不同剂量的K2Cr2O7对细胞膜通透性的影响
作者：贾光 刘世杰 田润泉
单位：贾光(100083，北京医科大学公共卫生学院劳动卫生教研室); 刘世杰(100083，北京医科大学公共卫生学院劳动卫生教研室)；田润泉(公共卫生学院仪器分析中心)
关键词：K2Cr2O17 细胞膜 通透性
中国职业医学000101 摘 要：目的 研究不同剂量的K2Cr2O7对细胞膜通透性的影响。方法 采用人胚肺细胞的乳酸脱氢酶的漏出、K+漏出以及豚鼠红细胞溶血率等三种方法测定K2Cr2O7对细胞膜通透性的影响。结果 小于5 μmol/L浓度的K2Cr2O7未造成细胞膜通透性的改变。结论 低浓度K2Cr2O7对细胞损伤的靶点不是细胞膜。
, 百拇医药
分类号：R 136.3+1 R 329.2 文献标识码：A
The effects of various doses of K2Cr2O7 on the permeability of cell membrane
JIA Guang, LIU Shijie, TIAN Runquan
(The Department of Occupational Health, School of Public Health, Beijing Medical University, Beijing 100083, China)
Abstract：Objective To study the effects of various doses of K2Cr2O7 on the permeability of cell membrane. Methods Three criteria including LDH leakage, K+ leakage from human embryonic lung cells and the hemolytic rate of Guinea-pig erythrocyte were used.Results It showed that the dose of K2Cr2O7 below 5 μmol/L could not induce effect on the permeability of cell membrane. Conclusion It suggested that the target point of low dose of K2Cr2O7 induced-damage did not focus on the cell membrane.
, 百拇医药
Key words：K2Cr2O7, cell membrane, permeability▲
铬盐有着广泛的工业用途，同时也是一种明确的致癌物。有研究表明，六价铬可通过细胞膜上的阴离子通道进入细胞。那么，六价铬在进入细胞时，是否伴随有细胞膜的损伤，尤其是能否对细胞膜的通透性造成改变?为此，我们采用LDH(乳酸脱氢酶)和K+漏出及红细胞溶血率等三个经典的反映细胞膜通透性改变的试验，观察了六价铬(K2Cr2O7)对细胞通透性的影响，期望能为六价铬对细胞不同生物学效应的系统研究补充一点有益的资料。
1 材料和方法
1.1 细胞株 人胚肺细胞(Human Embryo Lung Cell, HEL cell)，由军事医学科学院毒物药物研究所赵修南同志建株并惠赠，常规培养。
, 百拇医药
1.2 LDH漏出[1]实验 取指数生长的HEL细胞，加含10%小牛血清的最低限度MEM型培养液，稀释成含细胞5×107/L，种入24孔培养板，每孔种入2 ml，培养24 h，换液，加入含实验设计浓度K2Cr2O7的培养液1 ml，继续培养24 h，培养结束后离心，用2，4-二硝基苯肼法测定上清液中细胞漏出的LDH活性。酶的单位定义：以样本100 ml在37℃作用15 min，产生丙酮酸1个μmol为一单位(U)。
1.3 K+漏出，细胞内外K+检测[2] 细胞处理同LDH漏出试验。染毒结束后，离心收集上清液，用于测定细胞外K+含量；细胞部分自然风干，每孔加入浓硝酸0.2 ml，室温消化30 min，加超纯水1.8 ml，用于测定细胞内K+含量。本次测定前，取50 μl待测液，加9.95 ml稀硝酸，稀释200倍。用WFX-IB型原子吸收分光光度计测定K+含量。测定条件为：灯电流为2 mA，狭缝0.2 mm，乙炔70 ml/min，波长765.9 nm，头高10，阻片1。根据标准曲线，由OD值读出K+浓度。本试验采用细胞内外K+比值K+ 细胞内/K+ 细胞外反映细胞膜通透性改变，这样就避免了由于不同组细胞数量不同而造成的误差，能更精确地反映细胞内K+含量的变化。
, 百拇医药
1.4 红细胞溶血率[3] 取豚鼠新鲜红细胞悬液3 ml，用0.9%的生理盐水定容至100 ml，取上述细胞悬液1.0 ml，加入所需浓度的K2Cr2O7，37℃水浴2 h，2 000 r/min离心10 min，于540 nm处测OD值，以蒸馏水作为全溶对照，计算溶血率。
2 结果与讨论
K2Cr2O7对HEL细胞LDH漏出的影响(见表1)。
表1 K2Cr2O7染毒24 h对HEL细胞LDH及K+漏出以及豚鼠红细胞溶血率的影响
(
±s，n=3) 剂量
, 百拇医药
(μmol/L)
