α粒子诱导人支气管上皮细胞转化相关基因的分离与克隆
作者：周晓 吴德昌 程书钧 胡迎春 舒为群 李刚
单位：周晓、吴德昌、胡迎春、李刚 北京放射医学研究所 100850；书钧、舒为群 中国医学科学院 肿瘤研究所病因室
关键词：α照射；人支气管上皮细胞；mRNA差异显示；转化；相关
α粒子诱导人支气管上皮细胞转化相关 基因的分离与克隆 【摘要】 目的 探索α粒子照射诱导人支气管上皮细胞 转化的相关基因，并加以克隆。方法采用了mRNA差异显示技术，通过辐 射诱发转化细胞与同代未经照射细胞的对比，找出差异cDNA片段。结果 克隆出2gs3,5gs1,5gs2,2gd1,6gd1 5个差异片段，测序，经文献检索发现除5gs1外均为新序 列 ，已登录到EMBL库中。结论 发现了细胞转化早期的新序列的4个cDNA片段 ，生物学特性与功能有待研究。
基因
, http://www.100md.com
Isolation and cloning of genes related to the transformation o f immortalized human bronchial epithelial cell line induced by alpha-particle radiation.
ZHOU Xiao, WU Dechang, CHENG Shujun, et al. Department of Mo lecular Toxicology,Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850， China.
【Abstract】 Objective To find out the genes related to transforma tion of human bronchial epithelial cell line and to clone them. Methods The mRNA differential display method was used. Results Different ial cDNA fragments were found.After sequencing and identification in GenBank,4 f ragments were found to be novel ones and were registered in EMBL database. Conclusion Four novel cDNA fragments have been found,but their biological characterictics and functions are still to be elucidated.
, 百拇医药
【Key words】 α-Radiation Human bronchial epithelial immortali zed cell line mRNA differential display Genes related to cell transformati on
流行病学研究表明，接触高水平氡及其子体的铀矿工人肺癌发病率增高 [1]。在人类所受的天然辐射中，50%以上来源于氡及其子体[2]。因此研究 α 粒子照射诱导人支气管上皮细胞转化过程中相关基因的变化，对阐明氡及其子体辐射诱导肺 癌发生的分子机制具有重要意义[3]。本研究以经α粒子照射诱导转化的细胞与相 应的对照细胞为对比材料，采用mRNA差异显示(mRNA-DD)技术对转化早期差异表达的cDNA序 列进行了分离与克隆。
材料和方法
, http://www.100md.com
1.材料：总RNA提取试剂盒，pGEM-T载体系统，Taq DNA聚合酶均为Promega公司产品；mRN A-DD引物购自GeneHunter公司，鉴定差异显示片段的特异引物由Cybereyn公司合成。质粒 提取试剂盒为QIAGEN公司产品，α-[32P]-dCTP购于北京辉瑞公司，X射线胶片为 Koda公司产品。
2.细胞系：采用中国医学科学院肿瘤研究所病因室建立的永生化人支气管上皮细胞M(HBEM) 细胞系[4]，在无血清培养液中培养，体外连续传22代。
3.照射条件：采用238PuO2 粒子电镀盘源(5.34 MeV)，照射用培养皿 底部为2.5μm Hostaphan膜，将细胞接种到膜上，待贴壁后放在源上进行照射，估算平均剂量率为1.26 Gy.min-1。细胞核吸收剂量为1.5 Gy。
, 百拇医药
4.引物：mRNA-DD引物。3′端锚定引物:HT11G:5′-AAGCTTTTTTTTT TT G-3′。5′端任意引物:HAP1:5′-AAGCTTGATTGCC-3′；HAP2：5′ -AAGCTTCGACTGT-3′;HAP3:5′-AAGCTTTGGTCAG-3′;HAP4:5′-AAGCTTCTCAACG-3′;H AP5:5′-AAGCTTAGTAGGC-3′;HAP6:5′-AAGCTTGCACCAT-3′;HAP7:5′-AAGCTTAACGAGG -3′;HAP8:5′-AAGCTTTTACCGC-3′。鉴定差异显示片段的特异引物：HBE6GD1:5′-AAA ATTGGTTCAGAACGAGCA-3′。
