p21在电离辐射诱导EL-4细胞G1期阻滞中的作用
作者：傅海青 鞠桂芝 罗灿 傅士波
单位：(130021 长春，白求恩医科大学卫生部放射生物学重点实验室)
关键词：电离辐射； G1期阻滞； p21
中华放射医学与防护杂志000603 【摘要】 目的 探讨p21在电离辐射诱导EL-4细胞G1期阻滞中的作用。方法 采用Northern blot检测p21WAF1 mRNA水平的变化；采用流式细胞术检测p21蛋白表达及细胞周期的变化。结果 4.0 Gy X射线照射后12 h、24 h、48 h G1期EL-4细胞百分数明显高于假照射组；p21WAF1 mRNA水平从照射后1 h开始升高，4 h达峰值，持续至照后12 h；p21蛋白表达在照射后2～48 h明显增高。结论 4.0 Gy X射线照射可诱导EL-4细胞G1期阻滞，p21在电离辐射诱导EL-4细胞G1期阻滞中起重要作用。
, 百拇医药
The role of p21 in G1 arrest of EL-4 cells induced by ionizing radiation
FU Haiqing,JU Guizhi,LUO Can,et al.
(MH Radiobiology Research Unit,Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021,China)
【Abstract】 Objective To elucidate the role of p21 in G1 arrest of EL-4 cells induced by ionizing radiation. Methods Northern blot was used to measure p21 WAF1 mRNA level.Flow cytometry was employed to analyze p21 protein expression and cell cycle of EL-4 cells. Results Following 4.0 Gy X-irradiation,EL-4 cells in G1 phase began to significantly increase at 12 h,reached the peak at 24 h,and kept at high level till 48 h;the p21 WAF1 mRNA level began to increase at 1 h,reached the peak level at 4 h,kept the high levels till 12 h,then recovered to normal at 24 h;and the level of p21 protein expression in EI-4 cells increased significantly at 2 h to 48 h. Conclusion The results suggest that p21 might play an important role in G1 arrest of EL-4 cells induced by ionizing radiation.
, 百拇医药
【Key words】 Ionizing radiation; G1 arrest; p21
电离辐射能引起细胞周期G1期阻滞，对其基因调控及分子通路的研究是近年来放射生物学研究的重要课题之一。继Kastan等报道，γ射线诱导ML-1白血病细胞G1阻滞，伴有p53蛋白堆积[1]以来的近10年间，研究者们在此领域的研究积累了大量资料。集中研究p53及其调控的下游基因p21WAF1(以下简称WAF1基因)、GADD45及其蛋白产物，在辐射诱导G1阻滞中的作用。但对不同类型的细胞，所得结果尚有争论。本文观察了p21在辐射诱导EL-4淋巴瘤细胞G1阻滞中的作用。
材料和方法
1.细胞株：EL-4细胞株为小鼠淋巴瘤细胞，本室保存。
, 百拇医药
2.主要试剂：PI(propidium iodide，碘化丙啶，Sigma，美国)。第一抗体：p21多克隆抗体(rabbit anti-p21 Santa Cruz，美国)。第二抗体：羊抗兔IgG-FITC(Goat anti-rabbit IgG-FITC,Jackson,美国)。WAF1 cDNA质粒(美国Bert Vogelstein教授惠赠)；Random DNA Labeling Kit(Promega,美国)；[α-32P]-dCTP(北京亚辉药物医学工程公司)。
3.照射条件：Philips深部X射线治疗机，电压200 kV,电流10 mA，滤板0.5 mmCu，1.0 mmAl，靶皮距50 cm，剂量率0.287 Gy/min。观察4.0 Gy照射后不同时间，EL-4细胞周期、WAF1基因转录及p21蛋白表达的变化。同时设假照射对照组。
4.细胞周期测定：采用PI染色，FACScan流式细胞仪(美国BD公司)进行细胞周期测定。用Cellfit软件收取细胞(每份样品收取10 000个细胞)，并分析细胞周期。结果以细胞周期各时相细胞百分比表示。
, 百拇医药
5.蛋白表达测定：免疫荧光标记，FACScan流式细胞仪检测各种蛋白表达的变化。将75%冷乙醇中固定的EL-4单细胞悬液(1×106个细胞)用PBS洗涤2次，除去乙醇，每份样品加入第一抗体50 μl(1∶50稀释)，4℃反应45 min,PBS洗涤2次，加第二抗体50 μl(1∶100稀释)，4℃反应45 min，PBS洗涤2次，加PBS 500 μl进行流式细胞仪检测。每一样品均设非特异对照。即用PBS代替第一抗体，其余步骤同上。用FACScan软件收集细胞，Lysis软件分析处理数据，结果以加第一抗体细胞的平均荧光强度，减去未加第一抗体细胞的平均荧光强度，即特异性荧光强度表示。抗体均为用前新配制。
