ras-raf信号转导途径对受辐射细胞G1期阻滞的调控作用
作者：郭德煌 董波 刘农乐 文耕云 罗庆良 毛秉智
单位：郭德煌 董波 文耕云 罗庆良 毛秉智(100850 北京放射医学研究所)；刘农乐(北京基础医学研究所)
关键词：辐射； 细胞周期； 周期蛋白D1
ras 【摘要】 目的 探讨ras-raf信号转导途径在受辐射KG-1细胞中对周期的调控作用方式。方法 通过转染DN-ras阻断GM-CSF的信号传递后，瞬间转染cyclin D1，观察cyclin D1对受辐射细胞周期阻滞的影响作用。结果 转染DN-ras的受辐射KG-1细胞即使用GM-CSF刺激亦不能跳出G1期阻滞；瞬间转染cyclin D1能促进受辐射细胞跳出周期阻滞。结论 ras-raf信号转导途径通过促进周期蛋白cyclin D1的表达而对受辐射细胞周期进行调控。
The regulation of ras-raf signaling pathway on G1 phase of the irradiated cells.
, 百拇医药
GUO Dehuang,DONG Bo,LIU Nongle,et al.
(Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850,China;Institute of Basic Medicine,Beijing 100850,China)
【Abstract】 Objective To investigate the way of ras-raf signaling pathway which regulate the G1 phase in irradiated KG-1 cells. Methods Blocked the GM-CSF signaling pathway by transfected DN-ras and then momentary transfected cyclin D1 into irradiated KG-1 cells,the effects of cyclin D1 on G1 phase was examined. Results The irradiated KG-1 cells transfected DN-ras can't recover form G1 phase arrest even though the GM-CSF was given,momentary transfected cyclin D1 promote the irradiated KG-1 cells from G1 arrest. Conclusion Activation of ras-raf signaling pathway regulate the cell cycle of the irradiated KG-1 cells through promotion the expression of the cyclin D1.
, 百拇医药
【Key words】 Irradiation; Cell cycle; Cyclin D1
急性放射病和核事故病人的救护及放射治疗后对正常组织的防护是放射医学和放射生物学的重要研究内容。机体受到辐射后最严重的后果—死亡是细胞死亡的宏观表现，根据形态学改变及分子机理的不同又可把细胞死亡分为凋亡和坏死。细胞坏死一旦发生就不可逆转，只有通过细胞增殖来弥补。临床上运用细胞因子来治疗受辐射损伤的病人亦是基于它能促进细胞的增殖。因此正确地运用细胞因子促进细胞的增殖就意味着挽救机体的生命。而细胞的增殖又是由细胞周期决定的，细胞周期的顺利进行有赖于细胞在周期的转换过程中收到适当的信号刺激。ras-raf途径是最为普遍的促进细胞增殖的信号途径，细胞因子与其相应受体结合后使ras蛋白活化，活化后ras起着分子开关的作用，向胞浆中的激酶级联传递着有丝分裂的信号[1]，最终激活有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，后者激活转录因子并促使周期蛋白cyclin D1的表达[2]，cyclin D1与相应的周期蛋白激酶4，6结合成为视网膜细胞瘤蛋白(Rb)激酶使Rb磷酸化，解除了Rb对转录因子E2F的抑制作用，促使许多从G1期到S期转换及DNA复制所需基因的表达[3]。细胞周期的正常进行是由周期蛋白、周期蛋白依赖激酶及其抑制剂调节的。为了证实ras-raf信号途径对细胞周期的调控作用，本实验用ras的显性负突变(DN-ras)阻断该信号途径，观察受辐射KG-1细胞周期的阻滞情况，再用cyclin D1转染该细胞株，证实信号途径是通过对cyclin D1的调节来调控细胞周期的。
, 百拇医药
材料和方法
1.细胞、DNA及质粒载体：KG-1细胞为粒系母细胞，质粒pLXSN及pcDNA3.1由本室保存，cyclin D1由中国医学科学院基础所提供。