5.细胞总RNA提取：按Promega公司的试剂盒说明，分别提取两组细胞的总RNA。
6.mRNA差异显示
(1)逆转录PCR：分别以对照组与实验组细胞总RNA为模板进行反转录PCR。在0.5 ml离心管 中依次加入下列成分：dH2O 9.4 μl, 5×RT缓冲液4.0 μl, dNTP(250 μmol/L) 1.6 μl，总RNA(DNA-free) 2.0 μl(0.1 μg/μl), H-T11G(2 μmol/L) 2.0 μl; 于PE -480 PCR仪上按下列条件进行PCR反应：65℃，5分钟→37℃，10分钟，加1 μl MMLV,37℃ ，50分钟→72℃，5分钟→4℃。
, 百拇医药
(2)PCR扩增：依次向0.5 ml PCR管中加入下列成分：dH2O 9.8 μl,10×PCR缓冲液2. 0 μl,MgCl2 1.2 μl,dNTP(25 μmol/L) 1.6 μl,HAP引物(2 μmol/L) 2.0 μl, H-T11 G(2 μmol/L) 2.0 μl,RT-mix 2.0 μl,α-[32P]dCTP 0.4 μl,Ampli Taq 0.2 μl;PCR反应条件：94℃，30秒→40℃，2分钟→72℃，30秒循环40 次→72 ℃，5分钟→4℃。
(3)变性梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)与放射自显影：每3.5 μl PCR产物与2 μl加样缓 冲液混合，80℃变性2分钟，冰上冷却后在6%变性梯度聚丙烯酰胺凝胶上以1 650 V，60W恒 功率电泳3.5小时，-70℃曝光12～14小时，暗室中冲洗胶片。
(4)差异DNA片段的回收、再扩增与克隆：从凝胶上回收在对照组与实验组之间有明显表达 差 异cDNA条带，溶于100 μl dH2O中10分钟，沸水中煮15分钟；离心收集上清，向其中加入 10 μl 3 mol/L乙酸钠，5 μl糖原(10 mg/ml)，450 μl 乙醇体积分数为100%，-80℃过夜，4℃离心 ，并用乙醇体积分数为85%洗一次，溶于10 μl dH2O中。取4 μl为模板，按照前面PCR扩增条件，再 次扩增。参照试剂盒的说明将PCR产物与pGEM-T载体连接，转化JM109菌株，经蓝白系统筛 选，挑取阳性菌落，提取质粒，经PstⅠ, SacⅡ双酶切鉴定重组子。
, http://www.100md.com
7.序列分析及同源性比较：采用末端终止法经373A型Applied Biosystems对cDNA片段进行 测序。通过因特网将差异cDNA的核苷酸序列与Gene Bank核酸数据库的已知序列进行 类似性比较，并将未知的差异cDNA序列在EMBL数据库中登录。
8.逆转录PCR鉴定差异片段的表达：采用合成的3′端特异引物及相应的5′端引物，以第6 项的逆转录产物进行PCR反应，经1.5%琼脂糖凝胶电泳，鉴定其在实验组与对照组的表达情 况。
9.差异片段在不同cDNA文库中的表达：以cDNA原液为模板，采用合成的3′端特异引物及相 应的5′端引物进行PCR反应，经1.5%琼脂糖凝胶电泳，鉴定其在不同文库中的表达情况。
结 果
1.总RNA的鉴定：经紫外分光光度计测定260、280 nm处的吸收值，其A260/A280均大于1 .7，表明纯度较高。经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，28 s、18 s条带清晰，表明无降解。
, http://www.100md.com
2.RNA差异显示结果：从变性PAGE电泳凝胶上共找出20条差异表达的条带，回收并进行PC R再次扩增有13条带有扩增产物。
3.PCR产物的克隆与序列分析：选择在对照组表达，实验组不表达的6gd1,2gd2,与在实验 组表达，对照组不表达的5gs1,5gs2,2gs3等5条相对长的带进一步克隆测序。经序列分析 ，得到如下部分cDNA核苷酸序列：
6gd1 5′ 1 gtcttccagg agactagact actgttgtcc agggtcaatt tgagt gtaaa gaaaatgtag
61 acaaggaatt gcccaatttt aaattctgac tttgctact taatttaaat gctcgttct g
121 aaccaatttt ttcctatctt ctctaggggt ttcaaaagac tcagttaatt gattttc cagg
, http://www.100md.com
181 aagtactcat agcaagttcc ataaaatgtt cttgagacct aaattttctt ca
3′
2gd2 5′ 1 ttcgaatctg acaccccccgt aactcctttc ctgagactac tgtgtcc tcg gtctacattt