LDH漏
(U/L)
K+漏出
(K+细胞内/K+细胞外)
豚鼠红细胞
溶血率(%)
0.000
263±6
13.47±3.48
3.0±0.0
, 百拇医药
0.625
273±6
11.55±1.25
2.6±0.3
1.250
271±2
11.95±0.55
3.0±0.9
2.500
281±16
12.12±1.69
2.3±0.6
, 百拇医药
5.000
350±8Δ
11.19±1.94
2.2±0.3
10.000
509±7Δ
12.12±2.52
2.2±0.3
t-test;与对照组相比，P<0.05,ΔP<0.01。
表1结果显示，当K2Cr2O7直接作用于细胞时，只有LDH的漏出及豚鼠红细胞溶血率两实验在5～10 μmol/L组细胞膜的通透性发生了改变，其余剂量组和K+漏出试验的各剂量组均显示与K2Cr2O7的添加剂量无关。这至少说明，低于5 μmol/L浓度的K2Cr2O7对细胞膜无明显损伤作用。有研究表明[4]，六价铬离子主要是以四面体铬离子形式，利用细胞膜上的普通阴离子转运系统而进入细胞。对于红细胞，六价铬离子主要通过红细胞膜上带三蛋白的协助而进入红细胞。本研究结果也表明，小于5 μmol/L K2Cr2O7虽可通过细胞膜上的阴离子转运系统进入细胞，然而并未因此造成人胚肺细胞及豚鼠红细胞膜的直接损伤。即K2Cr2O7在该剂量范围内虽可造成细胞的遗传损伤[5]及增殖毒性[6]，但显然该剂量六价铬离子的作用靶点不在细胞膜上，进一步的问题尚待继续研究。■
, 百拇医药
本课题受卫生部自然科学基金资助96-1-291
参考文献：
[1]叶应妩，李健斋，王玉琛. 临床实验诊断学(上册). 第1版. 北京：人民卫生出版社，1989：598
[2]Elferink JGR. Chrysotile asbestos-induced membrane damage in human erythrocytes. Res Commun Chem Pathol Pharmacol, 1991,73(3):355
[3]邹彤彤. 柠檬酸铝对SiO2细胞毒性作用影响的研究(一). 冶金劳动卫生学，1982，8(6)：326
[4]Jennette KW. Chromate metabolism in liver microsomes. Biol Trace Elem Res, 1979(1)：55
[5]贾光，刘世杰，吕有勇，等. Cr(Ⅵ)对人胚肺细胞P53及抑癌基因P21(WAF1)表达的影响. 中华劳动卫生职业病杂志，1998，16(4)：201
[6]贾光，马宁，王耐芬，等. 3种抗氧化剂对Cr6+所致细胞生物学效应的影响. 北京医科大学学报，1998，30(5)：435
收稿日期：1999-07-05, 百拇医药
单位：贾光(100083，北京医科大学公共卫生学院劳动卫生教研室); 刘世杰(100083，北京医科大学公共卫生学院劳动卫生教研室)；田润泉(公共卫生学院仪器分析中心)
关键词：K2Cr2O17 细胞膜 通透性
中国职业医学000101 摘 要：目的 研究不同剂量的K2Cr2O7对细胞膜通透性的影响。方法 采用人胚肺细胞的乳酸脱氢酶的漏出、K+漏出以及豚鼠红细胞溶血率等三种方法测定K2Cr2O7对细胞膜通透性的影响。结果 小于5 μmol/L浓度的K2Cr2O7未造成细胞膜通透性的改变。结论 低浓度K2Cr2O7对细胞损伤的靶点不是细胞膜。
, 百拇医药
分类号：R 136.3+1 R 329.2 文献标识码：A
The effects of various doses of K2Cr2O7 on the permeability of cell membrane
JIA Guang, LIU Shijie, TIAN Runquan
(The Department of Occupational Health, School of Public Health, Beijing Medical University, Beijing 100083, China)
Abstract：Objective To study the effects of various doses of K2Cr2O7 on the permeability of cell membrane. Methods Three criteria including LDH leakage, K+ leakage from human embryonic lung cells and the hemolytic rate of Guinea-pig erythrocyte were used.Results It showed that the dose of K2Cr2O7 below 5 μmol/L could not induce effect on the permeability of cell membrane. Conclusion It suggested that the target point of low dose of K2Cr2O7 induced-damage did not focus on the cell membrane.
