放线菌酮和放线菌素D对放射性核素235U诱发细胞凋亡的影响
作者：傅强 张澜生 朱寿彭
单位：傅强 200433 上海，复旦大学遗传所；张澜生、朱寿彭 苏州医学院
关键词：放线菌酮；放线菌素D；放射性核素235U；细胞凋亡
中华放射医学与防护杂志/990511 【摘要】 目的 对放射性核素235U内照射诱发细胞凋亡的机理进行探讨。方法 通过MTT和JAM实验，检测凋亡细胞存活率及DNA链断裂量。结果 蛋白质合成抑制剂放线菌酮(CHX)及RNA合成抑制剂放线菌素D(Act D)不能抑制235U诱导的细胞凋亡，但CHX具有部分抑制凋亡细胞DNA链断裂的作用。结论 放射性核素235U内照射诱导细胞凋亡途径与外照射不同，不需要蛋白质的合成，但需合成性核酸内切酶参与。
, http://www.100md.com Effect of cycloheximide and actinomycin D on radionuclide235U-induced apoptosis
FU Qiang,ZHANG Lansheng,ZHU Shoupeng,Suzhou Medical College,Suzhou 215007,China
【Abstract】 Objective The mechanism of apoptosis induced by radionuclide 235U was studied.Methods MTT and JAM assay were used to analyse the cell viability and quantification of fragmented DNA. Results The inhibitor of protein cycloheximide (CHX),and the inhibitor of RNA synthesis,actinomycin D,cannot inhibit the apoptosis induced by 235U,but CHX can partly inhibit apoptotic cells DNA fragmentation. Conclusion The pathway of apoptosis induced by radionuclide 235U is different from X-and γ-ray external irradiation,protein synthesis is not essential for it ,but synthetic endonuclease is necessary for DNA fragmentation of apoptotic cells.
, 百拇医药
【Key words】 Cycloheximide Actinomycin D Radionuclide 235U Apoptosis
研究显示α辐射体核素235U可诱发细胞凋亡[1]。为了阐明放射性核素内照射诱发细胞凋亡的机理，作者观察了蛋白质合成抑制剂CHX以及RNA合成抑制剂Act D对核素235U诱发细胞凋亡作用的影响。
材料和方法
1.主要试剂：浓缩235UO2F2原液的235U丰度为18.9%，浓度为60 mg/ml，由核工业总公司提供。CHX及Act D为Sigma公司产品，用RPMI-1640全培养基配成100 μg/ml和50 μg/ml的储备液，无菌过滤后4℃冰箱保存备用。
, 百拇医药
2.细胞受核素内照射的剂量估算：无菌24孔培养板内每孔放置2×106指数生长期Molt-4及Ana-1细胞悬液，以及用RPMI-1640全培养基稀释的放射性活度为128.4 Bq/ml的235UO2F2工作液，每孔终放射性活度为64.2 Bq/ml。实验孔分别补充加入CHX或Act D，使终浓度为10 μg/ml(CHX)或0.5 μg/ml(Act D)。24孔板于细胞培养箱内培养，不同的实验观察点收获细胞用于细胞凋亡的定量分析。细胞受235U内照射不同时期的累计吸收剂量参照公式 D=AE/mt[2]计算。
3.细胞凋亡的定量分析：CHX和ActD对放射性核素诱发细胞凋亡的影响，采用MTT及JAM法进行定量分析[1]。
4.统计学处理：实验和对照组细胞凋亡及DNA链断裂百分比均数的比较采用方差分析。
, 百拇医药
结果
1.CHX及Act D对细胞存活率的影响：为了观察CHX及Act D对放射性核素诱发细胞凋亡的影响，作者首先观察了CHX及Act D对细胞存活率的影响。结果显示，10～50 μg/mlCHX和0.5～5 μg/ml Act D的浓度，在3～12小时内未引起细胞存活率的明显降低，表1。流式细胞分析也未见凋亡细胞所具有的低二倍体峰，见图1。但12小时后细胞存活率急剧下降，与对照组及12小时组相比具有显著的统计学差异。
图1 流式细胞仪分析CHX和Act D对Molt-4细胞存活率的影响
A：RPMI-1640全培养基作用的细胞(G1：36.8%、G2：7.8%、S：55.4%)；B：10μg/ml CHX作用9小时的细胞(G1：37.6%、G2：18.8%、S：43.6%，凋亡细胞0.2%)；C：1μg/ml Act D作用9小时的细胞(G1：33.6、G2：15.4、S：51.8，凋亡细胞0.1%)；D：235U作用12小时的细胞(G1：47.2%、G2：1.7%、S：51.1%，凋亡细胞15%)
, 百拇医药