61 atcctttctt ttgacgtcgg gacaagtagg tctactagga ttattatgtc gaggtttt t
121 tttttcgaat
3′
5gs1 5′ 1 atttaataaa gttttatttt tccaaatgta cagctggttg gacctatt ca tgcatcttca
, http://www.100md.com
61 ccagcagctg gagcatctcc acccttggta tttctggtgt aaattacttg agctctg tgc
121 tttgaaacca gtttgataag tcctgtacta aggagctcct gaagggctgc cctggg cagg
181 gagcctcgaa tctttcaggc tctcagagac cacagctggg ggtataaggt ttatag gtgg
241 ggaaccttcc tgtacagagt tttatcaata ggntaggctt gtgtcaaaca aagacta agg
301 ttatttgngc cttgtnccng aacntttggc ctttggganc cantttttnc nttttt ttng
, http://www.100md.com
3′
5gs2 5′ 1 attcgaatca tccgtccttg acttggaact tggacgtgat atacggaa ag agtgtctagt
61 tatagacata agaataacct tagagntata aggagctcta atttaaaccn ggttcgta ct
121 atcagatagg ggtnngggnt ttcgaat
3′
2gs3 5′ 1 attcgaaaaa aaaaaaccac ccccctatta cttgttttac aaagggaa at atggaaaaga
61 tcatactatg taaaagatca taaatgtcaa aatgaaaatc tctcaatgga aaacttcg ta
, 百拇医药
121 tgaatcaatg acaatttgat aagacaaggg catcaaccta cttcgattat tttttcg tcc
181 gataaaaata attggcggtc taaagtgttg tcagcttcga at
3′
6gd1在对照组中高表达，在实验组中不表达；并且它在人胎盘cDNA文库中高表达，在人脑、 肝脏cDNA文库中不表达。
4.同源性分析与数据库登录：将以上序列与GeneBank核酸数据库中的已知序列进行类似性 比较，没有发现与6gd1,2gd2,5gs2,2gs3相似的已知序列，认为是新序列，将其登录到Ge neBank数据库中。6gd1,2gs3,5gs2的登录号依次为Y13659、AF023162、AF063163。5gs1与人核糖体蛋白S25(HUMRPS25)的部分序列有98%的相似性。
, 百拇医药
讨 论
寻找细胞转化相关基因，进而阐明肿瘤发生的分子机理，对肿瘤的预防、治疗、预后判断具 有重要意义。在确认、比较mRNA差异表达研究方面，应用了Liang于1992年建立的mRNA-DD 技 术，它是一种分离差异表达基因的全新方法[5，6]。该方法使用不同的引物组合 ，可从一对细胞群体各自产生的约15 000种mRNA中，有效地鉴别并克隆差异表达的基因。同 消减杂交法相比，该法具有简便、灵敏、高效率、省时间等优势。
研究选择经1.5 Gyα粒子单次照射，在体外连续传代22周的转化细胞和相应的对照细胞为 对比材料。此转化细胞已获得锚着独立生长能力，并在去上皮大鼠气管裸鼠体内种植的体内 -体外模型中能够长出鳞状化生上皮，说明其表型已发生了改变。对比细胞是与其来源于同 一群体、在体外平行传代、而没有这些表型改变的对照组细胞。因为这一对细胞具有相同的 遗传背景，它们的差异只是由于α粒子照射造成的，所以是研究转化相关基因的较为理想 材料。
, http://www.100md.com
选择锚定引物HT11G和8种任意引物组合，对两个细胞系的mRNA进行了差异显示，从变性PA GE 凝胶上共找出20条差异表达的条带，有13条带被PCR再次扩增出来。选择相对较长的5个片段 进行重组克隆，序列分析资料表明，6gd1、2gd2,5gs2,2gs3是新序列，已将其登录到Gene Bank中。5gs1同人核糖体蛋白S25 mRNA的序列有98%的同源性。6gd1,2gd2在对照组细胞中 表达，在转化组缺失，可能是新抑癌基因的候选基因片段；而5gs2、2gs3在实验组表达， 对照组缺失，可能是候选癌基因的部分片段。
本研究发现5gs1与人核糖体蛋白S25的部分序列有98%的同源性，且在1.5 Gy α粒子诱导的 转化细胞中高表达，而该细胞对血清的促分化抗性增强。对于其表达在上皮细胞转化中的作 用还有待深入研究。