6.Northern blot:总RNA提取参见文献[2]，简述之，取2×106个细胞，PBS洗2次，去上清，弹起细胞，加入0.6 ml异硫氰酸胍裂解液，迅速混匀，加0.1体积乙酸钠(pH 4.0)，混匀，加入等体积水饱和酚，混匀，再加0.3体积CH4C13/ISA(49∶1)，充分振荡混匀后，4℃放置15 min。4℃ 12 000 rpm离心20 min，小心吸取上层水相置于另一1.5 ml离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，-20℃沉淀RNA至少30 min。4℃ 12 000 rpm离心15 min，弃上清，沉淀干燥后溶于40 μl无RNase水，紫外分光光度计测定RNA纯度及含量，-70℃贮存，待用。甲醛变性凝胶电泳、转膜、杂交、洗膜见文献[3]。采用随机引物法标记探针，详细流程见厂家说明书。用Phospherimager同位素标记激光扫描成像仪检测杂交带的平均灰度，结果以特异探针杂交带与GAPDH探针杂交带平均灰度的比值表示。
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结 果
1.4.0 Gy X射线照射诱导EL-4细胞G1阻滞
采用PI(propidium iodide,碘化丙啶)荧光探针标记，流式细胞仪检测细胞周期，观察4.0 Gy X射线照射后EL-4细胞周期的变化。结果发现，照射后12、24及48 h，G1期EL-4细胞百分数显著高于假照射组(分别P<0.05，P<0.01及P<0.01)，诱导G1阻滞。在此研究的基础上，进一步观察了4.0 Gy照射后，p21WAF1基因转录及p21蛋白表达的变化。
2.4.0 Gy X射线照射后EL-4细胞WAF1基因转录的变化
采用Northern blot法观察4.0 Gy X射线照射后1、2、4、8、12、24、48 h，EL-4细胞WAF1 mRNA水平的变化。结果表明，正常EL-4细胞中WAF1 mRNA水平很低，4.0 Gy X射线照射后EL-4细胞WAF1 mRNA水平从照射后1 h开始升高，4 h达峰值，持续至照后12 h，24 h恢复至正常水平(图1和图2)。
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图1 4.0 Gy X射线照射后EL-4细胞WAF1 mRNA水平的变化
(Northern blot图例)
3.4.0 Gy X射线照射后EL-4细胞p21蛋白表达的变化
采用免疫荧光标记，流式细胞术检测，观察4.0 Gy X射线照射后2、4、8、12、24、48 h，EL-4细胞p21蛋白表达的变化(见表1)。结果表明，4.0 Gy照射后EL-4细胞p21蛋白表达在照射后2 h开始亦显著增高，持续至照射后48 h(P<0.05，P<0.01)。
讨 论
WAF1(wide-type-p53-activated fragment 1)基因定位于染色体6p21.2上，其长度为85 kb，有3个外显子。在WAF1基因编码区上游有2个p53共有结合区[4]。因此，其转录受p53蛋白调控。WAF1基因的蛋白产物p21蛋白，为周期素依赖性蛋白激酶抑制剂，通过抑制周期素依赖性蛋白激酶活性，抑制Rb磷酸化，诱导细胞G1期阻滞。
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图2 4.0 Gy X射线照射后EL-4细胞
WAF1 mRNA水平的变化
n=3 与假照射组比*P<0.05 **P<0.01
表1 4.0 Gy X射线照射射后EL-4细胞p21蛋白
表达的变化(
±s) 照射后时间(h)
平均荧光强度
0
6.70±4.05
2
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25.84±5.38
4
23.04±4.50
8
12.32±3.81
12
18.34±1.40
24
16.04±1.96
48
13.48±3.80
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注：n=5,与0 h比较P<0.05,**P<0.01 目前对电离辐射诱导G1阻滞基因调控的研究证实，野生型p53在哺乳动物细胞G1检查点(check point)基因调控中起关键作用[5]。其机理是电离辐射作为物理性DNA损伤因子使p53基因激活，其蛋白产物p53蛋白作为转录因子(transcription factor)调控其下游基因WAF1的转录及表达[6]。作为WAF1的蛋白产物p21蛋白，抑制G1→S过渡中周期素E/蛋白激酶2复合物的形成，抑制G1→S过渡。因而，p21在辐射诱导G1期阻滞的发生中起重要作用。Bae等报道，γ射线照射诱导Burkitt's淋 巴瘤WMN细胞、成淋巴样FWL细胞及大多数人黑色素瘤细胞G1期阻滞的分子通路为p53-p21通路[7，8]。
本实验证实，4.0 Gy X射线照射后12 h～48 h，EL-4细胞发生明显的G1阻滞。同时发现，4.0 Gy照射后1 h，WAF1基因转录水平开始升高，4 h达峰值，持续至照后12 h；随着基因转录水平的升高，p21蛋白表达于照后2 h开始明显升高，持续至照后48 h。p21基因及蛋白水平的变化与EL-4细胞G1阻滞密切相关。提示，p21在辐射诱导EL-4细胞G1阻滞中起重要作用。此结果为电离辐射诱导G1阻滞的基因调控及分子通路研究，提供了新的生物学依据。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770193)
参考文献
[1]Kastan MB,Onyekwere O,Sidransky D,et al.Participation of p53 protein in the cellular response to DNA damages.Cancer Res,1991,51:6304-6311.