, 百拇医药
Key words：K2Cr2O7, cell membrane, permeability▲
铬盐有着广泛的工业用途，同时也是一种明确的致癌物。有研究表明，六价铬可通过细胞膜上的阴离子通道进入细胞。那么，六价铬在进入细胞时，是否伴随有细胞膜的损伤，尤其是能否对细胞膜的通透性造成改变?为此，我们采用LDH(乳酸脱氢酶)和K+漏出及红细胞溶血率等三个经典的反映细胞膜通透性改变的试验，观察了六价铬(K2Cr2O7)对细胞通透性的影响，期望能为六价铬对细胞不同生物学效应的系统研究补充一点有益的资料。
1 材料和方法
1.1 细胞株 人胚肺细胞(Human Embryo Lung Cell, HEL cell)，由军事医学科学院毒物药物研究所赵修南同志建株并惠赠，常规培养。
, 百拇医药
1.2 LDH漏出[1]实验 取指数生长的HEL细胞，加含10%小牛血清的最低限度MEM型培养液，稀释成含细胞5×107/L，种入24孔培养板，每孔种入2 ml，培养24 h，换液，加入含实验设计浓度K2Cr2O7的培养液1 ml，继续培养24 h，培养结束后离心，用2，4-二硝基苯肼法测定上清液中细胞漏出的LDH活性。酶的单位定义：以样本100 ml在37℃作用15 min，产生丙酮酸1个μmol为一单位(U)。
1.3 K+漏出，细胞内外K+检测[2] 细胞处理同LDH漏出试验。染毒结束后，离心收集上清液，用于测定细胞外K+含量；细胞部分自然风干，每孔加入浓硝酸0.2 ml，室温消化30 min，加超纯水1.8 ml，用于测定细胞内K+含量。本次测定前，取50 μl待测液，加9.95 ml稀硝酸，稀释200倍。用WFX-IB型原子吸收分光光度计测定K+含量。测定条件为：灯电流为2 mA，狭缝0.2 mm，乙炔70 ml/min，波长765.9 nm，头高10，阻片1。根据标准曲线，由OD值读出K+浓度。本试验采用细胞内外K+比值K+ 细胞内/K+ 细胞外反映细胞膜通透性改变，这样就避免了由于不同组细胞数量不同而造成的误差，能更精确地反映细胞内K+含量的变化。
, 百拇医药
1.4 红细胞溶血率[3] 取豚鼠新鲜红细胞悬液3 ml，用0.9%的生理盐水定容至100 ml，取上述细胞悬液1.0 ml，加入所需浓度的K2Cr2O7，37℃水浴2 h，2 000 r/min离心10 min，于540 nm处测OD值，以蒸馏水作为全溶对照，计算溶血率。
2 结果与讨论
K2Cr2O7对HEL细胞LDH漏出的影响(见表1)。
表1 K2Cr2O7染毒24 h对HEL细胞LDH及K+漏出以及豚鼠红细胞溶血率的影响
(
±s，n=3) 剂量, 百拇医药
(μmol/L)
LDH漏
(U/L)
K+漏出
(K+细胞内/K+细胞外)
豚鼠红细胞
溶血率(%)
0.000
263±6
13.47±3.48
3.0±0.0
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0.625
273±6
11.55±1.25
2.6±0.3
1.250
271±2
11.95±0.55
3.0±0.9
2.500
281±16
12.12±1.69
2.3±0.6
, 百拇医药
5.000
350±8Δ
11.19±1.94
2.2±0.3
10.000
509±7Δ
12.12±2.52
2.2±0.3
t-test;与对照组相比，P<0.05,ΔP<0.01。
表1结果显示，当K2Cr2O7直接作用于细胞时，只有LDH的漏出及豚鼠红细胞溶血率两实验在5～10 μmol/L组细胞膜的通透性发生了改变，其余剂量组和K+漏出试验的各剂量组均显示与K2Cr2O7的添加剂量无关。这至少说明，低于5 μmol/L浓度的K2Cr2O7对细胞膜无明显损伤作用。有研究表明[4]，六价铬离子主要是以四面体铬离子形式，利用细胞膜上的普通阴离子转运系统而进入细胞。对于红细胞，六价铬离子主要通过红细胞膜上带三蛋白的协助而进入红细胞。本研究结果也表明，小于5 μmol/L K2Cr2O7虽可通过细胞膜上的阴离子转运系统进入细胞，然而并未因此造成人胚肺细胞及豚鼠红细胞膜的直接损伤。即K2Cr2O7在该剂量范围内虽可造成细胞的遗传损伤[5]及增殖毒性[6]，但显然该剂量六价铬离子的作用靶点不在细胞膜上，进一步的问题尚待继续研究。■
, 百拇医药
本课题受卫生部自然科学基金资助96-1-291
参考文献：
[1]叶应妩，李健斋，王玉琛. 临床实验诊断学(上册). 第1版. 北京：人民卫生出版社，1989：598
[2]Elferink JGR. Chrysotile asbestos-induced membrane damage in human erythrocytes. Res Commun Chem Pathol Pharmacol, 1991,73(3):355
[3]邹彤彤. 柠檬酸铝对SiO2细胞毒性作用影响的研究(一). 冶金劳动卫生学，1982，8(6)：326
[4]Jennette KW. Chromate metabolism in liver microsomes. Biol Trace Elem Res, 1979(1)：55
[5]贾光，刘世杰，吕有勇，等. Cr(Ⅵ)对人胚肺细胞P53及抑癌基因P21(WAF1)表达的影响. 中华劳动卫生职业病杂志，1998，16(4)：201
[6]贾光，马宁，王耐芬，等. 3种抗氧化剂对Cr6+所致细胞生物学效应的影响. 北京医科大学学报，1998，30(5)：435
收稿日期：1999-07-05, 百拇医药