分别检测了6gd1在人脑、胎盘、肝脏cDNA文库中的表达情况，结果表明它只在胎盘cDNA文库 中高表达。提示可从人胎盘cDNA文库中钓取其全长基因，以深入研究其在肺癌发生中的作用 ，其余几个新序列的全长基因及功能作用也有待深入研究。
, 百拇医药
本课题受国家自然科学基金资助(项目号：39600124)
本课题受中国博士后科学基金资助
参考文献
1 Whittemore AS,McMillan A.Lung cancer mortality among US uranium miner s in relation to radiation exposure,hard rock mining and cigarette smoking,1950 t hrough September,1967.Health Phys,1983,16:571-578.
2 UNSCEAR. Sources and effects of ionizing radiation.United Nations Scientific Committee on the Effects of Atomic Radiation, 1993 Report to general ass embly,with scientific annexes,New York:United Nations,1993.
, http://www.100md.com
3 吴德昌.氡及子体生物危害的研究.辐射防护，1996，16：321-329.
4 勒芳，程书钧，牟巨伟，等.生长因子对人支气管上皮细胞和肺癌细胞生长的影响.癌 变.畸变.突变，1992，4(3)：7-10.
5 Liang P,Pardee AB.Differential display of eukaryotic messenger RNA by means o f the polymerase chain reaction.Science,1992,257:967-969.
6 Salesiotis AN,Wang CK,Wang CD,et al.Identification of novel genes from stomac h cancer cell lines by differential display.Cancer Lett,1995,91:47-54.
(收稿:1998-02-24 修回：1998-07-14), http://www.100md.com
单位：周晓、吴德昌、胡迎春、李刚 北京放射医学研究所 100850；书钧、舒为群 中国医学科学院 肿瘤研究所病因室
关键词：α照射；人支气管上皮细胞；mRNA差异显示；转化；相关
α粒子诱导人支气管上皮细胞转化相关 基因的分离与克隆 【摘要】 目的 探索α粒子照射诱导人支气管上皮细胞 转化的相关基因，并加以克隆。方法采用了mRNA差异显示技术，通过辐 射诱发转化细胞与同代未经照射细胞的对比，找出差异cDNA片段。结果 克隆出2gs3,5gs1,5gs2,2gd1,6gd1 5个差异片段，测序，经文献检索发现除5gs1外均为新序 列 ，已登录到EMBL库中。结论 发现了细胞转化早期的新序列的4个cDNA片段 ，生物学特性与功能有待研究。
基因
, http://www.100md.com
Isolation and cloning of genes related to the transformation o f immortalized human bronchial epithelial cell line induced by alpha-particle radiation.
ZHOU Xiao, WU Dechang, CHENG Shujun, et al. Department of Mo lecular Toxicology,Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850， China.
【Abstract】 Objective To find out the genes related to transforma tion of human bronchial epithelial cell line and to clone them. Methods The mRNA differential display method was used. Results Different ial cDNA fragments were found.After sequencing and identification in GenBank,4 f ragments were found to be novel ones and were registered in EMBL database. Conclusion Four novel cDNA fragments have been found,but their biological characterictics and functions are still to be elucidated.