2.主要试剂：粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，为SANDOZ公司产品。脂质体Lipofectamine购自GIBCO-BRL公司。1640培养基及G418亦为GIBCO-BRL公司产品。碘化丙啶(PI)为Sigma公司产品。质粒小提试剂盒购自Promega公司。
3.主要仪器：流式细胞仪，美国BD公司生产。
4.实验方法：①细胞培养及照射：KG-1细胞常规培养。用60Coγ射线源照射，吸收剂量为8 Gy，剂量率为1.32 Gy/min。②质粒载体的制备：将cyclin D1克隆于pcDNA3.1载体，DN-ras克隆于pLXSN质粒载体。③DN-ras的恒定转染：将5×106 KG-1细胞重悬于2 ml无血清培养液中。10 μg质粒溶于100 μl无血清培养液，20 μl脂质体稀释于80 μl无血清培养液，合并两溶液置室温15 min，将该混合物加至细胞悬液中，培养16 h后加6 ml完全培养液继续培养48 h。G418筛选：将已转染DN-ras的细胞倍比稀释后接种于含700 μg/ml G418的半固体培养剂中，15 d左右在镜下选择适当的克隆接种于含G418的培养液中。④cyclin D1的瞬间转染：将已恒定转染DN-ras的受照射KG-1细胞进行cyclin D1的瞬间转染，具体步骤参见上述。⑤实验分组：共分成4组，对照组：单纯照射。GM-CSF组：照射后加GM-CSF刺激，GM-CSF的浓度为200 ng/ml；DN-ras组：恒定转染DN-ras后再进行照射和GM-CSF刺激。cyclin D1组：恒定转染DN-ras后再瞬间转染cyclin D1，其余处理方法同DN-ras组。⑥流式细胞仪检测细胞周期：检测时相分别为处理后6、12、24、36及48 h.
, 百拇医药
5.数据处理采用χ2检验。
结果
1.转染DN-ras对受辐射KG-1细胞周期(G0/G1的影响)
KG-1细胞恒定转染含DN-ras的pLXSN质粒后进行照射，照射后同样予以GM-CSF刺激，分别于处理后6、12、24和36 h进行周期检测，结果如表1。
表1 转染DN-ras对受辐射KG-1细胞周期(G0/G1)的影响
组别
处理时间(h)
6
, 百拇医药
12
24
36
对照组
58.5±5.7
56.3±4.9
52.5±3.3
50.3±3.1
GM-CSF刺激组
58.3±6.5
53.8±5.1
48.9±2.9*
, 百拇医药
36.6±2.6**
转染DN-ras组
58.9±7.1
57.1±6.8
54.2±5.7
51.8±4.8
注：与对照组相比，*P<0.05；** P<0.01
由上表可看出正常的KG-1细胞受辐射后出现周期阻滞，经GM-CSF刺激后可跳出周期阻滞，GM-CSF作用24 h后与对照组相比差异有显著性(P<0.05)；36 h与对照组相比差异有非常显著性(P<0.01)。但KG-1细胞恒定转染DN-ras后再用GM-CSF刺激，无论刺激多长时间都不能促使受辐射KG-1细胞跳出周期阻滞。
, 百拇医药
2.瞬间转染cyclin D1对受辐射KG-1细胞周期的影响
已转染DN-ras的KG-1细胞再瞬间转染cyclin D1，照射后同样予以GM-CSF刺激，分别于处理后24、36和48 h进行周期检测，结果见图1。
图1 转染cyclin D1对受辐射
KG-1细胞周期的影响
由图1可见，转染cyclin D1有助于受辐射的KG-1细胞跳出周期阻滞，与单纯转染DN-ras组相比经统计学处理得出在转染cyclin D1 36 h后差异有显著性(P<0.05)，在48 h处差异更为显著，P<0.01。
, http://www.100md.com
讨论
适当的细胞因子可促使受辐射细胞跳出周期阻滞，加快细胞的增殖[4]。GM-CSF是一个多效的细胞因子，通过它的受体(GMR)来完成它的诸多功能，GMR的β亚单位(βc)是IL-3和IL-5受体结构中所共有的亚单位[5]。GM-CSF除了能激活ras-raf信号转导途径外，还可激活JAK-STAT途径及蛋白激酶C途径[6，7]。本实验通过转染DN-ras阻断ras-raf信号转导途径后再用GM-CSF刺激受辐射的KG-1细胞并不能使其跳出G1期阻滞，说明GM-CSF确实是通过该途径发挥作用的。瞬间转染cyclin D1后早期并无促进受辐射的KG-1细胞跳出周期阻滞，到36 h以后才显示出cyclin D1促进细胞跳出G1期阻滞的作用，48 h作用更为显著，这可能与cyclin D1蛋白表达量少，需要时间在细胞内积累到一定浓度有关。这也证实了ras-raf信号途径是通过cyclin D1而起作用的。另外值得注意的是即使转染了cyclin D1在同一时间点cyclin D1组亦不能使周期阻滞恢复到GM-CSF组，说明GM-CSF激活的信号转导途径不单纯通过ras-raf促进cyclin D1的表达这一途径，还有可能通过其他途径促使受辐射细胞跳出周期阻滞。细胞的增殖和分化是一个极其复杂和有序的过程，在这一过程中周期的调控是一个关键过程。细胞周期是受周期蛋白(cyclin)、周期蛋白依赖激酶(cdk)及其抑制剂的调节。细胞周期从G1→S→G2→M期的顺序运转中有两个关键的“检查点”，一个G1/S，一个是G2/M，有实验表明cyclin D1在G1/S过渡中起关键作用而cyclin B1在G2/M期过渡中起关键作用[8-10]，只有表达野生型p53蛋白的细胞受辐射后才发生G1期阻滞[11]，与G1期相关的周期蛋白除cyclin D1外，还有cyclin D2，cyclin D3及cyclinE，而且cdk及其抑制剂的浓度及活性的改变亦会影响G1/S的过渡。这就不难理解单纯转染cyclin D1并不足以使受辐射KG-1细胞的周期阻滞完全恢复到GM-CSF组水平。
