γ射线照射对平滑肌细胞增殖及凋亡的影响
作者：贾光宏 马业新 于世英
单位：(430030 武汉，同济医科大学同济医院肿瘤科)
关键词：放射线； 平滑肌； 凋亡； 增殖
中华放射医学与防护杂志000607 【摘要】 目的 探讨近距离腔内放射治疗预防血管成行术后再狭窄的机理。方法 培养的动脉平滑肌细胞分别接受吸收剂量为3.5、7.0、14和28 Gy 60Co γ 射线照射，12 h后以流式细胞仪检测细胞各周期百分率及凋亡率。结果 吸收剂量为3.5、7.0、14和28 Gy组的G0～G1期细胞数分别占细胞总数的58.13%、83.6%、88.79%、89.15%，与对照组(56.29%)相比，7.0、14、28 Gy组差异有非常显著性(P<0.01)；而3.5 Gy组差异无显著性(P>0.05)；照射各组细胞凋亡率分别为0.85%、1.04%、10.38%、16.00%，与对照组(0.84%)相比，14、28 Gy组差异有非常显著性(P<0.01)。结论 3.5 Gy 60Co γ射线照射对血管平滑肌细胞的增殖和凋亡均无影响，7 Gy能抑制细胞增殖，但对细胞凋亡无显著影响，而14和28 Gy既能抑制细胞增殖，又能诱导细胞凋亡。
, 百拇医药
Effect of γ-radiation on proliferation and apoptosis of smooth muscle cells
JIA Guanghong, MA Yexin, YU Shiying, et al.
(Department of Cardiology,Tongji Hospital of Tongji Medical University,Wuhan 430030,China)
【Abstract】 Objective To study the molecular mechanism of endovascular brachyterapy to reduce restenosis after coronary artery balloon angioplasty. Methods The cultured vascular smooth muscle cells (VSMC) were irradiated with 3.5,7,14,28 Gy 60Co γ-rays, respectively. The cell cycle and apoptosis of smooth muscle cells (SMC)were determined by flow cytometry at 12 h after brachytherapy. Results The percentages of G0-G1 phases were 58.13%,83.6%,88.79% and 89.15%, respectively in irradiation groups.Compared with the control group (56.29%), the proliferation of SMC was inhibited significantly by irradiation with 7,14,28 Gy 60Co γ-rays (P<0.01).The percentages of apoptosis were 0.85%,1.04%, 10.38%,16.00% in irradiation groups, respectively. Compared with the control group (0.84%), apoptosis was induced significantly by 14, 28 Gy γ-irradiation (P<0.01). Conclusion The irradiation dose of 3.5 Gy 60Co γ-rays can neither inhibit proliferatrion nor induce apoptosis of SMC, 7 Gy can inhibit proliferation, but cannot induce apoptosis, whereas 14,28 Gy can both inhibit proliferation and induce apoptosis of SMC.