, 百拇医药
【Key words】 α-Radiation Human bronchial epithelial immortali zed cell line mRNA differential display Genes related to cell transformati on
流行病学研究表明，接触高水平氡及其子体的铀矿工人肺癌发病率增高 [1]。在人类所受的天然辐射中，50%以上来源于氡及其子体[2]。因此研究 α 粒子照射诱导人支气管上皮细胞转化过程中相关基因的变化，对阐明氡及其子体辐射诱导肺 癌发生的分子机制具有重要意义[3]。本研究以经α粒子照射诱导转化的细胞与相 应的对照细胞为对比材料，采用mRNA差异显示(mRNA-DD)技术对转化早期差异表达的cDNA序 列进行了分离与克隆。
材料和方法
, http://www.100md.com
1.材料：总RNA提取试剂盒，pGEM-T载体系统，Taq DNA聚合酶均为Promega公司产品；mRN A-DD引物购自GeneHunter公司，鉴定差异显示片段的特异引物由Cybereyn公司合成。质粒 提取试剂盒为QIAGEN公司产品，α-[32P]-dCTP购于北京辉瑞公司，X射线胶片为 Koda公司产品。
2.细胞系：采用中国医学科学院肿瘤研究所病因室建立的永生化人支气管上皮细胞M(HBEM) 细胞系[4]，在无血清培养液中培养，体外连续传22代。
3.照射条件：采用238PuO2 粒子电镀盘源(5.34 MeV)，照射用培养皿 底部为2.5μm Hostaphan膜，将细胞接种到膜上，待贴壁后放在源上进行照射，估算平均剂量率为1.26 Gy.min-1。细胞核吸收剂量为1.5 Gy。
, 百拇医药
4.引物：mRNA-DD引物。3′端锚定引物:HT11G:5′-AAGCTTTTTTTTT TT G-3′。5′端任意引物:HAP1:5′-AAGCTTGATTGCC-3′；HAP2：5′ -AAGCTTCGACTGT-3′;HAP3:5′-AAGCTTTGGTCAG-3′;HAP4:5′-AAGCTTCTCAACG-3′;H AP5:5′-AAGCTTAGTAGGC-3′;HAP6:5′-AAGCTTGCACCAT-3′;HAP7:5′-AAGCTTAACGAGG -3′;HAP8:5′-AAGCTTTTACCGC-3′。鉴定差异显示片段的特异引物：HBE6GD1:5′-AAA ATTGGTTCAGAACGAGCA-3′。
5.细胞总RNA提取：按Promega公司的试剂盒说明，分别提取两组细胞的总RNA。
6.mRNA差异显示
(1)逆转录PCR：分别以对照组与实验组细胞总RNA为模板进行反转录PCR。在0.5 ml离心管 中依次加入下列成分：dH2O 9.4 μl, 5×RT缓冲液4.0 μl, dNTP(250 μmol/L) 1.6 μl，总RNA(DNA-free) 2.0 μl(0.1 μg/μl), H-T11G(2 μmol/L) 2.0 μl; 于PE -480 PCR仪上按下列条件进行PCR反应：65℃，5分钟→37℃，10分钟，加1 μl MMLV,37℃ ，50分钟→72℃，5分钟→4℃。
, 百拇医药
(2)PCR扩增：依次向0.5 ml PCR管中加入下列成分：dH2O 9.8 μl,10×PCR缓冲液2. 0 μl,MgCl2 1.2 μl,dNTP(25 μmol/L) 1.6 μl,HAP引物(2 μmol/L) 2.0 μl, H-T11 G(2 μmol/L) 2.0 μl,RT-mix 2.0 μl,α-[32P]dCTP 0.4 μl,Ampli Taq 0.2 μl;PCR反应条件：94℃，30秒→40℃，2分钟→72℃，30秒循环40 次→72 ℃，5分钟→4℃。
(3)变性梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)与放射自显影：每3.5 μl PCR产物与2 μl加样缓 冲液混合，80℃变性2分钟，冰上冷却后在6%变性梯度聚丙烯酰胺凝胶上以1 650 V，60W恒 功率电泳3.5小时，-70℃曝光12～14小时，暗室中冲洗胶片。
(4)差异DNA片段的回收、再扩增与克隆：从凝胶上回收在对照组与实验组之间有明显表达 差 异cDNA条带，溶于100 μl dH2O中10分钟，沸水中煮15分钟；离心收集上清，向其中加入 10 μl 3 mol/L乙酸钠，5 μl糖原(10 mg/ml)，450 μl 乙醇体积分数为100%，-80℃过夜，4℃离心 ，并用乙醇体积分数为85%洗一次，溶于10 μl dH2O中。取4 μl为模板，按照前面PCR扩增条件，再 次扩增。参照试剂盒的说明将PCR产物与pGEM-T载体连接，转化JM109菌株，经蓝白系统筛 选，挑取阳性菌落，提取质粒，经PstⅠ, SacⅡ双酶切鉴定重组子。
, http://www.100md.com