2.CHX和Act D对235U诱发细胞凋亡的影响：MTT实验显示，在α辐射核素235U诱发Molt-4及Ana-1细胞凋亡的过程中，CHX和Act D未见抑制核素内照射引起的细胞存活率的降低，与对照组相比无统计学差异，见表2。24小时观察点CHX和Act D作用的实验组与对照组相比具有统计学差异，这可能是CHX和Act D自身作用的结果。
表1 CHX及Act D对Ana-1细胞存活率的影响〔(
±s)%〕 时间(h)
对照组
CHX (μg/ml)
Act D(μg/ml)
10
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25
50
0.5
1
5
3
100
99±8
100±2
95±5
100±5
100±6
94±3
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6
98±5
95±8
94±2
91±3
96±9
93±3
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9
98±3
94±5
88±1
91±4
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94±3
92±8
88±4
12
95±4
92±7
87±3
85±4
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90±4
86±8
24
89±6
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30±7**
27±2**
27±3**
37±3**
38±2**
34±2**
注：n=5,与对照组值比，**P<0.01； 对照组：1640培养的细胞表2 CHX和Act D对235U作用的Molt-4细胞和Ana-1细胞存活率的影响〔(±s)%〕 时间(h)
, http://www.100md.com 剂量
(mGy)
Molt-4 细胞
Ana-l 细胞
对照
CHX
Act D
对照
CHX
Act D
3
0.49
94±5
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98±3
97±3
91±2
89±5
87±9
6
0.98
79±10
78±7
80±7
70±5
75±5
72±8
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9
1.47
67±1
64±9
70±4
64±4
62±2
65±8
12
1.96
58±6
59±3
57±2
, 百拇医药
52±6
52±6
49±5
24
3.92
43±2
16±2**
27±3**
38±7
13±1**
16±1**
48
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7.84
30±4
3±0.1**
10±1**
18±2
4±0.1**
5±0.6**
注：n=5,与对照组值比，**P<0.01； 对照组：235U作用的细胞，CHX：235U & 10 μg/ml CHX作用的细胞，Act D：235U & 0.5 μg/ml作用的细胞
, 百拇医药
3.CHX和Act D对235U诱发的凋亡细胞DNA链断裂的影响：JAM实验显示，蛋白质合成抑制剂CHX显著地抑制α辐射体核素235U诱发的凋亡细胞DNA链断裂作用，在3～12小时的观察时间段内，核素诱发的Molt-4和Ana-1细胞DNA链断裂百分比低于40%，与对照组凋亡细胞DNA链断裂量相比差异有非常显著性(P<0.01)，见图2。Act D一定程度上也能抑制凋亡细胞DNA链断裂的作用，但不如CHX作用明显，见图3。
图2 CHX对235U诱发的Molt-4(A、B)
和Ana-1(C、D) DNA链断裂的影响
A、C：235U作用的细胞；B、D：235U和10 μg/ml CHX作用的细胞
, 百拇医药
图3 Act D对235U诱发的Molt-4(A、B)
和Ana-1(C、D) DNA链断裂的影响
A、C：235U作用的细胞；B、D：235U和0.5 μg/ml Act D作用的细胞
讨论
研究表明X射线和γ射线外照射经诱发性细胞凋亡途径引起细胞凋亡，因为蛋白质合成抑制剂CHX和RNA抑制剂Act D能够抑制外照射引起的细胞凋亡[3]。与X射线和γ射线外照射一样，适当剂量的α辐射体核素内照射也可诱发细胞凋亡[1]，但是由于α辐射体核素内照射具有作用时间持久、高LET、以及存在受照细胞对核素的吸附和吞噬等特点，因而诱发细胞凋亡的途径及机理显然较外照射复杂，是否也受蛋白质合成及RNA合成的影响尚不清楚。对β辐射体核素147Pm诱发细胞凋亡的研究显示，蛋白质合成抑制剂CHX和RNA合成抑制剂Act D不能抑制放射性核素内照射诱发的细胞凋亡[4]。为了全面地了解核素内照射诱发细胞凋亡的机理，笔者进一步观察了CHX以及Act D对α辐射体核素235U诱发细胞凋亡作用的影响。实验结果显示，虽然CHX和Act D不能抑制235U诱发的细胞凋亡(见表2)。但是CHX和Act D，特别是CHX，具有明显抑制凋亡细胞的DNA链断裂的作用，与放射性核素作用的对照组相比具有统计学差异。