, 百拇医药
【Key words】 Radiation； Smooth muscle； Apoptosis； Proliferation
自Gruentzig等首次应用经皮穿刺冠脉成形术(PTCA)以来，PTCA是治疗冠心病的有效手段，但术后6个月内有30%～50%再狭窄(RS)率从而严重影响PTCA术后的长期疗效[1]。目前预防RS方法很多，如药物干预、基因治疗、血管内支架，但结果不十分理想。近几年。国外介入工作者正利用一种新兴的技术即血管腔内放射治疗预防再狭窄，已在动物实验和临床方面作了大量工作，取得了一些令人满意的结果，但对一些机理、剂量等问题尚未明确，因此本文作者利用60Co γ射线照射动脉平滑肌细胞，观察射线对细胞增殖与凋亡的影响，以探讨射线防治PTCA术后再狭窄的机理及临床意义。
材料和方法
1.材料：M199培养基(GIBCO公司)、小牛血清(上海浦东开发区兽医站)、胰蛋白酶粉剂(Sigma)、PI(Sigma)、RNasA(Sigma)、12板孔培养板(Merk)、60Co γ放射源(本院提供)、流式细胞仪(美国BD公司)。
, 百拇医药
2.细胞培养：猪主动脉平滑肌细胞的培养采用1 mm2组织块贴壁法自原代细胞开始培养，置入20%小牛血清的M199培养基中，在37℃，体积分数为5%的CO2培养箱中培养。待细胞呈现长棱形，典型的峰、谷状重叠生长及α-actin鉴定确认为平滑肌细胞后，取生长良好的第4代细胞用于实验。
表1 不同剂量γ射线照射平滑肌细胞的细胞周期率和细胞凋亡率 受照剂量
(Gy)
细胞周期率(%)
细胞凋亡率
(%)
G0～G1
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S期
G2/M
对照组
56.29±2.71
33.06±1.77
10.49±0.98
0.84±0.18
3.5
58.13±1.29
31.74±0.68
10.28±0.59
0.85±0.37
, 百拇医药
7
83.60±2.25
7.23±2.49
9.53±0.99
1.04±0.41
14
88.79±3.34＃
2.50±1.19＃
9.32±0.39
10.38±0.72
, http://www.100md.com 28
89.15±6.34＃
1.55±0.55＃
9.26±0.66
16.00±2.55△
注：各照射组与对照组比*P<0.01；14、28 Gy组与7 Gy组比＃P<0.05；28 Gy组与14 Gy组比△P<0.01 3.射线照射及流式细胞仪测定：主动脉SMC以5×104/ml接种于12孔板中，置CO2培养箱中孵育48 h，细胞进入指数生长期后，分别接受吸收剂量3.5、7.0、14、28 Gy60Co γ射线照射，然后在12 h用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，并用70%的乙醇固定。收集标本完毕后，离心弃除乙醇，加入RNaseA酶溶液消化RNA，PI液(50 μg/ml)行DNA染色，最后通过流式细胞仪检测细胞各周期百分率和凋亡率。
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4.统计处理：样本均数(
±s)以SNK检验法检验差异显著性。通过SAS软件包进行统计分析，双侧检验(P<0.05)有统计意义。
结 果
1. γ射线对细胞周期分布的影响，见表1。
从表1看出在G0～G1和S期细胞百分数3.5 Gy组与对照组之间差异无显著性，而自7 Gy组开始后几个剂量组与对照组比差异都有显著性(P<0.01)，14和28 Gy组分别与7 Gy组相比差异有显著性，但14与28 Gy组之间差异无显著性(P>0.05)。说明3.5 Gy不能有效阻滞SMC增殖，而7、14和28 Gy均能抑制SMC增殖，使细胞停滞于G0～G1期，S期合成减少。从表1看出不同剂量γ射线对G2/M细胞影响与对照组相比差异无显著性，说明射线对G2/M细胞无阻滞作用。
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2. γ射线对SMC凋亡的影响
从表1看出3.5、7 Gy组分别与对照组比较细胞凋亡率差异无显著性(P>0.05)，14和28 Gy组与对照组相比差异有显著性(P<0.01)。14与28 Gy组相比差异也有显著性(P<0.01)，说明14和28 Gy均能有效诱导凋亡，且有剂量依赖性。
讨 论