7.序列分析及同源性比较：采用末端终止法经373A型Applied Biosystems对cDNA片段进行 测序。通过因特网将差异cDNA的核苷酸序列与Gene Bank核酸数据库的已知序列进行 类似性比较，并将未知的差异cDNA序列在EMBL数据库中登录。
8.逆转录PCR鉴定差异片段的表达：采用合成的3′端特异引物及相应的5′端引物，以第6 项的逆转录产物进行PCR反应，经1.5%琼脂糖凝胶电泳，鉴定其在实验组与对照组的表达情 况。
9.差异片段在不同cDNA文库中的表达：以cDNA原液为模板，采用合成的3′端特异引物及相 应的5′端引物进行PCR反应，经1.5%琼脂糖凝胶电泳，鉴定其在不同文库中的表达情况。
结 果
1.总RNA的鉴定：经紫外分光光度计测定260、280 nm处的吸收值，其A260/A280均大于1 .7，表明纯度较高。经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，28 s、18 s条带清晰，表明无降解。
, http://www.100md.com
2.RNA差异显示结果：从变性PAGE电泳凝胶上共找出20条差异表达的条带，回收并进行PC R再次扩增有13条带有扩增产物。
3.PCR产物的克隆与序列分析：选择在对照组表达，实验组不表达的6gd1,2gd2,与在实验 组表达，对照组不表达的5gs1,5gs2,2gs3等5条相对长的带进一步克隆测序。经序列分析 ，得到如下部分cDNA核苷酸序列：
6gd1 5′ 1 gtcttccagg agactagact actgttgtcc agggtcaatt tgagt gtaaa gaaaatgtag
61 acaaggaatt gcccaatttt aaattctgac tttgctact taatttaaat gctcgttct g
121 aaccaatttt ttcctatctt ctctaggggt ttcaaaagac tcagttaatt gattttc cagg
, http://www.100md.com
181 aagtactcat agcaagttcc ataaaatgtt cttgagacct aaattttctt ca
3′
2gd2 5′ 1 ttcgaatctg acaccccccgt aactcctttc ctgagactac tgtgtcc tcg gtctacattt
61 atcctttctt ttgacgtcgg gacaagtagg tctactagga ttattatgtc gaggtttt t
121 tttttcgaat
3′
5gs1 5′ 1 atttaataaa gttttatttt tccaaatgta cagctggttg gacctatt ca tgcatcttca
, http://www.100md.com
61 ccagcagctg gagcatctcc acccttggta tttctggtgt aaattacttg agctctg tgc
121 tttgaaacca gtttgataag tcctgtacta aggagctcct gaagggctgc cctggg cagg
181 gagcctcgaa tctttcaggc tctcagagac cacagctggg ggtataaggt ttatag gtgg
241 ggaaccttcc tgtacagagt tttatcaata ggntaggctt gtgtcaaaca aagacta agg
301 ttatttgngc cttgtnccng aacntttggc ctttggganc cantttttnc nttttt ttng
, http://www.100md.com
3′
5gs2 5′ 1 attcgaatca tccgtccttg acttggaact tggacgtgat atacggaa ag agtgtctagt
61 tatagacata agaataacct tagagntata aggagctcta atttaaaccn ggttcgta ct
121 atcagatagg ggtnngggnt ttcgaat
3′
2gs3 5′ 1 attcgaaaaa aaaaaaccac ccccctatta cttgttttac aaagggaa at atggaaaaga
61 tcatactatg taaaagatca taaatgtcaa aatgaaaatc tctcaatgga aaacttcg ta
, 百拇医药
121 tgaatcaatg acaatttgat aagacaaggg catcaaccta cttcgattat tttttcg tcc
181 gataaaaata attggcggtc taaagtgttg tcagcttcga at
3′