凋亡细胞DNA核小体间随机性断裂是一结构性内源性核酸内切酶活化的结果，由于是一结构性蛋白，因而其不受蛋白质合成和RNA合成的影响[5]。然而作者的实验结果则提示，在放射性核素内照射诱导的细胞凋亡过程中，引起DNA链断裂的核酸内切酶除结构性核酸内切酶外，还可能有合成性核酸内切酶的参与，其受CHX抑制，α辐射体核素235U内照射诱发的凋亡细胞DNA核小体间的断裂是二种来源的核酸酶共同作用的结果。有报道显示蛋白质合成抑制剂CHX和RNA合成抑制剂Act D本身可诱发细胞凋亡[6]，然而本实验的结果则显示，10～50 μg/ml CHX和0.5～5 μg/ml Act D浓度及3～12小时范围内，CHX和Act D本身不能引起Molt-4和Ana-1细胞存活率的降低(见表1)，流式细胞仪对CXH和Act D作用的细胞分析也未见凋亡细胞所显示的低二倍体峰(见图1)。但12小时后细胞存活率急剧下降，与对照组及12小时组相比具有显著的统计学差异。作者认为这可能是由于细胞受CHX和Act D长时间作用，许多维持细胞生存所必须蛋白质被抑制的结果。
, 百拇医药
参考文献
1 傅强，张澜生，朱寿彭.放射性核素235U诱发Molt-4细胞和Ana-1细胞凋亡.中华放射医学与防护杂志，1998，18：393-395.
2 李士骏.电离辐射剂量学.北京：原子能出版社，1981.286.
3 Inoue M,Tamaru M,Kameyama Y.Effect of cycloheximide and actinomycin D on radiation-induced apoptotic cell death in the developing mouse cerebellum.Int J Immunol,1992,61:669.
4 傅强，张澜生，朱寿彭.放射性核素147Pm诱发Molt-4细胞和Ana-1细胞凋亡.中华放射医学与防护杂志，1998，18：92-94.
, 百拇医药
5 Wyllie AH.Glucocorticoid-induction of thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation.Nature,1980,234:620.
6 Martin SJ,Lennon SV,Bonham AM,et al.Induction of apoptosis (programmed cell death) in human leukemic HL-60 cells by inhibition of RNA or protein synthesis.J Immunol,1990,145:1859.
(收稿:1998-06-03 修回1998-11-08), 百拇医药
单位：傅强 200433 上海，复旦大学遗传所；张澜生、朱寿彭 苏州医学院
关键词：放线菌酮；放线菌素D；放射性核素235U；细胞凋亡
中华放射医学与防护杂志/990511 【摘要】 目的 对放射性核素235U内照射诱发细胞凋亡的机理进行探讨。方法 通过MTT和JAM实验，检测凋亡细胞存活率及DNA链断裂量。结果 蛋白质合成抑制剂放线菌酮(CHX)及RNA合成抑制剂放线菌素D(Act D)不能抑制235U诱导的细胞凋亡，但CHX具有部分抑制凋亡细胞DNA链断裂的作用。结论 放射性核素235U内照射诱导细胞凋亡途径与外照射不同，不需要蛋白质的合成，但需合成性核酸内切酶参与。
, http://www.100md.com Effect of cycloheximide and actinomycin D on radionuclide235U-induced apoptosis
FU Qiang,ZHANG Lansheng,ZHU Shoupeng,Suzhou Medical College,Suzhou 215007,China
【Abstract】 Objective The mechanism of apoptosis induced by radionuclide 235U was studied.Methods MTT and JAM assay were used to analyse the cell viability and quantification of fragmented DNA. Results The inhibitor of protein cycloheximide (CHX),and the inhibitor of RNA synthesis,actinomycin D,cannot inhibit the apoptosis induced by 235U,but CHX can partly inhibit apoptotic cells DNA fragmentation. Conclusion The pathway of apoptosis induced by radionuclide 235U is different from X-and γ-ray external irradiation,protein synthesis is not essential for it ,but synthetic endonuclease is necessary for DNA fragmentation of apoptotic cells.