[2]Chomczynski P, Sacchi N.Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chlorform extraction.Anal Biochem.1987,162:150-159.
[3]Shambrook J.Molecular cloning,a laboratory manual,2nd ed.New York:CSH,1989.
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[4]Harper JW,Adami GR,Wei N,et al.The p21 cdk-interacting protein eipl is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases.Cell,1993,75:805-816.
[5]Gadbois DM,Crissman HA,Nastasi A,et al.Alterations in progression of cells through the cell cycle after exposure to α-particles or γ-rays.Radiat Res,1996,146:414-424.
[6]Chin PL,Momand J, Pfeifer GP.In vivo evident for binding of p53 to consensus binding sites in the p21 and GADD45 genes in response to ionizing radiation.Oncogene,1997,15:87-99.
, 百拇医药
[7]Bae I,Fan S,Bhatia K,et al.Relationship between G1 arrest and stability of the p53 and p21 eip1/waf1 protein following γ-irradiation of human lymphoma cells.Cancer Res,1995,55:2387-2393.
[8]Bae I,Smith MS,Zhan Q.et al.An abnormality in the p53 human melanoma lines.Cancer Res,1996,56:840-847.
(收稿日期:1999-11-12), 百拇医药
单位：(130021 长春，白求恩医科大学卫生部放射生物学重点实验室)
关键词：电离辐射； G1期阻滞； p21
中华放射医学与防护杂志000603 【摘要】 目的 探讨p21在电离辐射诱导EL-4细胞G1期阻滞中的作用。方法 采用Northern blot检测p21WAF1 mRNA水平的变化；采用流式细胞术检测p21蛋白表达及细胞周期的变化。结果 4.0 Gy X射线照射后12 h、24 h、48 h G1期EL-4细胞百分数明显高于假照射组；p21WAF1 mRNA水平从照射后1 h开始升高，4 h达峰值，持续至照后12 h；p21蛋白表达在照射后2～48 h明显增高。结论 4.0 Gy X射线照射可诱导EL-4细胞G1期阻滞，p21在电离辐射诱导EL-4细胞G1期阻滞中起重要作用。
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The role of p21 in G1 arrest of EL-4 cells induced by ionizing radiation
FU Haiqing,JU Guizhi,LUO Can,et al.
(MH Radiobiology Research Unit,Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021,China)
【Abstract】 Objective To elucidate the role of p21 in G1 arrest of EL-4 cells induced by ionizing radiation. Methods Northern blot was used to measure p21 WAF1 mRNA level.Flow cytometry was employed to analyze p21 protein expression and cell cycle of EL-4 cells. Results Following 4.0 Gy X-irradiation,EL-4 cells in G1 phase began to significantly increase at 12 h,reached the peak at 24 h,and kept at high level till 48 h;the p21 WAF1 mRNA level began to increase at 1 h,reached the peak level at 4 h,kept the high levels till 12 h,then recovered to normal at 24 h;and the level of p21 protein expression in EI-4 cells increased significantly at 2 h to 48 h. Conclusion The results suggest that p21 might play an important role in G1 arrest of EL-4 cells induced by ionizing radiation.