再狭窄是术后血管弹性回缩，损伤血管的挛缩，血栓形成，平滑肌细胞增生所致[2]。现在的研究已深入到分子水平，认为主要是由于某些因素激活了一些原癌基因和抗癌基因结果导致平滑肌细胞增生，细胞凋亡受抑制从而导致再狭窄[3]。Isner[4]等研究发现再狭窄的内膜下组织中细胞增殖越明显，细胞的凋亡率越高，即细胞凋亡和细胞增殖处于一个动态平衡，在PTCA后RS形成可能是这种平衡被破坏，细胞死亡数低于增生数所致。而这原因可能是p53基因表达受抑制，bcl-2基因过度表达引起的。
, 百拇医药
本实验研究表明：60Co γ射线能抑制平滑肌细胞增殖，使细胞停滞于G0～G1期，S期合成减少，并能诱导凋亡，从而可达到预防再狭窄发生的目的。射线引起SMC G0～G1期阻滞是依靠平滑肌细胞中p53基因实现的，关系是放射线—DNA损伤—p53蛋白表达—p21蛋白表达—CDK作用受抑制—G1停滞—损伤后DNA未修复—凋亡。
本实验结果3.5 Gy不能产生细胞阻滞诱导凋亡，并随着时间推移S期合成活跃，这可能是因为SMC对射线不敏感的原因。7 Gy能产生阻滞而不出现凋亡是因为该剂量不足以引起平滑肌细胞DNA不可逆性损害，损伤后的DNA能得以修复而不致发生凋亡，修复后的细胞能继续增殖，所以7 Gy可能只延缓而不能预防RS的发生。14和28 Gy既能有效抑制增殖又能诱导凋亡，所以14和28 Gy是能够防止RS的发生，但14和28 Gy对细胞周期的影响无差异，尽管对凋亡的影响有差异，考虑较大剂量在临床中可能会引起许多副作用，所以结合临床考虑认为14 Gy是有效安全的。
, http://www.100md.com
基金项目：湖北省科委九五攻关资助项目(962P101)
参考文献
[1]Chokishi SK,Meger S,Abi-Mansour P. PTCA: ten years experience. Prog Cardiovase Dis,1987,30:147-149.
[2]Abedi A,Zachary I.Signaling mechanisms in the regulation of vascular cell migration. Cardiovasular Res,1995,30:544-556.
[3]Epstein SE,Speir E,Unger EF,et al. The basis of molecular strategies for treating coronary restenosis after angioplasty. J Am Coll Cardiol,1994,23:1278-1288.
[4]Isner JM,Kearney M. Apoptosis in human atheroscleros and restenosis. Circulation,1995,91:2703-2711.
(收稿日期:1999-09-09), http://www.100md.com
单位：(430030 武汉，同济医科大学同济医院肿瘤科)
关键词：放射线； 平滑肌； 凋亡； 增殖
中华放射医学与防护杂志000607 【摘要】 目的 探讨近距离腔内放射治疗预防血管成行术后再狭窄的机理。方法 培养的动脉平滑肌细胞分别接受吸收剂量为3.5、7.0、14和28 Gy 60Co γ 射线照射，12 h后以流式细胞仪检测细胞各周期百分率及凋亡率。结果 吸收剂量为3.5、7.0、14和28 Gy组的G0～G1期细胞数分别占细胞总数的58.13%、83.6%、88.79%、89.15%，与对照组(56.29%)相比，7.0、14、28 Gy组差异有非常显著性(P<0.01)；而3.5 Gy组差异无显著性(P>0.05)；照射各组细胞凋亡率分别为0.85%、1.04%、10.38%、16.00%，与对照组(0.84%)相比，14、28 Gy组差异有非常显著性(P<0.01)。结论 3.5 Gy 60Co γ射线照射对血管平滑肌细胞的增殖和凋亡均无影响，7 Gy能抑制细胞增殖，但对细胞凋亡无显著影响，而14和28 Gy既能抑制细胞增殖，又能诱导细胞凋亡。
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Effect of γ-radiation on proliferation and apoptosis of smooth muscle cells
JIA Guanghong, MA Yexin, YU Shiying, et al.
