子对小鼠急性放射损伤 的防护作用与机理 【摘要】 目的 探讨血小板第4因子(PF4)对小鼠7.5 Gy γ射线全身照射所致急性放射损伤的防护作用及机理。方法 小鼠照射前20 h于腹腔内注射PF4两次，间隔6 h，每次剂量20～60 μg/kg。观察动物的30 d存活情况及几种造血指标。结果 30 d存活率对照组和防护组分别为0%和50%～60%(P<0.01)；防护组的CFU-GM集落形成数、骨髓细胞DNA含量、骨髓有核细胞数、脾结节形成数、脾体比、胸体比等均较照射对照组增加，经统计学处理差异有显著性(P<0.05)或有非常显著性(P<0.01)。结论 PF4对小鼠急性放射损伤有防护作用，其机理可能同它保护和促进造血功能恢复有关。
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Protective effect of platelet factor 4 on acute hematopoietic radiation injury in mice and its mechanism
TIAN Qiong,YANG Lan,ZHANG Fake,et al.
(Center of Teaching & Experiments,Fourth Military Medical University,Xi'an 710033,China)
【Abstract】 Objective To investigate the protective effect and mechanism of platelet factor 4(PF4)on irradiated mice. Methods One hundred male mice were randomized to several groups and exposed whole-bodily to 7.5 Gy60Co γ-rays.The mice were treated with injections of PF4(20 μg/kg to 60 μg/kg)twice at an interval of 6 h and 20 h,after the second injection they were irradiated.The 30-day survival rated were recorded. Results The 30-day survival rate and the mean survival days,bone marrow cellularity.DNA content of bone marrow cells,number of CFU-GM on agar culture,peripheral blood cells,spleen/body weight ratio and number of spleen colonie were all significantly higher in the PF4 treated groups than in the corresponding irradiated controls (P<0.01). Conclusion PF4 has beneficial protective effect on irradiated mice.Its mechanism could be relatied to protection of hematopoietic cells and acceleration of their recovery.
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【Key words】 Platelete factor 4; Radiation injury; Radioprotection
血小板第4因子(PF4)既是巨核细胞生成的抑制剂[1]，又是骨髓细胞调节的负调节因子[2]。近来有人报道[3]小鼠经PF4处理后，可减轻5-FU对造血的损伤。本文旨在用γ射线代替5-FU的作用，以探索PF4对小鼠急性放射损伤的防护作用及机理，为PF-4的临床实际应用提供依据。
材料和方法
1.动物：BALB/c 小鼠100只，雄性，体重(19～21) g，日龄70～80 d，由本校动物实验中心提供。
2.照射条件：60Co γ射线全身照射，吸收剂量7.5 Gy，吸收剂量率为1.75 Gy/min。
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3.药物： PF4购自上海贝尔公司(法国)，系100 μg/ml甘氨酸缓冲液冻干品用1 ml双蒸水溶解，-20 ℃贮存，临用时用磷酸缓冲液(PBS)稀释至2.4 μg/ml。
4.方法：100只小鼠分为两个实验大组。
实验1：观察PF4对小鼠7.5 Gy γ射线照射的防护作用。小鼠40只，随机分为照射对照组、防护1、防护2和防护3组，照射前16 h和20 h各腹腔注射1次PF4，剂量按小鼠体重分别为20 μg/kg、40 μg/kg和60 μg/kg，照射对照组注射等量的PBS缓冲液。照射后30 d内，每日记录动物死亡情况，计算30 d存活率和死亡动物平均存活天数。
实验2：观察PF4对受7.5 Gy γ射线照射小鼠造血组织的保护作用。小鼠60只，随机分为正常对照组、照射对照组和防护组。防护组照射前按实验1方法注射PF4，剂量为40 μg/kg，其余两组注射等量的PBS缓冲液。照射后眼静脉取血，进行WBC、RBC和PLT计数，后处死动物，取出股骨，以1640培养液冲出细胞，检测骨髓细胞总数(cellularity)，并用紫外分光光度计测定其DNA含量(A)，以双层琼脂培养法测定粒-巨嗜细胞系统集落形成数(CFU-GM)；取脾脏和胸腺称重，计算脾体比(spleen vs body weight ratio)和胸体比(thymus vs body weight ratio)，并将脾脏浸泡在Bouin氏液中24 h，观察脾结节形成数(spleen colony count)。
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5.统计处理：数据以
±s表示，显著性差异采用χ2检验或小样本t检验。结 果
1.对受照射小鼠存活的影响：实验结果表明：PF4能显著地提高受照小鼠的30 d存活率(P<0.01)，并延长了死亡动物的存活时间(表1)。
表1 PF4对小鼠受7.5 Gy γ射线照射
后30 d存活的影响(
±s), http://www.100md.com
组别
动物存活数
动物存活率
(%)
平均存活时间
(d)
照射对照
0
0
12.2±6.5
防护：1组
5
50
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18.0±4.8**
2组
6
60