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【Key words】 Ionizing radiation; G1 arrest; p21
电离辐射能引起细胞周期G1期阻滞，对其基因调控及分子通路的研究是近年来放射生物学研究的重要课题之一。继Kastan等报道，γ射线诱导ML-1白血病细胞G1阻滞，伴有p53蛋白堆积[1]以来的近10年间，研究者们在此领域的研究积累了大量资料。集中研究p53及其调控的下游基因p21WAF1(以下简称WAF1基因)、GADD45及其蛋白产物，在辐射诱导G1阻滞中的作用。但对不同类型的细胞，所得结果尚有争论。本文观察了p21在辐射诱导EL-4淋巴瘤细胞G1阻滞中的作用。
材料和方法
1.细胞株：EL-4细胞株为小鼠淋巴瘤细胞，本室保存。
, 百拇医药
2.主要试剂：PI(propidium iodide，碘化丙啶，Sigma，美国)。第一抗体：p21多克隆抗体(rabbit anti-p21 Santa Cruz，美国)。第二抗体：羊抗兔IgG-FITC(Goat anti-rabbit IgG-FITC,Jackson,美国)。WAF1 cDNA质粒(美国Bert Vogelstein教授惠赠)；Random DNA Labeling Kit(Promega,美国)；[α-32P]-dCTP(北京亚辉药物医学工程公司)。
3.照射条件：Philips深部X射线治疗机，电压200 kV,电流10 mA，滤板0.5 mmCu，1.0 mmAl，靶皮距50 cm，剂量率0.287 Gy/min。观察4.0 Gy照射后不同时间，EL-4细胞周期、WAF1基因转录及p21蛋白表达的变化。同时设假照射对照组。
4.细胞周期测定：采用PI染色，FACScan流式细胞仪(美国BD公司)进行细胞周期测定。用Cellfit软件收取细胞(每份样品收取10 000个细胞)，并分析细胞周期。结果以细胞周期各时相细胞百分比表示。
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5.蛋白表达测定：免疫荧光标记，FACScan流式细胞仪检测各种蛋白表达的变化。将75%冷乙醇中固定的EL-4单细胞悬液(1×106个细胞)用PBS洗涤2次，除去乙醇，每份样品加入第一抗体50 μl(1∶50稀释)，4℃反应45 min,PBS洗涤2次，加第二抗体50 μl(1∶100稀释)，4℃反应45 min，PBS洗涤2次，加PBS 500 μl进行流式细胞仪检测。每一样品均设非特异对照。即用PBS代替第一抗体，其余步骤同上。用FACScan软件收集细胞，Lysis软件分析处理数据，结果以加第一抗体细胞的平均荧光强度，减去未加第一抗体细胞的平均荧光强度，即特异性荧光强度表示。抗体均为用前新配制。
6.Northern blot:总RNA提取参见文献[2]，简述之，取2×106个细胞，PBS洗2次，去上清，弹起细胞，加入0.6 ml异硫氰酸胍裂解液，迅速混匀，加0.1体积乙酸钠(pH 4.0)，混匀，加入等体积水饱和酚，混匀，再加0.3体积CH4C13/ISA(49∶1)，充分振荡混匀后，4℃放置15 min。4℃ 12 000 rpm离心20 min，小心吸取上层水相置于另一1.5 ml离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，-20℃沉淀RNA至少30 min。4℃ 12 000 rpm离心15 min，弃上清，沉淀干燥后溶于40 μl无RNase水，紫外分光光度计测定RNA纯度及含量，-70℃贮存，待用。甲醛变性凝胶电泳、转膜、杂交、洗膜见文献[3]。采用随机引物法标记探针，详细流程见厂家说明书。用Phospherimager同位素标记激光扫描成像仪检测杂交带的平均灰度，结果以特异探针杂交带与GAPDH探针杂交带平均灰度的比值表示。
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结 果
1.4.0 Gy X射线照射诱导EL-4细胞G1阻滞
采用PI(propidium iodide,碘化丙啶)荧光探针标记，流式细胞仪检测细胞周期，观察4.0 Gy X射线照射后EL-4细胞周期的变化。结果发现，照射后12、24及48 h，G1期EL-4细胞百分数显著高于假照射组(分别P<0.05，P<0.01及P<0.01)，诱导G1阻滞。在此研究的基础上，进一步观察了4.0 Gy照射后，p21WAF1基因转录及p21蛋白表达的变化。
2.4.0 Gy X射线照射后EL-4细胞WAF1基因转录的变化
采用Northern blot法观察4.0 Gy X射线照射后1、2、4、8、12、24、48 h，EL-4细胞WAF1 mRNA水平的变化。结果表明，正常EL-4细胞中WAF1 mRNA水平很低，4.0 Gy X射线照射后EL-4细胞WAF1 mRNA水平从照射后1 h开始升高，4 h达峰值，持续至照后12 h，24 h恢复至正常水平(图1和图2)。
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图1 4.0 Gy X射线照射后EL-4细胞WAF1 mRNA水平的变化
(Northern blot图例)
3.4.0 Gy X射线照射后EL-4细胞p21蛋白表达的变化
采用免疫荧光标记，流式细胞术检测，观察4.0 Gy X射线照射后2、4、8、12、24、48 h，EL-4细胞p21蛋白表达的变化(见表1)。结果表明，4.0 Gy照射后EL-4细胞p21蛋白表达在照射后2 h开始亦显著增高，持续至照射后48 h(P<0.05，P<0.01)。
讨 论