(Department of Cardiology,Tongji Hospital of Tongji Medical University,Wuhan 430030,China)
【Abstract】 Objective To study the molecular mechanism of endovascular brachyterapy to reduce restenosis after coronary artery balloon angioplasty. Methods The cultured vascular smooth muscle cells (VSMC) were irradiated with 3.5,7,14,28 Gy 60Co γ-rays, respectively. The cell cycle and apoptosis of smooth muscle cells (SMC)were determined by flow cytometry at 12 h after brachytherapy. Results The percentages of G0-G1 phases were 58.13%,83.6%,88.79% and 89.15%, respectively in irradiation groups.Compared with the control group (56.29%), the proliferation of SMC was inhibited significantly by irradiation with 7,14,28 Gy 60Co γ-rays (P<0.01).The percentages of apoptosis were 0.85%,1.04%, 10.38%,16.00% in irradiation groups, respectively. Compared with the control group (0.84%), apoptosis was induced significantly by 14, 28 Gy γ-irradiation (P<0.01). Conclusion The irradiation dose of 3.5 Gy 60Co γ-rays can neither inhibit proliferatrion nor induce apoptosis of SMC, 7 Gy can inhibit proliferation, but cannot induce apoptosis, whereas 14,28 Gy can both inhibit proliferation and induce apoptosis of SMC.
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【Key words】 Radiation； Smooth muscle； Apoptosis； Proliferation
自Gruentzig等首次应用经皮穿刺冠脉成形术(PTCA)以来，PTCA是治疗冠心病的有效手段，但术后6个月内有30%～50%再狭窄(RS)率从而严重影响PTCA术后的长期疗效[1]。目前预防RS方法很多，如药物干预、基因治疗、血管内支架，但结果不十分理想。近几年。国外介入工作者正利用一种新兴的技术即血管腔内放射治疗预防再狭窄，已在动物实验和临床方面作了大量工作，取得了一些令人满意的结果，但对一些机理、剂量等问题尚未明确，因此本文作者利用60Co γ射线照射动脉平滑肌细胞，观察射线对细胞增殖与凋亡的影响，以探讨射线防治PTCA术后再狭窄的机理及临床意义。
材料和方法
1.材料：M199培养基(GIBCO公司)、小牛血清(上海浦东开发区兽医站)、胰蛋白酶粉剂(Sigma)、PI(Sigma)、RNasA(Sigma)、12板孔培养板(Merk)、60Co γ放射源(本院提供)、流式细胞仪(美国BD公司)。
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2.细胞培养：猪主动脉平滑肌细胞的培养采用1 mm2组织块贴壁法自原代细胞开始培养，置入20%小牛血清的M199培养基中，在37℃，体积分数为5%的CO2培养箱中培养。待细胞呈现长棱形，典型的峰、谷状重叠生长及α-actin鉴定确认为平滑肌细胞后，取生长良好的第4代细胞用于实验。
表1 不同剂量γ射线照射平滑肌细胞的细胞周期率和细胞凋亡率 受照剂量
(Gy)
细胞周期率(%)
细胞凋亡率
(%)
G0～G1
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S期
G2/M
对照组
56.29±2.71
33.06±1.77
10.49±0.98
0.84±0.18
3.5
58.13±1.29
31.74±0.68
10.28±0.59
0.85±0.37
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7
83.60±2.25
7.23±2.49
9.53±0.99
1.04±0.41
14
88.79±3.34＃
2.50±1.19＃
9.32±0.39
10.38±0.72