, 百拇医药
【Key words】 Cycloheximide Actinomycin D Radionuclide 235U Apoptosis
研究显示α辐射体核素235U可诱发细胞凋亡[1]。为了阐明放射性核素内照射诱发细胞凋亡的机理，作者观察了蛋白质合成抑制剂CHX以及RNA合成抑制剂Act D对核素235U诱发细胞凋亡作用的影响。
材料和方法
1.主要试剂：浓缩235UO2F2原液的235U丰度为18.9%，浓度为60 mg/ml，由核工业总公司提供。CHX及Act D为Sigma公司产品，用RPMI-1640全培养基配成100 μg/ml和50 μg/ml的储备液，无菌过滤后4℃冰箱保存备用。
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2.细胞受核素内照射的剂量估算：无菌24孔培养板内每孔放置2×106指数生长期Molt-4及Ana-1细胞悬液，以及用RPMI-1640全培养基稀释的放射性活度为128.4 Bq/ml的235UO2F2工作液，每孔终放射性活度为64.2 Bq/ml。实验孔分别补充加入CHX或Act D，使终浓度为10 μg/ml(CHX)或0.5 μg/ml(Act D)。24孔板于细胞培养箱内培养，不同的实验观察点收获细胞用于细胞凋亡的定量分析。细胞受235U内照射不同时期的累计吸收剂量参照公式 D=AE/mt[2]计算。
3.细胞凋亡的定量分析：CHX和ActD对放射性核素诱发细胞凋亡的影响，采用MTT及JAM法进行定量分析[1]。
4.统计学处理：实验和对照组细胞凋亡及DNA链断裂百分比均数的比较采用方差分析。
, 百拇医药
结果
1.CHX及Act D对细胞存活率的影响：为了观察CHX及Act D对放射性核素诱发细胞凋亡的影响，作者首先观察了CHX及Act D对细胞存活率的影响。结果显示，10～50 μg/mlCHX和0.5～5 μg/ml Act D的浓度，在3～12小时内未引起细胞存活率的明显降低，表1。流式细胞分析也未见凋亡细胞所具有的低二倍体峰，见图1。但12小时后细胞存活率急剧下降，与对照组及12小时组相比具有显著的统计学差异。
图1 流式细胞仪分析CHX和Act D对Molt-4细胞存活率的影响
A：RPMI-1640全培养基作用的细胞(G1：36.8%、G2：7.8%、S：55.4%)；B：10μg/ml CHX作用9小时的细胞(G1：37.6%、G2：18.8%、S：43.6%，凋亡细胞0.2%)；C：1μg/ml Act D作用9小时的细胞(G1：33.6、G2：15.4、S：51.8，凋亡细胞0.1%)；D：235U作用12小时的细胞(G1：47.2%、G2：1.7%、S：51.1%，凋亡细胞15%)
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2.CHX和Act D对235U诱发细胞凋亡的影响：MTT实验显示，在α辐射核素235U诱发Molt-4及Ana-1细胞凋亡的过程中，CHX和Act D未见抑制核素内照射引起的细胞存活率的降低，与对照组相比无统计学差异，见表2。24小时观察点CHX和Act D作用的实验组与对照组相比具有统计学差异，这可能是CHX和Act D自身作用的结果。
表1 CHX及Act D对Ana-1细胞存活率的影响〔(
±s)%〕 时间(h)对照组
CHX (μg/ml)
Act D(μg/ml)
10
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25
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0.5
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24
89±6
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30±7**
27±2**
27±3**
37±3**
38±2**
34±2**
注：n=5,与对照组值比，**P<0.01； 对照组：1640培养的细胞表2 CHX和Act D对235U作用的Molt-4细胞和Ana-1细胞存活率的影响〔(
±s)%〕 时间(h), http://www.100md.com 剂量
(mGy)
Molt-4 细胞
Ana-l 细胞
对照
CHX
Act D
对照
CHX
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3
0.49
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52±6
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7.84
30±4
3±0.1**
10±1**
18±2
4±0.1**
5±0.6**
注：n=5,与对照组值比，**P<0.01； 对照组：235U作用的细胞，CHX：235U & 10 μg/ml CHX作用的细胞，Act D：235U & 0.5 μg/ml作用的细胞