, 百拇医药
基金项目：军事医学科学院博士后基金资助项目(20101)
参考文献
[1]Smith MR,Degudicibus SJ,Stacey T.Requirement for c-ras proteins during viral oncogene transformation.Nature,1986,320:540-543.
[2]Albanese C,Johnson J,Watanabe G,et al.Transforming p21 ras mutants and c-ETS-2 activate the cyclin D1 promoter through distinguishable regions.J Biol Chem,1995,270:23589-23597.
[3]Nevins JR.E2F:a link between the Rb tumor suppressor protein and viral oncoproteins.Science,1992,258:424-429.
, 百拇医药
[4]Chao JR,Wang JM,Lee SF.Mcl-l is an immediate-early gene activated by the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF) signaling pathway and is one component of the GM-CSF viability response.Mol Cell Biol,1998,18:4883-4898.
[5]Neubauer H,Cumano A,Muller M,et al.Jak2 deficiency defines an essential developmental checkpoint in definitive hematopoiesis.Cell,1998,93:397-409.
[6]Hayakawa F,Towatari M,Iida H,et al.Differential constitutive activation between STAT-related proteins and MAP Kinase in primary acute myelogenous leukaemia.B J Haematol,1998,101:521-528.
, 百拇医药
[7]Mary LK,Yan T, Rosensweig N,et al.Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor rescues TF-1 leukemia cells from ionizing radiation-induced apoptosis through a pathway mediated by protein kinase Cα.Blood,1998,92:416-424.
[8]Hendrik G,Julian D.Multiple Ras effector pathways contribute to G1 cell cycle progression.J Biol Chem.1999,274:22033-22040
[9]Hitomi M,Stacey DW.Cellular Ras and cyclin D1 are required during different cell cycle periods in cyclin NIH 3T3 cells.Mol cell Biol,1999,19:4623-4632.
, 百拇医药
[10]Aktas H,Cai Hong,Cooper GM.Ras links growth factor signaling to the cell cycle machinery via regulation of cyclin D1and cdk inhibitor P27KIPI.Mol cell Biol,1997,17:3850-3857.
[11]Arlene Hwang,Ruth JM.Radiation and the G2 phase of the cell cycle.Rad Res,1998,150(Suppl.):S52-S59.