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89.15±6.34＃
1.55±0.55＃
9.26±0.66
16.00±2.55△
注：各照射组与对照组比*P<0.01；14、28 Gy组与7 Gy组比＃P<0.05；28 Gy组与14 Gy组比△P<0.01 3.射线照射及流式细胞仪测定：主动脉SMC以5×104/ml接种于12孔板中，置CO2培养箱中孵育48 h，细胞进入指数生长期后，分别接受吸收剂量3.5、7.0、14、28 Gy60Co γ射线照射，然后在12 h用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，并用70%的乙醇固定。收集标本完毕后，离心弃除乙醇，加入RNaseA酶溶液消化RNA，PI液(50 μg/ml)行DNA染色，最后通过流式细胞仪检测细胞各周期百分率和凋亡率。
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4.统计处理：样本均数(
±s)以SNK检验法检验差异显著性。通过SAS软件包进行统计分析，双侧检验(P<0.05)有统计意义。结 果
1. γ射线对细胞周期分布的影响，见表1。
从表1看出在G0～G1和S期细胞百分数3.5 Gy组与对照组之间差异无显著性，而自7 Gy组开始后几个剂量组与对照组比差异都有显著性(P<0.01)，14和28 Gy组分别与7 Gy组相比差异有显著性，但14与28 Gy组之间差异无显著性(P>0.05)。说明3.5 Gy不能有效阻滞SMC增殖，而7、14和28 Gy均能抑制SMC增殖，使细胞停滞于G0～G1期，S期合成减少。从表1看出不同剂量γ射线对G2/M细胞影响与对照组相比差异无显著性，说明射线对G2/M细胞无阻滞作用。
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2. γ射线对SMC凋亡的影响
从表1看出3.5、7 Gy组分别与对照组比较细胞凋亡率差异无显著性(P>0.05)，14和28 Gy组与对照组相比差异有显著性(P<0.01)。14与28 Gy组相比差异也有显著性(P<0.01)，说明14和28 Gy均能有效诱导凋亡，且有剂量依赖性。
讨 论
再狭窄是术后血管弹性回缩，损伤血管的挛缩，血栓形成，平滑肌细胞增生所致[2]。现在的研究已深入到分子水平，认为主要是由于某些因素激活了一些原癌基因和抗癌基因结果导致平滑肌细胞增生，细胞凋亡受抑制从而导致再狭窄[3]。Isner[4]等研究发现再狭窄的内膜下组织中细胞增殖越明显，细胞的凋亡率越高，即细胞凋亡和细胞增殖处于一个动态平衡，在PTCA后RS形成可能是这种平衡被破坏，细胞死亡数低于增生数所致。而这原因可能是p53基因表达受抑制，bcl-2基因过度表达引起的。
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本实验研究表明：60Co γ射线能抑制平滑肌细胞增殖，使细胞停滞于G0～G1期，S期合成减少，并能诱导凋亡，从而可达到预防再狭窄发生的目的。射线引起SMC G0～G1期阻滞是依靠平滑肌细胞中p53基因实现的，关系是放射线—DNA损伤—p53蛋白表达—p21蛋白表达—CDK作用受抑制—G1停滞—损伤后DNA未修复—凋亡。
本实验结果3.5 Gy不能产生细胞阻滞诱导凋亡，并随着时间推移S期合成活跃，这可能是因为SMC对射线不敏感的原因。7 Gy能产生阻滞而不出现凋亡是因为该剂量不足以引起平滑肌细胞DNA不可逆性损害，损伤后的DNA能得以修复而不致发生凋亡，修复后的细胞能继续增殖，所以7 Gy可能只延缓而不能预防RS的发生。14和28 Gy既能有效抑制增殖又能诱导凋亡，所以14和28 Gy是能够防止RS的发生，但14和28 Gy对细胞周期的影响无差异，尽管对凋亡的影响有差异，考虑较大剂量在临床中可能会引起许多副作用，所以结合临床考虑认为14 Gy是有效安全的。
, http://www.100md.com
基金项目：湖北省科委九五攻关资助项目(962P101)
参考文献
[1]Chokishi SK,Meger S,Abi-Mansour P. PTCA: ten years experience. Prog Cardiovase Dis,1987,30:147-149.
[2]Abedi A,Zachary I.Signaling mechanisms in the regulation of vascular cell migration. Cardiovasular Res,1995,30:544-556.
[3]Epstein SE,Speir E,Unger EF,et al. The basis of molecular strategies for treating coronary restenosis after angioplasty. J Am Coll Cardiol,1994,23:1278-1288.
[4]Isner JM,Kearney M. Apoptosis in human atheroscleros and restenosis. Circulation,1995,91:2703-2711.
(收稿日期:1999-09-09), http://www.100md.com