15.0±3.4**
3组
6
60
14.5±6.6**
注：防护组与对照组比，**P<0.01
2.PF4对受照射小鼠造血的保护作用，结果见表2～表4。
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表2 PF4对小鼠受7.5 Gy γ射线
照射后8 d股骨骨髓细胞的影响
组别
骨髓细胞
总数/106
骨髓细胞DNA
含量(A)
CFU-GM
集落/102
正常对照
18.87±2.14
, http://www.100md.com 0.895±0.260
170.65±47.18
照射对照
0.78±0.21
0.176±0.136
0.67±0.08
防护
2.85±1.94**
0.280±0.144**
20.46±1.84**
注：与照射对照组比，**P<0.01
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表2表明：PF4能非常有效地增加骨髓有核细胞数、骨髓细胞DNA含量和CFU-GM集落形成率(P<0.01)。
表3表明PF4能非常显著地增加脾结节数和脾体比(P<0.01)，显著地增加胸体比(P<0.05)。
表4表明PF4能使白细胞和血小板轻度增加，但与照射对照组相比，差异无显著性(P>0.05)，红细胞没有改变。
表3 PF4对小鼠受7.5 Gy γ射线照射
后8 d某些造血指标的影响
组别
胸体比
脾体比
脾结节数
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正常对照
0.0017±0.0003
0.0039±0.0007
—
照射对照
0.0006±0.0001
0.0012±0.0001
0.73±0.32
防护
0.0013±0.0003*
0.0018±0.0001**
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3.13±0.55**
注：与照射对照组比，*P<0.05 **P<0.01表4 PF4对小鼠受7.5 Gy γ
射线照射后8 d外周血象的影响
组别
WBC计数 /109.L-1
RBC计数/
1012.L-1
PLT计数
/109.L-1
, 百拇医药
正常对照
6.76±2.50
9.78±2.05
782.49±222.92
照射对照
2.99±4.35
9.66±0.52
79.10±81.80
防护
3.08±4.15
9.54±0.58
98.60±83.90
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1.PF4对小鼠的辐射防护作用。PF4是一个重要的巨核细胞/血小板特异α颗粒蛋白。近来有人报道[2]PF4是巨核细胞产生的负性自我调节剂，对化疗制剂的造血损伤有保护作用。据此，我们设想PF4为人体自身所具有物质，如果其对γ射线具有一定的防护作用，对造血组织具有一定保护效应，其理论和实际应用价值将是非常有意义的。
我们在实验中发现：小鼠受7.5 Gy γ射线全身照射前20 h于腹腔注射2次PF4，每次间隔6 h，剂量为20、40、60 μg/kg体重，3个剂量组分别提高动物30 d存活率50%和60%(P<0.01)，并能延长死亡动物存活时间，但因给药剂量点和动物数尚少，未观察到药物与防护间的量效关系。何者是PF4的最佳剂量、注射次数?仍需进一步研究。
2.PF4对小鼠的辐射防护作用的机理。小鼠受7.5 Gy照射后8 d，检测与造血有关的指标，包括CFU-GM集落形成数、骨髓细胞DNA含量、骨髓有核细胞数、脾结节形成数、脾体比、胸体比和外周血细胞数等均明显减少；而照射前20 h于腹腔注射2次PF4，每次间隔6 h，剂量为40 μg/kg体重，防护组的动物除外周血象变化不明显外，上述其它指标均明显增加，与照射对照组比较差异有显著性(P<0.05)或有非常显著性(P<0.01)，提示PF4对小鼠辐射防护作用的机理可能与它对保护和促进造血功能的恢复有关。已知细胞表面受体c-kit与干细胞因子(SCF)对维持血细胞的生成有重要的作用。文献报道[4]PF4抑制巨核细胞生成的机理可能是通过c-kit/SCF而产生。PF4是造血生长负性调节因子[2]，对造血细胞有可逆的抑制作用，能一过性降低造血细胞对化疗药物的敏感性，从而发挥它对“细胞毒”的造血保护作用[5]，其有关机理有待进一步深入研究。
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由于辐射防护剂平时和战时可用于预防辐射损伤，还可用于宇航人员预防太空的宇宙射线伤害和减轻肿瘤放化疗的副作用，因此自40年代以来进行了大量的研究，但迄今在实际应用方面仍无理想的药物[6]，而PF4在血循环中自然存在，其血浆含量很低，有可能成为潜在的辐射防护药。
参考文献
[1]Han ZC,Sensebe L,Abgrall F,et al.Platelet factor 4 inhibits human megakaryocytopoietic in vitro.Blood,1991,75:1234-1239.
[2]Lecomte RL,Alemany M,Sequial LG, et al.New insights into the negative regulation of hematopoiesis by chemokine platelet factor 4 and related peptides.Blood,1998,91:2772-2780.
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[3]Aidoudi S,Guigon M,Lebeurier I,et al.In vivo effect of platelet factor 4(PF4)and tetrapeptide AcSDKP on haemopoiesis of mice treated with 5-fluorouracil.Br J haemato,1996,94:443-448.
[4]顾学范，奚晓东，Jacqes PC,等.血小板第4因子抑制巨核细胞系膜结合型c-kit的表达.实验血液学杂志，1997，5：199-201.
[5]Aidoudi S,Lebeurier I,Amiral J,et al.A 13～14 terminal poptide related to PF4 accaleratic recovery of progenitor cells in vivo in mice treated with 5-fluorouracil.Int J haematol,1997,435-444.
[6]夏寿萱主编.放射生物学.北京：军事医学科学出版社，1998.261-263.
(收稿日期:1999-11-30), 百拇医药