(收稿日期:2000-04-04), 百拇医药
单位：郭德煌 董波 文耕云 罗庆良 毛秉智(100850 北京放射医学研究所)；刘农乐(北京基础医学研究所)
关键词：辐射； 细胞周期； 周期蛋白D1
ras 【摘要】 目的 探讨ras-raf信号转导途径在受辐射KG-1细胞中对周期的调控作用方式。方法 通过转染DN-ras阻断GM-CSF的信号传递后，瞬间转染cyclin D1，观察cyclin D1对受辐射细胞周期阻滞的影响作用。结果 转染DN-ras的受辐射KG-1细胞即使用GM-CSF刺激亦不能跳出G1期阻滞；瞬间转染cyclin D1能促进受辐射细胞跳出周期阻滞。结论 ras-raf信号转导途径通过促进周期蛋白cyclin D1的表达而对受辐射细胞周期进行调控。
The regulation of ras-raf signaling pathway on G1 phase of the irradiated cells.
, 百拇医药
GUO Dehuang,DONG Bo,LIU Nongle,et al.
(Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850,China;Institute of Basic Medicine,Beijing 100850,China)
【Abstract】 Objective To investigate the way of ras-raf signaling pathway which regulate the G1 phase in irradiated KG-1 cells. Methods Blocked the GM-CSF signaling pathway by transfected DN-ras and then momentary transfected cyclin D1 into irradiated KG-1 cells,the effects of cyclin D1 on G1 phase was examined. Results The irradiated KG-1 cells transfected DN-ras can't recover form G1 phase arrest even though the GM-CSF was given,momentary transfected cyclin D1 promote the irradiated KG-1 cells from G1 arrest. Conclusion Activation of ras-raf signaling pathway regulate the cell cycle of the irradiated KG-1 cells through promotion the expression of the cyclin D1.
, 百拇医药
【Key words】 Irradiation; Cell cycle; Cyclin D1
急性放射病和核事故病人的救护及放射治疗后对正常组织的防护是放射医学和放射生物学的重要研究内容。机体受到辐射后最严重的后果—死亡是细胞死亡的宏观表现，根据形态学改变及分子机理的不同又可把细胞死亡分为凋亡和坏死。细胞坏死一旦发生就不可逆转，只有通过细胞增殖来弥补。临床上运用细胞因子来治疗受辐射损伤的病人亦是基于它能促进细胞的增殖。因此正确地运用细胞因子促进细胞的增殖就意味着挽救机体的生命。而细胞的增殖又是由细胞周期决定的，细胞周期的顺利进行有赖于细胞在周期的转换过程中收到适当的信号刺激。ras-raf途径是最为普遍的促进细胞增殖的信号途径，细胞因子与其相应受体结合后使ras蛋白活化，活化后ras起着分子开关的作用，向胞浆中的激酶级联传递着有丝分裂的信号[1]，最终激活有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，后者激活转录因子并促使周期蛋白cyclin D1的表达[2]，cyclin D1与相应的周期蛋白激酶4，6结合成为视网膜细胞瘤蛋白(Rb)激酶使Rb磷酸化，解除了Rb对转录因子E2F的抑制作用，促使许多从G1期到S期转换及DNA复制所需基因的表达[3]。细胞周期的正常进行是由周期蛋白、周期蛋白依赖激酶及其抑制剂调节的。为了证实ras-raf信号途径对细胞周期的调控作用，本实验用ras的显性负突变(DN-ras)阻断该信号途径，观察受辐射KG-1细胞周期的阻滞情况，再用cyclin D1转染该细胞株，证实信号途径是通过对cyclin D1的调节来调控细胞周期的。
, 百拇医药
材料和方法
1.细胞、DNA及质粒载体：KG-1细胞为粒系母细胞，质粒pLXSN及pcDNA3.1由本室保存，cyclin D1由中国医学科学院基础所提供。