6gd1在对照组中高表达，在实验组中不表达；并且它在人胎盘cDNA文库中高表达，在人脑、 肝脏cDNA文库中不表达。
4.同源性分析与数据库登录：将以上序列与GeneBank核酸数据库中的已知序列进行类似性 比较，没有发现与6gd1,2gd2,5gs2,2gs3相似的已知序列，认为是新序列，将其登录到Ge neBank数据库中。6gd1,2gs3,5gs2的登录号依次为Y13659、AF023162、AF063163。5gs1与人核糖体蛋白S25(HUMRPS25)的部分序列有98%的相似性。
, 百拇医药
讨 论
寻找细胞转化相关基因，进而阐明肿瘤发生的分子机理，对肿瘤的预防、治疗、预后判断具 有重要意义。在确认、比较mRNA差异表达研究方面，应用了Liang于1992年建立的mRNA-DD 技 术，它是一种分离差异表达基因的全新方法[5，6]。该方法使用不同的引物组合 ，可从一对细胞群体各自产生的约15 000种mRNA中，有效地鉴别并克隆差异表达的基因。同 消减杂交法相比，该法具有简便、灵敏、高效率、省时间等优势。
研究选择经1.5 Gyα粒子单次照射，在体外连续传代22周的转化细胞和相应的对照细胞为 对比材料。此转化细胞已获得锚着独立生长能力，并在去上皮大鼠气管裸鼠体内种植的体内 -体外模型中能够长出鳞状化生上皮，说明其表型已发生了改变。对比细胞是与其来源于同 一群体、在体外平行传代、而没有这些表型改变的对照组细胞。因为这一对细胞具有相同的 遗传背景，它们的差异只是由于α粒子照射造成的，所以是研究转化相关基因的较为理想 材料。
, http://www.100md.com
选择锚定引物HT11G和8种任意引物组合，对两个细胞系的mRNA进行了差异显示，从变性PA GE 凝胶上共找出20条差异表达的条带，有13条带被PCR再次扩增出来。选择相对较长的5个片段 进行重组克隆，序列分析资料表明，6gd1、2gd2,5gs2,2gs3是新序列，已将其登录到Gene Bank中。5gs1同人核糖体蛋白S25 mRNA的序列有98%的同源性。6gd1,2gd2在对照组细胞中 表达，在转化组缺失，可能是新抑癌基因的候选基因片段；而5gs2、2gs3在实验组表达， 对照组缺失，可能是候选癌基因的部分片段。
本研究发现5gs1与人核糖体蛋白S25的部分序列有98%的同源性，且在1.5 Gy α粒子诱导的 转化细胞中高表达，而该细胞对血清的促分化抗性增强。对于其表达在上皮细胞转化中的作 用还有待深入研究。
分别检测了6gd1在人脑、胎盘、肝脏cDNA文库中的表达情况，结果表明它只在胎盘cDNA文库 中高表达。提示可从人胎盘cDNA文库中钓取其全长基因，以深入研究其在肺癌发生中的作用 ，其余几个新序列的全长基因及功能作用也有待深入研究。
, 百拇医药
本课题受国家自然科学基金资助(项目号：39600124)
本课题受中国博士后科学基金资助
参考文献
1 Whittemore AS,McMillan A.Lung cancer mortality among US uranium miner s in relation to radiation exposure,hard rock mining and cigarette smoking,1950 t hrough September,1967.Health Phys,1983,16:571-578.
2 UNSCEAR. Sources and effects of ionizing radiation.United Nations Scientific Committee on the Effects of Atomic Radiation, 1993 Report to general ass embly,with scientific annexes,New York:United Nations,1993.
, http://www.100md.com
3 吴德昌.氡及子体生物危害的研究.辐射防护，1996，16：321-329.
4 勒芳，程书钧，牟巨伟，等.生长因子对人支气管上皮细胞和肺癌细胞生长的影响.癌 变.畸变.突变，1992，4(3)：7-10.
5 Liang P,Pardee AB.Differential display of eukaryotic messenger RNA by means o f the polymerase chain reaction.Science,1992,257:967-969.
6 Salesiotis AN,Wang CK,Wang CD,et al.Identification of novel genes from stomac h cancer cell lines by differential display.Cancer Lett,1995,91:47-54.
(收稿:1998-02-24 修回：1998-07-14), http://www.100md.com