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3.CHX和Act D对235U诱发的凋亡细胞DNA链断裂的影响：JAM实验显示，蛋白质合成抑制剂CHX显著地抑制α辐射体核素235U诱发的凋亡细胞DNA链断裂作用，在3～12小时的观察时间段内，核素诱发的Molt-4和Ana-1细胞DNA链断裂百分比低于40%，与对照组凋亡细胞DNA链断裂量相比差异有非常显著性(P<0.01)，见图2。Act D一定程度上也能抑制凋亡细胞DNA链断裂的作用，但不如CHX作用明显，见图3。
图2 CHX对235U诱发的Molt-4(A、B)
和Ana-1(C、D) DNA链断裂的影响
A、C：235U作用的细胞；B、D：235U和10 μg/ml CHX作用的细胞
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图3 Act D对235U诱发的Molt-4(A、B)
和Ana-1(C、D) DNA链断裂的影响
A、C：235U作用的细胞；B、D：235U和0.5 μg/ml Act D作用的细胞
讨论
研究表明X射线和γ射线外照射经诱发性细胞凋亡途径引起细胞凋亡，因为蛋白质合成抑制剂CHX和RNA抑制剂Act D能够抑制外照射引起的细胞凋亡[3]。与X射线和γ射线外照射一样，适当剂量的α辐射体核素内照射也可诱发细胞凋亡[1]，但是由于α辐射体核素内照射具有作用时间持久、高LET、以及存在受照细胞对核素的吸附和吞噬等特点，因而诱发细胞凋亡的途径及机理显然较外照射复杂，是否也受蛋白质合成及RNA合成的影响尚不清楚。对β辐射体核素147Pm诱发细胞凋亡的研究显示，蛋白质合成抑制剂CHX和RNA合成抑制剂Act D不能抑制放射性核素内照射诱发的细胞凋亡[4]。为了全面地了解核素内照射诱发细胞凋亡的机理，笔者进一步观察了CHX以及Act D对α辐射体核素235U诱发细胞凋亡作用的影响。实验结果显示，虽然CHX和Act D不能抑制235U诱发的细胞凋亡(见表2)。但是CHX和Act D，特别是CHX，具有明显抑制凋亡细胞的DNA链断裂的作用，与放射性核素作用的对照组相比具有统计学差异。凋亡细胞DNA核小体间随机性断裂是一结构性内源性核酸内切酶活化的结果，由于是一结构性蛋白，因而其不受蛋白质合成和RNA合成的影响[5]。然而作者的实验结果则提示，在放射性核素内照射诱导的细胞凋亡过程中，引起DNA链断裂的核酸内切酶除结构性核酸内切酶外，还可能有合成性核酸内切酶的参与，其受CHX抑制，α辐射体核素235U内照射诱发的凋亡细胞DNA核小体间的断裂是二种来源的核酸酶共同作用的结果。有报道显示蛋白质合成抑制剂CHX和RNA合成抑制剂Act D本身可诱发细胞凋亡[6]，然而本实验的结果则显示，10～50 μg/ml CHX和0.5～5 μg/ml Act D浓度及3～12小时范围内，CHX和Act D本身不能引起Molt-4和Ana-1细胞存活率的降低(见表1)，流式细胞仪对CXH和Act D作用的细胞分析也未见凋亡细胞所显示的低二倍体峰(见图1)。但12小时后细胞存活率急剧下降，与对照组及12小时组相比具有显著的统计学差异。作者认为这可能是由于细胞受CHX和Act D长时间作用，许多维持细胞生存所必须蛋白质被抑制的结果。
, 百拇医药
参考文献
1 傅强，张澜生，朱寿彭.放射性核素235U诱发Molt-4细胞和Ana-1细胞凋亡.中华放射医学与防护杂志，1998，18：393-395.
2 李士骏.电离辐射剂量学.北京：原子能出版社，1981.286.
3 Inoue M,Tamaru M,Kameyama Y.Effect of cycloheximide and actinomycin D on radiation-induced apoptotic cell death in the developing mouse cerebellum.Int J Immunol,1992,61:669.
4 傅强，张澜生，朱寿彭.放射性核素147Pm诱发Molt-4细胞和Ana-1细胞凋亡.中华放射医学与防护杂志，1998，18：92-94.
, 百拇医药
5 Wyllie AH.Glucocorticoid-induction of thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation.Nature,1980,234:620.
6 Martin SJ,Lennon SV,Bonham AM,et al.Induction of apoptosis (programmed cell death) in human leukemic HL-60 cells by inhibition of RNA or protein synthesis.J Immunol,1990,145:1859.
(收稿:1998-06-03 修回1998-11-08), 百拇医药