2.主要试剂：粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，为SANDOZ公司产品。脂质体Lipofectamine购自GIBCO-BRL公司。1640培养基及G418亦为GIBCO-BRL公司产品。碘化丙啶(PI)为Sigma公司产品。质粒小提试剂盒购自Promega公司。
3.主要仪器：流式细胞仪，美国BD公司生产。
4.实验方法：①细胞培养及照射：KG-1细胞常规培养。用60Coγ射线源照射，吸收剂量为8 Gy，剂量率为1.32 Gy/min。②质粒载体的制备：将cyclin D1克隆于pcDNA3.1载体，DN-ras克隆于pLXSN质粒载体。③DN-ras的恒定转染：将5×106 KG-1细胞重悬于2 ml无血清培养液中。10 μg质粒溶于100 μl无血清培养液，20 μl脂质体稀释于80 μl无血清培养液，合并两溶液置室温15 min，将该混合物加至细胞悬液中，培养16 h后加6 ml完全培养液继续培养48 h。G418筛选：将已转染DN-ras的细胞倍比稀释后接种于含700 μg/ml G418的半固体培养剂中，15 d左右在镜下选择适当的克隆接种于含G418的培养液中。④cyclin D1的瞬间转染：将已恒定转染DN-ras的受照射KG-1细胞进行cyclin D1的瞬间转染，具体步骤参见上述。⑤实验分组：共分成4组，对照组：单纯照射。GM-CSF组：照射后加GM-CSF刺激，GM-CSF的浓度为200 ng/ml；DN-ras组：恒定转染DN-ras后再进行照射和GM-CSF刺激。cyclin D1组：恒定转染DN-ras后再瞬间转染cyclin D1，其余处理方法同DN-ras组。⑥流式细胞仪检测细胞周期：检测时相分别为处理后6、12、24、36及48 h.
, 百拇医药
5.数据处理采用χ2检验。
结果
1.转染DN-ras对受辐射KG-1细胞周期(G0/G1的影响)
KG-1细胞恒定转染含DN-ras的pLXSN质粒后进行照射，照射后同样予以GM-CSF刺激，分别于处理后6、12、24和36 h进行周期检测，结果如表1。
表1 转染DN-ras对受辐射KG-1细胞周期(G0/G1)的影响
组别
处理时间(h)
6
, 百拇医药
12
24
36
对照组
58.5±5.7
56.3±4.9
52.5±3.3
50.3±3.1
GM-CSF刺激组
58.3±6.5
53.8±5.1
48.9±2.9*
, 百拇医药
36.6±2.6**
转染DN-ras组
58.9±7.1
57.1±6.8
54.2±5.7
51.8±4.8
注：与对照组相比，*P<0.05；** P<0.01
由上表可看出正常的KG-1细胞受辐射后出现周期阻滞，经GM-CSF刺激后可跳出周期阻滞，GM-CSF作用24 h后与对照组相比差异有显著性(P<0.05)；36 h与对照组相比差异有非常显著性(P<0.01)。但KG-1细胞恒定转染DN-ras后再用GM-CSF刺激，无论刺激多长时间都不能促使受辐射KG-1细胞跳出周期阻滞。
, 百拇医药
2.瞬间转染cyclin D1对受辐射KG-1细胞周期的影响
已转染DN-ras的KG-1细胞再瞬间转染cyclin D1，照射后同样予以GM-CSF刺激，分别于处理后24、36和48 h进行周期检测，结果见图1。
图1 转染cyclin D1对受辐射
KG-1细胞周期的影响
由图1可见，转染cyclin D1有助于受辐射的KG-1细胞跳出周期阻滞，与单纯转染DN-ras组相比经统计学处理得出在转染cyclin D1 36 h后差异有显著性(P<0.05)，在48 h处差异更为显著，P<0.01。
, http://www.100md.com
讨论
适当的细胞因子可促使受辐射细胞跳出周期阻滞，加快细胞的增殖[4]。GM-CSF是一个多效的细胞因子，通过它的受体(GMR)来完成它的诸多功能，GMR的β亚单位(βc)是IL-3和IL-5受体结构中所共有的亚单位[5]。GM-CSF除了能激活ras-raf信号转导途径外，还可激活JAK-STAT途径及蛋白激酶C途径[6，7]。本实验通过转染DN-ras阻断ras-raf信号转导途径后再用GM-CSF刺激受辐射的KG-1细胞并不能使其跳出G1期阻滞，说明GM-CSF确实是通过该途径发挥作用的。瞬间转染cyclin D1后早期并无促进受辐射的KG-1细胞跳出周期阻滞，到36 h以后才显示出cyclin D1促进细胞跳出G1期阻滞的作用，48 h作用更为显著，这可能与cyclin D1蛋白表达量少，需要时间在细胞内积累到一定浓度有关。这也证实了ras-raf信号途径是通过cyclin D1而起作用的。另外值得注意的是即使转染了cyclin D1在同一时间点cyclin D1组亦不能使周期阻滞恢复到GM-CSF组，说明GM-CSF激活的信号转导途径不单纯通过ras-raf促进cyclin D1的表达这一途径，还有可能通过其他途径促使受辐射细胞跳出周期阻滞。细胞的增殖和分化是一个极其复杂和有序的过程，在这一过程中周期的调控是一个关键过程。细胞周期是受周期蛋白(cyclin)、周期蛋白依赖激酶(cdk)及其抑制剂的调节。细胞周期从G1→S→G2→M期的顺序运转中有两个关键的“检查点”，一个G1/S，一个是G2/M，有实验表明cyclin D1在G1/S过渡中起关键作用而cyclin B1在G2/M期过渡中起关键作用[8-10]，只有表达野生型p53蛋白的细胞受辐射后才发生G1期阻滞[11]，与G1期相关的周期蛋白除cyclin D1外，还有cyclin D2，cyclin D3及cyclinE，而且cdk及其抑制剂的浓度及活性的改变亦会影响G1/S的过渡。这就不难理解单纯转染cyclin D1并不足以使受辐射KG-1细胞的周期阻滞完全恢复到GM-CSF组水平。