WAF1(wide-type-p53-activated fragment 1)基因定位于染色体6p21.2上，其长度为85 kb，有3个外显子。在WAF1基因编码区上游有2个p53共有结合区[4]。因此，其转录受p53蛋白调控。WAF1基因的蛋白产物p21蛋白，为周期素依赖性蛋白激酶抑制剂，通过抑制周期素依赖性蛋白激酶活性，抑制Rb磷酸化，诱导细胞G1期阻滞。
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图2 4.0 Gy X射线照射后EL-4细胞
WAF1 mRNA水平的变化
n=3 与假照射组比*P<0.05 **P<0.01
表1 4.0 Gy X射线照射射后EL-4细胞p21蛋白
表达的变化(
±s) 照射后时间(h)平均荧光强度
0
6.70±4.05
2
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25.84±5.38
4
23.04±4.50
8
12.32±3.81
12
18.34±1.40
24
16.04±1.96
48
13.48±3.80
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注：n=5,与0 h比较P<0.05,**P<0.01 目前对电离辐射诱导G1阻滞基因调控的研究证实，野生型p53在哺乳动物细胞G1检查点(check point)基因调控中起关键作用[5]。其机理是电离辐射作为物理性DNA损伤因子使p53基因激活，其蛋白产物p53蛋白作为转录因子(transcription factor)调控其下游基因WAF1的转录及表达[6]。作为WAF1的蛋白产物p21蛋白，抑制G1→S过渡中周期素E/蛋白激酶2复合物的形成，抑制G1→S过渡。因而，p21在辐射诱导G1期阻滞的发生中起重要作用。Bae等报道，γ射线照射诱导Burkitt's淋 巴瘤WMN细胞、成淋巴样FWL细胞及大多数人黑色素瘤细胞G1期阻滞的分子通路为p53-p21通路[7，8]。
本实验证实，4.0 Gy X射线照射后12 h～48 h，EL-4细胞发生明显的G1阻滞。同时发现，4.0 Gy照射后1 h，WAF1基因转录水平开始升高，4 h达峰值，持续至照后12 h；随着基因转录水平的升高，p21蛋白表达于照后2 h开始明显升高，持续至照后48 h。p21基因及蛋白水平的变化与EL-4细胞G1阻滞密切相关。提示，p21在辐射诱导EL-4细胞G1阻滞中起重要作用。此结果为电离辐射诱导G1阻滞的基因调控及分子通路研究，提供了新的生物学依据。
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参考文献
[1]Kastan MB,Onyekwere O,Sidransky D,et al.Participation of p53 protein in the cellular response to DNA damages.Cancer Res,1991,51:6304-6311.
[2]Chomczynski P, Sacchi N.Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chlorform extraction.Anal Biochem.1987,162:150-159.
[3]Shambrook J.Molecular cloning,a laboratory manual,2nd ed.New York:CSH,1989.
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[4]Harper JW,Adami GR,Wei N,et al.The p21 cdk-interacting protein eipl is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases.Cell,1993,75:805-816.
[5]Gadbois DM,Crissman HA,Nastasi A,et al.Alterations in progression of cells through the cell cycle after exposure to α-particles or γ-rays.Radiat Res,1996,146:414-424.
[6]Chin PL,Momand J, Pfeifer GP.In vivo evident for binding of p53 to consensus binding sites in the p21 and GADD45 genes in response to ionizing radiation.Oncogene,1997,15:87-99.
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[7]Bae I,Fan S,Bhatia K,et al.Relationship between G1 arrest and stability of the p53 and p21 eip1/waf1 protein following γ-irradiation of human lymphoma cells.Cancer Res,1995,55:2387-2393.
[8]Bae I,Smith MS,Zhan Q.et al.An abnormality in the p53 human melanoma lines.Cancer Res,1996,56:840-847.
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