, 百拇医药
基金项目：军事医学科学院博士后基金资助项目(20101)
参考文献
[1]Smith MR,Degudicibus SJ,Stacey T.Requirement for c-ras proteins during viral oncogene transformation.Nature,1986,320:540-543.
[2]Albanese C,Johnson J,Watanabe G,et al.Transforming p21 ras mutants and c-ETS-2 activate the cyclin D1 promoter through distinguishable regions.J Biol Chem,1995,270:23589-23597.
[3]Nevins JR.E2F:a link between the Rb tumor suppressor protein and viral oncoproteins.Science,1992,258:424-429.
, 百拇医药
[4]Chao JR,Wang JM,Lee SF.Mcl-l is an immediate-early gene activated by the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF) signaling pathway and is one component of the GM-CSF viability response.Mol Cell Biol,1998,18:4883-4898.
[5]Neubauer H,Cumano A,Muller M,et al.Jak2 deficiency defines an essential developmental checkpoint in definitive hematopoiesis.Cell,1998,93:397-409.
[6]Hayakawa F,Towatari M,Iida H,et al.Differential constitutive activation between STAT-related proteins and MAP Kinase in primary acute myelogenous leukaemia.B J Haematol,1998,101:521-528.
, 百拇医药
[7]Mary LK,Yan T, Rosensweig N,et al.Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor rescues TF-1 leukemia cells from ionizing radiation-induced apoptosis through a pathway mediated by protein kinase Cα.Blood,1998,92:416-424.
[8]Hendrik G,Julian D.Multiple Ras effector pathways contribute to G1 cell cycle progression.J Biol Chem.1999,274:22033-22040
[9]Hitomi M,Stacey DW.Cellular Ras and cyclin D1 are required during different cell cycle periods in cyclin NIH 3T3 cells.Mol cell Biol,1999,19:4623-4632.
, 百拇医药
[10]Aktas H,Cai Hong,Cooper GM.Ras links growth factor signaling to the cell cycle machinery via regulation of cyclin D1and cdk inhibitor P27KIPI.Mol cell Biol,1997,17:3850-3857.
[11]Arlene Hwang,Ruth JM.Radiation and the G2 phase of the cell cycle.Rad Res,1998,150(Suppl.):S52-S59.
(收稿日期:2000-04-04), 百拇医药